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Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es la tercera causa de muerte relacionada con tumores en el mundo1,2. Aproximadamente el 45% de los casos ocurren en regiones subdesarrolladas1,3. El CCR suele ocurrir en adultos con una edad promedio de 67 años4. En México, en incidencia y mortalidad el CCR es el tercero más común en ambos sexos1.
El CCR es una neoplasia en la que ocurren procesos epigenéticos como la hipermetilación de islas CpG, lo que lleva a una inactivación de genes y a la alteración en el crecimiento y funcionamiento normal celular5. La hipermetilación de MLH1 se ha descrito como un marcador pronóstico para esta neoplasia6. La proteína MLH1 forma parte de un complejo proteico que participa en el sistema de reparación por apareamiento erróneo7-9. El gen MLH1 se localiza en 3p22.2 y contiene 19 exones10. Su expresión está regulada vía promotor, carece de caja TATA, pero contiene la secuencia CCAAT necesaria para la unión de factores de transcripción11. MLH1 tiene una isla CpG de 1128 pb, en la que se encuentran 93 sitios CpG (chr3: 37034229–37035356)12. En CCR esporádico, MLH1 está metilado del 10 al 15%5. En líneas celulares de carcinoma colorrectal han sido estudiadas cuatro regiones de la isla CpG: A (-711 a -577), B (-522 a -266), C (-248 a -178) y D (-109 a +5), correlacionando hipermetilación con inhibición de la expresión génica de MLH113,14. Por otro lado, en población japonesa se ha reportado el análisis de cinco regiones: A (-755 a -574), B (-597 a -393), C (-420 a -188), D (-286 a -53) y E (-73 a +86), correlacionando la metilación total y parcial con las características clínico-patológicas, expresión proteica e inestabilidad de microsatélites15.
Específicamente, no existe ningún reporte de metilación de MLH1 en pacientes mexicanos con CCR. Debido a esto, el propósito del presente estudio fue analizar la frecuencia de metilación de cinco regiones de la isla CpG de MLH1 en pacientes mexicanos con CCR.
Materiales y métodos
Muestras
Se colectaron 101 muestras de tejido tumoral de pacientes mexicanos diagnosticados clínica e histopatológicamente con CCR en el Hospital Civil Dr. Juan I. Menchaca (Guadalajara, Jalisco, México). Las muestras de tejido se obtuvieron al término de la cirugía. Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado con base en la Declaración de Helsinki. Este estudio fue aprobado por el comité local de bioética (CI-01417).
Extracción de ADN y cuantificación
Se realizó la extracción de ADN de los tejidos tumorales (High Pure PCR Template Preparation kit [n.º de producto: 11796828001], Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Alemania). Posteriormente se cuantificó el DNA por espectrofotometría. Las muestras se almacenaron a –20 °C hasta su uso.
Conversión de ADN por bisulfito
Se utilizó una concentración de ADN de 100 mg/ml (18 ml) y posteriormente se trató con el kit EZ DNA Methylation-Gold (n.° de producto: D5006; ZYMO Research, EE.UU.). Se utilizó como control ADN de la línea celular HCT116 DKO (n.° de producto: D5014; ZYMO Research) la cual se usó durante el análisis de conversión y reacción en cadena de la polimerasa específica para metilación (MS-PCR).
Reacción en cadena de la polimerasa específica para metilación
La isla CpG se dividió en cinco regiones para el análisis de metilación: A (-539 a -677), B (-418 a -264), C (-162 a -62), D (+82 a +260) y E (+234 a +415). Se realizó MS-PCR para todas las regiones utilizando ADN convertido. Los iniciadores utilizados para ADN metilado y no metilado se describen en la tabla 1. La MS-PCR para todas las regiones se realizó a 30 ciclos, en un volumen de 12 ml, el cual contenía 100 ng/ml DNA, 1× buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl y 0.1% Triton X-100), 1.5 mM MgCl2, 2 mM dNTP, 10 pM de cada iniciador y 2 U de Taq DNA polimerasa Platinum. La desnaturalización inicial se llevó a 95 °C por 5 min, seguido de 94 °C por 45 s, alineamiento a 57 °C por 45 s y elongación a 72 °C por 1 min. Los productos de PCR se visualizaron en geles de poliacrilamida teñidos con nitrato de plata al 6%.
