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Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres con mayor prevalencia en el mundo, su incidencia y mortalidad varían marcadamente entre los países1. En población mexicana, el CCR es la tercera causa más común de mortalidad2. La carcinogénesis en CCR es un proceso complejo donde células normales sufren diferentes alteraciones genéticas y epigenéticas, transformándose en células malignas3. En este proceso, las metaloproteinasas (MMP) participan en la remodelación y degradación de proteínas de la matriz extracelular (MEC) y por ello están involucradas en la progresión e invasión tumoral al catalizar la proliferación, migración y diferenciación celular4,5. Los genes de las metaloproteasas se encuentran localizados muy próximos, entre chr11:102530930 -102955810 (GRCh38.p13). Variantes en el promotor de los genes de MMP han sido asociadas con CCR6-8. MMP7 rs11568818 (-181A>G), MMP8 rs11225395 (-799C>T), MMP12 rs2276109 (-82A>G), y MMP13 rs2252070 (-77A>G) han sido implicados en varios tipos de cáncer. Por lo que el propósito del presente estudio fue inferir haplotipos entre estas variantes y su posible asociación con CCR en pacientes mexicanos.
Material y métodos
Sujetos
En este estudio se incluyeron 104 pacientes con diagnóstico histopatológico de adenocarcinoma colorrectal que no hubieran recibido tratamiento con radioterapia ni quimioterapia. El grupo de referencia estuvo formado por 112 donadores de sangre periférica sanos. Todas las muestras fueron captadas entre diciembre de 2008 y diciembre de 2013, así como también se obtuvo un consentimiento informado de los participantes del Hospital Civil de Guadalajara Dr. Juan I. Menchaca. Fueron aplicados cuestionarios para evaluar el estilo de vida de los pacientes, además de que se revisaron los expedientes médicos para obtener las características clínico-patológicas. El estudio cumple los criterios de la Declaración de Helsinki, y los comités de ética e investigación del Centro Universitario de Ciencias de la Salud de la Universidad de Guadalajara y del Hospital Civil Dr. Juan I. Menchaca de Guadalajara, Jal., México, aprobaron el estudio (número de registro CI - 14409 y 935/09, respectivamente).
Genotipificación
El DNA fue extraído a partir de muestras de sangre periférica tanto de pacientes como de individuos del grupo de población general, usando una modificación del método CTAB-DTAB9. Las variantes fueron genotipificadas por reacción en cadena de la polimerasa con análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP). Las condiciones de genotipificación y digestión para rs11568818 (MMP7) y rs2252070 (MMP13) fueron descritas por nuestro grupo de trabajo10. Se diseñaron los siguientes iniciadores para identificar la variante rs11225395 (MMP8): 5¢-AGCTGCTGCTCCACTATG-3¢ y 5'-TCTGGAGG ATGTGGTTTG-3'. Para identificar rs2276109 (MMP12) fueron usados iniciadores reportados previamente11. Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 ml conteniendo 100 ng de DNA. La PCR para rs11225395 (MMP8) consistió en 26 ciclos y la desnaturalización se realizó a una temperatura de 94 °C, la alineación a 63.1 °C y la elongación a 72 °C por 30 s. Condiciones similares de PCR fueron usadas para la variante rs2276109 (MMP12), con la excepción de que la alineación fue hecha a 55 °C por 40 ciclos. Los productos de PCR fueron sometidos a digestión con las enzimas SfcI y HpyCH4II para rs11225395 (MMP8) y rs2276109 (MMP12), respectivamente. Se usaron cuatro unidades de la enzima y 10 ml del producto de PCR. Los fragmentos observados para rs11225395 (MMP8) correspondieron a 399 pb para el alelo silvestre (C) y 336 pb y 62 pb para el alelo polimórfico T. Para rs2276109 (MMP12), los fragmentos observados fueron 163 pb y 22 pb para el alelo silvestre (A) y 101 pb, 62 bp, y 22 pb para el alelo polimórfico (G). Como control de calidad de la genotipificación, esta fue repetida aleatoriamente en el 20% de las muestras. Para el control positivo de la digestión, las enzimas de restricción fueron usadas con el vector bacteriófago Lambda. Los fragmentos fueron visualizados en geles de poliacrilamida al 6% teñidos con nitrato de plata.
Análisis estadístico
Las frecuencias alélicas y genotípicas fueron estimadas por conteo directo. Se determinó el equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW) usando chi cuadrada. Para medir la asociación entre las variantes y el CCR, fueron calculados las odds ratios (OR) y un intervalo de confianza del 95% (IC 95%). Se utilizó el software Arlequin v3.512 para realizar el análisis haplotípico y el desequilibrio de ligamiento (DL) fue medido usando los coeficientes r2 y D'. Valores de r2 > 0.33 indicaron un fuerte DL, y D' = 1 indicó completo DL13,14. Para todos los análisis estadísticos se consideró como significativo un valor de p < 0.05.
