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Introducción
Acinetobacter baumannii es un cocobacilo gramnegativo oportunista asociado a los brotes en las unidades de cuidados intensivos (UCI)1. Esta especie está relacionada con neumonías asociadas a ventilador, bacteriemia, infecciones de sitio quirúrgico y de vías urinarias, siendo las dos primeras las más importantes debido a su alta morbilidad y mortalidad asociada1,2.
La resistencia antibiótica en las infecciones nosocomiales de A. baumannii es una amenaza de salud mundial2,3, y es por esta razón que esta especie está en la lista de patógenos resistentes a los antibióticos con una prioridad mundial para la investigación y el desarrollo de nuevos y efectivos tratamientos antibióticos4.
Uno de los factores de virulencia más importantes de A. baumannii es la producción de biopelículas, las cuales protegen al microrganismo del sistema inmunitario del huésped y del tratamiento con antibióticos5,6.
La azitromicina (AZM) es un antibiótico macrólido que inhibe la síntesis de proteínas bacterianas y está indicado en infecciones respiratorias, urogenitales, dérmicas y otras infecciones bacterianas causadas principalmente por especies de bacterias grampositivas7. En las especies gramnegativas se ha demostrado que este antibiótico disminuye la producción de biopelículas, por ejemplo en Pseudomonas aeruginosa8, Stenotrophomonas maltophilia9, Porphyromonas gingivalis10 y Haemophilus influenzae.
De acuerdo con la literatura, el efecto de la AZM en las células del biopelículas de A. baumannii no ha sido evaluado en detalle. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la AZM en la formación de biopelículas en los aislamientos clínicos de A. baumannii.
Materiales y métodos
Aislamiento de sitios y clínicas
El estudio se llevó a cabo en el Hospital Universitario Dr. José Eleuterio González, un hospital de atención terciaria en Monterrey, México. De enero a diciembre de 2012 se recuperaron un total de 149 aislamientos clínicos de A. baumannii de pacientes de la UCI. Solo se incluyó un aislamiento por paciente. Los aislamientos de A. baumannii se identificaron mediante la espectrometría de masas MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Bremen) y mediante la amplificación del gen espaciador intergénico por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)11. Todos los aislamientos fueron almacenados hasta su uso a –70 °C en caldo Brucella con un 15% de glicerol.
Caracterización y selección de los aislados
SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA
La prueba de susceptibilidad a antibióticos se determinó utilizando el método de microdilución del caldo. Entre los antibióticos examinados se encuentran: amikacina, cefepima, ceftazidima, ciprofloxacino, gentamicina, imipenem, levofloxacino, meropenem y tobramicina (Sigma-Aldrich, Toluca, México). Los resultados se interpretaron de acuerdo con los criterios del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) (2018)12.
La resistencia a múltiples fármacos (MDR) se definió como la resistencia a por lo menos tres clases diferentes de antibióticos13. Solo se seleccionaron aislamientos de MDR en los siguientes ensayos.
CARACTERIZACIÓN DE LOS GENES DE LA CARBAPENEMASA
El ADN de la plantilla se preparó por lisis térmica a 95 °C durante 10 min. Los genes de la carbapenemasa que codifican las metalo-b-lactamasas, blaVIM, blaIMP, y blaNDM, y la carbapenemasa de clase D tipo bla OXA-48 (OXA-23, OXA-24, OXA-51, y OXA-58)14 fueron tipificados como se informó anteriormente15-18. En el caso de los genes positivos, los productos de PCR fueron purificados, secuenciados por el método de terminación de cadena con el kit Big-Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA), y analizados en un analizador genético ABIPRrism 3100 (Applied Biosystems).
CARACTERIZACIÓN DE LA DIVERSIDAD CLONAL
Los aislamientos de A. baumannii fueron tipificados por electroforesis en el gel de campos pulsados (PFGE)19,20. Las muestras de ADN de las cepas fueron digeridas con 10 U de Smal (Takara Bio Inc., Shiga, Japón). El PFGE se realizó con un instrumento CHEF-DRIII (BioRad Laboratories, Hercules, CA), y los patrones de banda fueron interpretados usando el método descrito por Seifert, et al.17. Aislamientos con patrones de restricción de banda 100% similares fueron clasificados como pertenecientes al mismo clon.
PRODUCCIÓN DE BIOPELÍCULA
La producción semicuantitativa de biopelículas se realizó mediante el método de tinción de cristal violeta, como se ha descrito anteriormente21. Para el análisis cuantitativo se determinó el índice de biopelícula (IB) para compensar las diferencias en la tasa de crecimiento19. Todos los aislamientos fueron probados en cuadruplicados en dos experimentos independientes. Se utilizaron como organismos de control Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305 (productor de biopelícula) y el Staphylococcus hominis ATCC 27844 (no productor de biopelícula). Los cortes propuestos por Christensen, et al. se usaron para clasificar los aislamientos. Solo los aislamientos fuertemente productores de biopelícula (OD ≥ 0.24) fueron seleccionados en los siguientes ensayos.