Tabla 1 Iniciadores del gen MLH1 utilizados para la amplificación del ADN metilado y no metilado de las regiones A, B, C, D, y E
| Regiones de la isla CpG | M/U | iniciadores | Tamaño del fragmento (pb) |
|---|---|---|---|
| A | M | F5' –CGGTAGAGTTCGAGGTTTGTAC –3' | 134 |
| R5' –CACGAATACTACGAACGATATATAACG –3' | |||
| U | F5' GTGGTAGAGTTTGAGGTTTGTATGA –3' | 138 | |
| R5' –AAACACAAATACTACAAACAATATATAACA –3' | |||
| B | M | F5' – GTCGGAAAATTAGAGTTTCGTC –3' | 151 |
| R5' –GCAAAACGAAAAAAATACTTAACG –3' | |||
| U | F5' – GGTTGGAAAATTAGAGTTTTGTTGA –3' | 154 | |
| R5' –ACAAAACAAAAAAAATACTTAACACA –3' | |||
| C | M | F5' –GATAGCGATTTTTAACGC –3' | 93 |
| R5' –TCTATAAATTACTAAATCTCTTCG –3' | |||
| U | F5' –AGAGTGGATAGTGATTTTTAATGT –3' | 100 | |
| R5' –ACTCTATAAATTACTAAATCTCTTCA –3' | |||
| D | M | F5' –GTTTTTTTGGCGTTAAAATGTC –3' | 166 |
| R5' – CCTTAAATAAACCCGACTCGAC –3' | |||
| U | F5' –TTGGTTTTTTTGGTGTTAAAATGTT –3' | 172 | |
| R5' –AACCCTTAAATAAACCCAACTCAAC –3' | |||
| E | M | F5' –GAGTCGGGTTTATTTAAGGGTTAC –3' | 177 |
| R5' –GATAAAAAAACACACGATCTACGAA –3' | |||
| U | F5' –AGTTGGGTTTATTTAAGGGTTATGA –3' | 176 | |
| R5' – AATAAAAAAACACACAATCTACAAA –3' |
M: metilado; U: no metilado; pb: pares de bases; F: forward; R: reverse.
Resultados
Se analizaron 101 muestras de tejido tumoral de pacientes mexicanos con CCR, la edad promedio fue de 59 años. Las características analizadas fueron sexo (52% hombres), actividad física (53%), diabetes mellitus tipo II (21%), consumo de tabaco, alcohol, carne roja, frutas y verduras (42, 49, 81 y 75%, respectivamente), metástasis (42%), presencia de pólipos (17%), recaídas (4%) y localización del tumor (colon, 60%).
Análisis de metilación
La frecuencia de metilación de MLH1 en pacientes mexicanos con CCR fue del 25%. Sin embargo, del total de muestras metiladas, la frecuencia de metilación fue del 60% en regiones A y B (Tabla 2).
Tabla 2 Análisis de metilación de la regiones de la isla CpG en el gen MLH1 de tejido tumoral de pacientes con cáncer colorrectal
| Región metilada | Total de muestras metiladas |
|---|---|
| n = 25 (%) | |
| A | 15 (60) |
| B | 15 (60) |
| C | 7 (28) |
| D | 8 (32) |
| E | 7 (28) |
Se comparó la frecuencia de metilación con las características clínico-patológicas y de estilo de vida, encontrándose diferencias significativas con el sexo y la edad (p < 0.05) (Tabla 3). Del total de muestras metiladas, el 68% correspondieron a pacientes de sexo femenino. Además, se establecieron dos rangos de edad (< 45 y > 45 años de edad); del total de muestras metiladas, el 80% presentó metilación a una edad mayor de 45 años.