Resultados
Las características de los 104 pacientes con CCR se muestran en la tabla 1. En estos pacientes, la localización del tumor fue principalmente en el colon (55%). El grupo de referencia estuvo caracterizado por individuos mayores de 18 años, de los cuales el 58% fueron varones. La distribución de los alelos y los genotipos para las variantes rs11225395 (MMP8) y rs2276109 (MMP12) estuvieron en EHW (p > 0.05), y no fue encontrada asociación significativa. El análisis de SNV (single nucleotide variant), incluyendo los modelos genéticos se muestran en la tabla 2. Las frecuencias para rs11568818 (MMP7) y rs2252070 (MMP13) fueron descritas en trabajos previos10.
Tabla 1 Características de los pacientes con cáncer colorrectal (CCR)
| Características | Pacientes con CCR (n = 104) |
|---|---|
| Edad (años) | 59 ± 14 |
| Peso (kg) | 68 ± 15 |
| Altura (m) | 1.7 ± 10 |
| Sexo | |
| Masculino | 53% |
| Femenino | 47% |
| Presencia de DM2 | |
| Sí | 80% |
| No | 16% |
| ND | 4% |
| Sobrepeso y/o obesidad | |
| Sí | 24% |
| No | 52% |
| ND | 24% |
| Consumo de alcohol | |
| Sí | 58% |
| No | 34% |
| ND | 8% |
| Consumo de tabaco | |
| Sí | 57% |
| No | 39% |
| ND | 4% |
| Actividad física | |
| Sí | 54% |
| No | 34% |
| ND | 12% |
DM2: diabetes mellitus 2; ND: datos no disponibles.
Tabla 2 Comparación de las frecuencias genotípicas de las variantes rs11225395 y rs2276109 entre cáncer colorrectal (CCR) y el grupo de referencia (sano)
| Gen/variante | Genotipo/alelo | Grupo de referencia (sano) n (%) | Pacientes con CCR n (%) | p* | OR |
|---|---|---|---|---|---|
| n = 112 | n = 102 | ||||
| MMP8/rs11225395 | CC | 40 (36) | 32 (31) | 1.0 (referencia) | |
| CT | 53 (47) | 53 (52) | 0.46 | 1.25 (0.68-2.27) | |
| TT | 19 (17) | 17 (17) | 0.78 | 1.11 (0.50-2-49) | |
| C | 133 (59) | 117 (57) | 1.0 (referencia) | ||
| T | 91 (41) | 87 (43) | 0.67 | 1.08 (0.73-1.59) | |
| CT + TT | 93 (83) | 85 (83) | 1 (referencia) | ||
| CC | 19 (17) | 17 (17) | 0.95 | 0.97 (0.47-2.00) | |
| n = 102 | n = 104 | ||||
| MMP12/rs2276109 | AA | 89 (87) | 89 (86) | 1.0 (referencia) | |
| AG | 11 (11) | 14 (13) | 0.57 | 1.27 (0.54-2.95) | |
| GG | 2 (2) | 1 (1) | 0.57 | 0.50 (0.04-5.61) | |
| A | 189 (93) | 192 (92) | 1.0 (referencia) | ||
| G | 15 (7) | 16 (8) | 0.89 | 1.05 (0.50-2.18) | |
| AG + GG | 100 (98) | 103 (99) | 1 (referencia) | ||
| AA | 2 (2) | 1 (1) | 0.55 | 0.48 (0.04-5.43) |
*⊠2 o Fisher.
OR: odds ratio.
El análisis de DL fue realizado considerando los resultados de las frecuencias genotípicas reportadas por Moreno-Ortiz, et al. (2014) para rs11568818 (MMP7) y rs2252070 (MMP13). Las frecuencias genotípicas de las variantes rs11225395 (MMP8) y rs2276109 (MMP12) mostraron desequilibrio para rs2276109 (MMP12) y rs2252070 (MMP13) con D' = 1 para el grupo de referencia y D' = 0.74 para los pacientes, y están reportadas en la tabla 3.