CONCENTRACIONES MÍNIMAS SUBINHIBITORIAS DE AZM
Se determinaron las concentraciones mínimas inhibitorias (MIC) de AZM (Sigma-Aldrich, Toluca, México) para ocho aislados de A. baumannii seleccionados al azar. Posteriormente, se prepararon diluciones dobles de 0.125 a 8.8 mg/ml y se utilizó un cultivo de 24 h como inóculo. Después de la incubación a 37 °C, se midió la densidad óptica a 600 nm (OD 600). Las concentraciones mínimas subinhibitorias (sub-MIC) de AZM se definieron como la concentración en la que se observó un crecimiento inhibido.
EFECTO DE LAS SUBCAPITALIZACIONES DE AZM EN LA PRODUCCIÓN Y COMPOSICIÓN DE BIOPELÍCULAS
Para el análisis del impacto de la sub-MIC de la AZM en la producción de biopelículas, cada biopelícula madura se cultivó en caldo de soya tríptico suplementado con un 1% de glucosa sin AZM y con una sub-MIC de AZM durante 24 h. El IB se determinó como se describe19. Para el análisis de la sub-MIC de AZM sobre la composición de la biopelícula, se realizaron ensayos de desprendimiento utilizando meta-periodato de sodio (NaIO4) para degradar b-1, polisacáridos de 6 enlaces, proteinasa K para degradar proteínas, y DNasa I para degradar el DNA como se ha descrito anteriormente22. El porcentaje de separación se calculó por la diferencia media entre los pozos tratados y los no tratados. Los ensayos se realizaron sin AZM y con una sub-MIC de AZM.
ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
Los datos se analizaron con el programa estadístico SPSS version 20.0 (IBM Corporation, Somers, NY). Los coeficientes de similitud de los patrones de banda del PFGE se generaron a partir de una matriz de similitud calculada con el coeficiente de Jaccard. Se utilizó un análisis descriptivo para las variables cuantitativas, y las variables cualitativas se expresaron como proporciones. La prueba t de Student se utilizó para comparar las muestras emparejadas (índice de biopelícula y porcentaje de desprendimiento de biopelícula). El valor p < 0.05 se consideró estadísticamente significativo.
Declaración de ética
Este estudio se realizó con la aprobación del Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Nuevo León (aprobación n.o PII5-0243). Debido a que la información de los pacientes fue anónima, solo se analizaron los datos microbiológicos. Por lo tanto, el comité de ética local no exigía el consentimiento informado.
Resultados
Aislamientos clínicos, producción de biopelículas y susceptibilidad antimicrobiana
De un total de 149 cepas de A. baumannii recogidas en la UCI, 140 (97%) resultaron ser fuertes productoras de biopelículas y las 9 restantes (3%) fueron productoras débiles.
Todos los aislados fueron resistentes a ciprofloxacino, gentamicina y ceftazidima y el 99% resistentes a tobramicina y levofloxacino. De todos los aislamientos, el 93.8% fueron resistentes a los carbapenémicos (meropenem e imipenem), y casi el 70% resultaron resistentes a cefepima con el 22.9%.
Seleccionamos 96 aislamientos clínicos de A. baumannii MDR productor de biopelícula para su posterior análisis; el 80% se obtuvo de muestras respiratorias y un 12.5% de hemocultivos, mientras que el resto se obtuvo de otros especímenes.
Caracterización de los genes de la carbapenemasa y la diversidad clonal
Los 96 A. baumannii seleccionados resultaron positivos para el gen de la carbapenemasa de tipo OXA, siendo OXA-51 y OXA-24 los más frecuentes con un 100% y un 96%, respectivamente; ninguno de los aislamientos codificados para los genes de la blaVIM, blaIMP, y blaNDM.
Se detectaron doce patrones de PFGE (A-M) con 51 (53%) identificadas como clon A, 15 (15%) como clon B y 9 (9%) como clon C.
El efecto de la azitromicina en la producción y composición de la biopelícula
La sub-MIC seleccionada fue de 0.125 125 mg/ml. Cuando se evaluaron los 96 aislamientos, la media de IB sin AZM fue de 1.737, y cuando se expuso a la sub-MIC de AZM, el IB fue de 1.488.
Cuando comparamos el IB sin AZM y en la sub-MIC de AZM, la distribución del IB fue heterogénea, con un 53.1% que reveló una disminución en el IB (p < 0.0001), un 34.7% que demostró un aumento en el IB (p < 0.0001), y un 12.5% que no mostró ninguna diferencia (Fig. 1).