Tabla 3 Comparación en la frecuencia de metilación de las regiones de la islas CpG en el gen MLH1 por sexo
| Regiones | Pacientes CCR (n = 101) | p | OR (IC) | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Sexo masculino (n = 53) | Sexo femenino (n = 48) | |||||
| M | U | M | U | |||
| Cualquier región* | 8 (15.1%) | 45 (84.9%) | 17 (35.4%) | 31 (64.6%) | 0.018 | 3.085 (1.9 –8.0) |
| A | 3 (5.7%) | 50 (94.3%) | 12 (25.0%) | 36 (75.0%) | 0.01 | 5.556 (1.5 –21.1) |
| B | 4 (7.5%) | 49 (92.5%) | 11 (22.9%) | 37 (77.1%) | 0.048 | 3.642 (1.1 –12.4) |
| A + B | 2 (3.8%) | 51 (96.2%) | 9 (18.8%) | 39 (81.3%) | 0.023 | 5.885 (1.2 –28.8) |
*Muestras metiladas en cualquier región analizada (A, B, C, D, E).
CCR: cáncer colorrectal; M: metilado; OR: odds ratio; IC: intervalo de confianza; U: no metilado.
Se comparó la frecuencia de metilación (25%) con las frecuencias reportadas en otras poblaciones, encontrándose diferencias significativas (Tabla 4).
Tabla 4 Frecuencia de metilación del gen MLH1 entre diferentes poblaciones de pacientes con cáncer colorrectal
| Población | n | Tejido tumoral analizado | M (%) | p | Referencia |
|---|---|---|---|---|---|
| Australiana | 946 | Tejido fresco | 10.1 | 0.0001 | Wong,et al., 201116 |
| Japonesa | 104 | Tejido fresco | 9.6 | 0.0039 | Hokazono,et al., 201417 |
| Japonesa | 210 | Tejido fresco | 28.5 | 0.4935 | Miyakura,et al., 201418 |
| China | 301 | Tejido fresco | 14.6 | 0.0188 | Wang,et al., 201419 |
| Española | 326 | Tejido fresco | 5.2 | 0.0001 | Veganzones,et al., 201520 |
| Coreana | 132 | Tejido fresco | 6 | 0.0001 | Lee,et al., 201921 |
| Eslovaca | 300 | Tejido parafinado | 7.6 | 0.0001 | Kašubová,et al., 20197 |
| Mexicana | 101 | Tejido fresco | 25 | – | Presente estudio |
M: porcentaje de alelos metilados.
Discusión
Análisis de metilación
En el presente estudio se analizaron cinco regiones de la isla CpG. Cabe mencionar que las regiones D y E no habían sido previamente analizadas por otros autores (Tabla 5). Las cinco regiones analizadas cubren un total de 63 sitios de la isla CpG.
Tabla 5 Comparación entre diferentes regiones de la isla CpG del gen MLH1 reportado por Deng, et al. (2001), Miyakura, et al. (2014) y el presente estudio
Estudios previos analizaron cuatro regiones ricas en sitios CpG mediante secuenciación; sin embargo, fueron utilizadas líneas celulares, cubriendo 43 sitios CpG. Particularmente, estos estudios mostraron una correlación entre la metilación de la región C o D con la inhibición de la expresión génica debido a la presencia de la secuencia CCAAT, la metilación de esta secuencia inhibe la unión del factor de transcripción CBF (core binding factor). De acuerdo con estos estudios, la hipermetilación en las regiones C y D del promotor MLH1 provoca la inactivación y deficiencia de la proteína13,14. En nuestro estudio, el 28% de las muestras se encontraron metiladas en la región C y el 32% metiladas en la región D. Estas regiones se encuentran alrededor del sitio de inicio de la transcripción, pero siempre tienen una frecuencia de metilación más baja que las otras regiones22. Por ejemplo, las regiones A y B son las más frecuentemente metiladas23, sin embargo, el efecto funcional de estas regiones no se ha descrito directamente. Al respecto, en el presente estudio se observó una mayor frecuencia de metilación en las regiones A y B (60%). Otro reporte reveló que la región A puede ser el primer sitio que se metile durante la progresión a un estado de metilación15. Estas regiones (A, B) son las más alejadas del inicio del sitio de transcripción. Por otro lado, todos los tumores metilados en la región C mostraron metilación en las regiones A y B, lo cual fue una constante en nuestro estudio, pero los autores mostraron casos de metilación solo en las regiones A y B, y no en la región C13.