Tabla 3 Desequilibrio de ligamiento entre las variantes analizadas
| Gen/variante | Grupo de referencia (sano) | Pacientes con CCR | ||
|---|---|---|---|---|
| D' | r2 | D' | r2 | |
| MMP7/rs11568818 | ||||
| MMP8/rs11225395 | 0.21 | 0.01 | 0.29 | 0.05 |
| MMP12/rs2276109 | 0.82 | 0.07 | 0.32 | 0.02 |
| MMP13/rs2252070 | 0.35 | 0.07 | 0.59 | 0.23 |
| MMP8/rs11225395 | ||||
| MMP12/rs2276109 | 0.74 | 0.02 | 0.84 | 0.34 |
| MMP13/rs2252070 | 0.51 | 0.10 | 0.27 | 0.03 |
| MMP12/rs2276109 | ||||
| MMP13/rs2252070 | 1.00 | 0.20 | 0.74 | 0.15 |
CCR: cáncer colorrectal.
La inferencia de haplotipos para todas las SNV llevó a la identificación de 11 haplotipos para el grupo de referencia y 12 para el grupo de pacientes con CCR. Sin embargo, únicamente son presentados en la tabla 4 aquellos con una frecuencia mayor al 10% en cada uno de los grupos. Los haplotipos rs11568818(A)-rs11225395(T)-rs2276109(A)-rs2252070(A) y rs115 68818(A)-rs11225395(C)-rs2276109(A)-rs2252070(G) mostraron un incremento del riesgo de CCR, y los haplotipos rs11568818(G)-rs11225395(C)-rs22761 09(A)-rs2252070(A) y rs11568818(A)-rs112253 95(T)-rs2276109(A)-rs2252070(G) fueron asociados con protección contra el CRC.
Tabla 4 Frecuencias haplotípicas y su asociación con CCR
| # | MMP7/rs11568818 | MMP8/rs11225395 | MMP12/rs2276109 | MMP13/rs2252070 | Grupo de referencia (sano) | Pacientes con CCR | OR (IC 95%) | p |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | A | C | A | A | 0.46 | 0.72 | 1.0 (referencia) | |
| 2 | A | T | A | A | 0.44 | 0.39 | 5.6 (2.4-12.8) | p = 0.00 |
| 3 | G | C | A | A | 0.36 | 0.10 | 0.2 (0.1-0.4) | p = 0.00 |
| 4 | A | C | A | G | 0.19 | 0.11 | 3.1 (1.2-7.9) | p = 0.01 |
| 5 | A | T | A | G | 0.18 | 0.90 | 0.3 (0.1-0.8) | p = 0.01 |
| 6 | G | T | A | G | 0.14 | 0.18 | 1.7 (0.6-5.2) | p = 0.30 |
| 7 | G | T | A | A | 0.09 | 0.19 | 0.6 (0.1-2.9) | p = 0.50 |
CCR: cáncer colorrectal; OR: odds ratio; IC 95%: intervalo de confianza del 95%.
Discusión
En diferentes tipos de cáncer, la expression y la activación de MMP son una marca importante en la progresión tumoral, incluyendo angiogénesis, invasión y metástasis. Niveles elevados de MMP están también relacionados con sobrevivencia5. Variantes específicas en los genes de MMP y sus haplotipos podrían tener un impacto en su proteína. En el presente estudio, las variantes rs2276109 (MMP12) y rs2252070 (MMP13) mostraron desequilibrio, esto debido principalmente a la distancia que hay entre ellas por su posición en el cromosoma. Mientras que la variante rs2276109 (MMP12) está localizada en chr11:102875061, la variante rs2252070 (MMP13) está localizada chr11:102955810; esto es, que entre ellas hay una distancia de 80,749 pb. En el cromosoma, son los genes más cercanos uno del otro en comparación con las otras MMP analizadas. El análisis de DL fue llevado a cabo para controles y pacientes con CCR independientemente para determinar el riesgo conferido por estos marcadores genéticos. La combinación de estas SNV estuvieron en perfecto DL (D' = 1), demostrando su fuerte asociación.
No ha habido estudios que hayan analizados haplotipos con las variantes presentadas en este estudio. El principal haplotipo identificado como un factor de riesgo para CCR fueron MMP7 rs11568818(A)-MMP8 rs11225395(T)-MMP12 rs2276109(A)-MMP13 rs22520 70(A) (OR: 5.6; IC 95%: 2.4-12.8; p = 0.001) y MMP7 rs11568818(A)–MMP8 rs11225395(C)–MMP12 rs2276 109(A)–MMP13 rs2252070(G) (OR: 3.1; IC 95%: 1.2-7.9; p = 0.001). En estos haplotipos, los alelos que los conforman han sido asociados con incremento o reducción del riesgo e incluso protección contra diferentes tipos de cáncer como CCR10,15, cáncer de hígado15,16, cáncer de mama, cáncer de pulmón, carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma esofageal y cáncer gástrico15. Específicamente, el genotipo homocigoto AA y el heterocigoto AG para MMP7 (rs11568818) fueron asociados con riesgo para CCR. Por el contrario, los individuos con genotipos AA de MMP13 (rs2252070) presentaron tres veces más riesgo de desarrollar CCR10. Para la variante localizada en MMP13, esta se encuentra en una secuencia consenso para el factor de transcripción PEA3, donde la presencia del alelo A incrementa doblemente la actividad del promotor17. Esta variante está asociada con un riesgo altamente agresivo de cáncer oral y el alelo A parece ser un factor pronóstico para la progresión tumoral18. Respecto a MMP12 (rs2276109), el alelo A ha sido encontrado asociado a una elevada actividad del promotor8,15, desde que esta variante está localizada en el sitio de unión para factor de transcripción AP1, demostrándose una mayor afininidad8,19. Para la variante MMP8 (rs11225395), el alelo T fue asociado con el incremento de riesgo de cáncer de hígado en una población americana16.