La biopelícula en ausencia de AZM estaba compuesta principalmente de proteínas y DNA (desprendimiento con la proteinasa K, 88% y la DNasa I, 87%), y de carbohidratos (desprendimiento con el meta-periodato, 30%).
La biopelícula en la sub-MIC de AZM mostró resultados similares (desprendimiento con la proteinasa K, 79%; DNasa I, 77%; y meta-periodato, 25%). La proporción de proteínas en el ADN era menor en la biopelícula con la sub-MIC de AZM que en la biopelícula sin AZM (p < 0.05) (Fig. 2).
Discusión
Uno de los factores de virulencia más importantes de A. baumannii es la producción de biopelícula, y se ha demostrado que la AZM inhibe la formación de biopelícula en varias especies bacterianas. Por lo tanto, evaluamos el efecto de la AZM en los aislamientos clínicos de A. baumannii MDR y encontramos que cuando se expone a la sub-MIC de la AZM, la producción de biopelículas disminuye con la reducción de la proporción de proteínas en el ADN. Se ha informado que la AZM disminuye significativamente la producción de biopelícula cuando se utilizan cepas de A. baumannii de biopelícula leve y moderada y una subcapa de 1 mg/ml23. En este estudio, definimos 0.125 mg/ml como sub-MIC de AZM, y solo se incluyeron cepas fuertemente productoras de biopelícula. El diferencia observada en los valores para el AZM sub-MIC puede deberse a las diferencias en las cepas clínicas utilizadas para este estudio, especialmente por las diferentes producciones de biopelículas. La exposición de las bacterias a la sub-MIC de los antibióticos en condiciones clínicas es muy probable. Algunos ejemplos son: a) por la interacción de los medicamentos, b) por deficiencias en la absorción o c) inmediatamente antes de las siguientes dosis. Por esta razón, es importante señalar que la concentración de 0.125 mg/ml utilizada en nuestros ensayos está por debajo del nivel sérico máximo de AZM cuando se utiliza en dosis intravenosas estándar (nivel sérico máximo de 3.6 mg/ml; una dosis de 500 mg IV q24h)24; por lo tanto, esta concentración puede tener un efecto in vivo.
De acuerdo con el CLSI, una concentración sub-MIC es la concentración de un agente antimicrobiano que no es activa en el crecimiento bacteriano pero que sigue siendo activa en la alteración de la bioquímica y la forma de las bacterias in vitro e in vivo, reduciendo así la virulencia bacteriana. Aunque estas concentraciones sub-MIC no matan a las bacterias, son capaces de modificar sus características y, según nuestros resultados, la composición de la biopelícula está alterada, con una proporción menor de proteínas. Esto puede tener un impacto en importantes funciones celulares bacterianas o en la virulencia.
La biopelícula sin AZM está compuesta principalmente por proteínas y ADN, y la biopelícula con la submicroma de AZM mostró una proporción menor de proteínas, lo que puede reflejar la acción de la AZM sobre la síntesis de proteínas. Cabe mencionar que las cepas siguieron siendo fuertes productoras de biopelícula incluso cuando se expusieron a la sub-MIC de la AZM.
En nuestra institución se ha informado de la distribución clonal de A. baumannii a lo largo de seis años y, según este estudio, existe una alta clonalidad en esta población25.
Para este estudio, la mitad de los aislamientos de A. baumannii se agruparon en un clon predominante (A), y los aislamientos restantes se clasificaron en 11 patrones diferentes. Así, la muestra analizada es heterogénea y no corresponde al estudio de un clon aislado.
Las carbapenemasas del tipo OXA investigadas en nuestro estudio son las enzimas más prevalentes asociadas con la resistencia a carbapenémicos en A. baumannii. Aunque el OXA-23 está distribuido por todo el mundo, ninguna de nuestras cepas dio positiva para este gen26; en cambio, casi todos los aislados revelaron ser OXA-24. Este genotipo se ha descrito en brotes que causaron bacteriemias en los que las cepas permanecieron susceptibles solo a colistina y tigeciclina27 y se ha informado anteriormente en nuestra institución25. La actividad de la AZM sobre la producción y composición de biopelículas puede tener un efecto profundo que ofrezca nuevas alternativas terapéuticas especialmente para estas cepas MDR; para ello, los estudios de sinergia con la AZM y los antibióticos recomendados para el tratamiento de las infecciones por A. baumannii, incluidas las quinolonas y los carbapenémicos, pueden ofrecer nuevas alternativas terapéuticas.
En conclusión, una sub-MIC de AZM puede reducir la producción de biopelículas en los aislados MDR de A. baumannii con una disminución de las proteínas y el ADN en la biopelícula. Nuestros resultados son la base de estudios de sinergia que pueden ofrecer nuevas alternativas terapéuticas.