La frecuencia de la metilación fue del 25% para MLH1. Se conoce que la metilación del ADN puede afectar sitios de unión de factores de transcripción, elementos reguladores y la conformación de la cromatina, lo que da como resultado múltiples niveles de control de la expresión24. Esta frecuencia es mayor que la propuesta por otros autores, quienes mencionan una frecuencia de metilación para MLH1 entre el 10-15% en casos de CCR esporádico5. Incluso nuestro porcentaje también fue mayor que el reportado en otras poblaciones7,16-21.
Metilación mediada por sexo
El CCR es una enfermedad compleja que involucra varios factores25-28. En el presente estudio se examinó la correlación de algunos de estos con la metilación. Sin embargo, solo se presentaron diferencias significativas con sexo y edad. Específicamente, la metilación de MLH1 se ha asociado con variables clínico-patológicas, incluido el sexo femenino29. En el presente estudio, la frecuencia de metilación fue mayor en mujeres (OR: 3.085; intervalo de confianza [IC: 1.85-8.03; p = 0.02); estos hallazgos son similares a los reportados en diferentes estudios16,18. Un reporte que incluyó 210 muestras de pacientes con CCR reveló una metilación más elevada en las mujeres (p = 0.007). Además, se propuso que la presencia de la variante MLH1 c.-93G>A (rs1800734) conduce a un mayor riesgo de metilación en mujeres21. Es interesante mencionar que en este trabajo las mujeres que tuvieron alguna región metilada tuvieron en común la presencia de sobrepeso u obesidad, y en alguna etapa de su vida habían consumido tabaco y alcohol. Al respecto existe suficiente evidencia de la influencia de estos factores en la metilación del ADN30-32.
Metilación mediada por la edad
Asimismo, el análisis de la frecuencia de metilación por rango de edad reveló una mayor metilación en individuos mayores de 45 años (80%). Sin embargo, el efecto de la edad sobre el estado de metilación sigue sin ser claro. El único estudio en MLH1 que asoció el envejecimiento con la metilación aberrante mostró que la metilación aumentó con la edad (frecuencia por 10 años de edad = 2.1%; p < 0.001)33. Además, se encontró que la metilación de MLH1 en muestras de tumor ocurrieron con mayor frecuencia en mayores de 50 años29. En nuestro estudio, los niveles elevados de metilación fueron más frecuentes en mujeres mayores de 45 años.
Análisis poblacional de metilación
El análisis poblacional mostró que la frecuencia de metilación en pacientes con CCR en población mexicana fue significativamente diferente a otras poblaciones: australiana, japonesa, china, española, coreana y eslovaca7,16-21. Estas diferencias probablemente se deben a la variabilidad en el número de muestras utilizadas en cada estudio, las diferentes regiones analizadas por cada autor, el estilo de vida y la estructura genética característica de los mexicanos. Sin embargo, en el presente estudio no se encontraron datos significativos cuando se analizó la asociación de la metilación con aspectos relacionados con el estilo de vida.
Conclusión
El presente análisis mostró una frecuencia de metilación de MLH1 del 25%. Este valor es superior al reportado en otras poblaciones y constituye el primer reporte en pacientes mexicanos con CCR. El análisis por región reveló que las regiones A y B tuvieron una mayor frecuencia de metilación (60%). Finalmente, el 80% de las muestras metiladas correspondieron a pacientes mayores de 45 años y se encontró una elevada metilación en pacientes del sexo femenino, lo que nos indica un papel relevante de estos dos factores en la metilación del ADN.