Los haplotipos MMP7 rs11568818(G)–MMP8 rs11225395(C)–MMP12 rs2276109(A)–MMP13 rs2252070(A) (OR: 0.2; IC 95%: 0.1-0.4; p = 0.01) y MMP7 rs11568818(A)–MMP8 rs11225395(T)–MMP12 rs2276109(A)–MMP13 rs2252070(G) (OR: 0.3; IC 95%: 0.1-0.8; p = 0.01) parecen ser factores protectores contra el CCR. Algunos de los alelos que conforman estos haplotipos, además de ser asociados con un riesgo también han sido identificados por tener efectos protectores contra el CCR. El alelo T de la variante rs11225395 (MMP8) ha sido relacionado con baja susceptibilidad para desarrollar metástasis y además ha indicado un mejor pronóstico de superviviencia en pacientes con cáncer de mama. De igual manera, en cáncer oral, varios reportes han mostrado una baja susceptibilidad para cáncer oral20. Adicionalmente, no ha habido relaciones significativas en niños con leucemia en población taiwanesa21.
En este sentido, no ha habido predominio de algún alelo específico. Sin embargo, es interesante mencionar que en la variante rs11225395 (MMP8) el alelo T ha sido asociado con protección en diferentes tipos de cáncer20,21. En este estudio, la comparación de rs11225395 (MMP8) entre el grupo de referencia y el grupo de pacientes con CCR no mostró diferencias significativas (p > 0.05). Sin embargo, este reporte representa el primer estudio de asociación de la variante rs11225395 con CCR en población mexicana. Respecto a rs2276109 (MMP12), es importante mencionar que el alelo G tiene las frecuencias más bajas comparadas con las otras variantes analizadas (MAF = 0.05 1000 Genome Project) y que la ausencia del alelo G podría posiblemente jugar un rol en la disminución del riesgo de CCR.
Es importante mencionar que en el haplotipo MMP7 rs11568818(A)-MMP8 rs11225395(T)-MMP12 rs2276109(A)-MMP13 rs2252070(A), comparado con otro analizado: MMP7-181A-MMP1–1607dupG-MMP3-1171A-MMP12-82A, el alelo A predominó para las variantes en MMP7 y MMP12. Además, el haplotipo analizado fue más frecuente en pacientes con CCR que en controles sanos8. Luego entonces, podría ser que existe una fuerza haplotípica mayor derivada de la presencia de un alelo específico y no de la suma de todos los alelos. Por otro lado, en el análisis de haplotipos de tres SNV (MMP8 rs2509013 C>T/MMP8 rs11225395 G>A/MMP27 rs3809017 T>C)22, la mayoría de los haplotipos que tuvieron T fueron asociados con una disminución en la recurrencia de embarazos, por lo que la influencia de un único alelo podría ser relevante.
Conclusión
Nuestros resultados sugieren que los haplotipos rs11568818(A)-rs11225395(T)-rs2276109(A)-rs2252070(A) y rs11568818(A)-rs11225395(C)-rs2276109(A)-rs2252070(G) confieren un incremento del riesgo de CCR, mientras que los haplotipos rs11568818(G)-rs11225395(C)-rs2276109(A)-rs2252070(A) y rs11568818(A)-rs11225395(T)-rs2276109(A)-rs2252070(G) actúan como un factor protector para CCR. Estuvo presente DL entre rs2276109 (MMP12) y rs2252070 (MMP13). Además, sería importante realizar más estudios para mostrar el posible impacto que un único alelo podría tener como parte de un haplotipo. Por otro lado, las SNV rs11225395 (MMP8) y rs2276109 (MMP12) no mostraron asociación significativa con CCR. Respecto a rs11225395 (MMP8), este representa el primer reporte en pacientes con CCR.
