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Las enfermedades rickettsiales son un grupo de zoonosis causadas por bacterias gramnegativas del género Rickettsia y se encuentran ampliamente distribuidas en países tropicales y de clima templado. Las rickettsiosis comprenden un conjunto importante de 21 enfermedades transmitidas por artrópodos1,2 y se dividen en dos grupos: el de las fiebres manchadas (FM), que contiene 19 especies patógenas de Rickettsia y cuyos principales vectores son garrapatas duras; y el grupo tifus (GT), que incluye infecciones transmitidas por piojos humanos (Rickettsia prowazekii) y pulgas (Rickettsia typhi), aunque se han detectado también garrapatas del género Amblyomma3 y del complejo Rhipicephalus sanguineus como vectores.4 Estudios recientes han demostrado que, en áreas suburbanas sin ratas, la transmisión del tifus murino se relaciona con la presencia de gatos (Felis catus), perros (Canis familiaris) y zarigüeyas (Didelphis virginiana).4,5,6 Esta enfermedad tiene un ciclo que involucra pulgas -principalmente Xenopsylla cheopis- y Rattus como reservorios primarios, mientras que los seres humanos son hospederos accidentales.7 En los humanos, la transmisión comienza cuando las pulgas infectadas defecan al tiempo que se alimentan, lo cual produce irritación en la piel y provoca, a su vez, que el arañazo producido por frotamiento se inocule con heces infectadas.8
El tifus murino comenzó a identificarse desde principios del siglo XX en Estados Unidos de América, y actualmente existen diferentes áreas endémicas en todo el mundo. Debido a que este padecimiento produce una fiebre leve y los síntomas, al no ser específicos, a menudo se confunden con otras enfermedades comunes como el dengue, es posible que en muchos países las estadísticas respectivas mantengan una subestimación del problema.8,9 En México, varios estados han registrado casos clínicos de tifus murino; sin embargo, sólo se conoce que, además de la pulga, Rh. Sanguineus podría participar en la transmisión de R. typhi.4 En este trabajo se exponen nuevos datos sobre la presencia de ácidos nucleicos de R. typhi en dos especies de garrapatas de Tapachula, Chiapas.
Material y métodos
Sitio de colecta
El estudio se realizó de octubre de 2012 a marzo de 2013, en cinco localidades del sureste de Chiapas: Tapachula (14°54´N, 92°15´W), Mazatán (14°52’ N y 92° 27’W), Huehuetán (15°01’ N y 92° 23’W), Huixtla (15°08’ N y 92° 28’W) y Acapatahua (15 ° 17’ N, 92 ° 41’ W), ubicadas en la planicie costera del océano Pacífico (0-200 metros sobre el nivel del mar). El clima en la zona es cálido y subhúmedo, con temperaturas que oscilan entre los 27 y los 29.7 °C (28.2 °C en promedio). La temporada de lluvias se extiende de mayo a octubre, con aproximadamente 90 días lluviosos. Las precipitaciones oscilan entre 120 y 190 cm (140 cm como media), y la humedad relativa, entre 55 y 100% (81% en promedio); la estación seca se extiende de noviembre a abril.
Muestreo e identificación de garrapatas
En cada sitio de muestreo se colectaron garrapatas de cuatro hospederos vertebrados, incluidos perros, caballos, vacas y humanos; además se utilizó una trampa de franela. Después del consentimiento informado de los propietarios de los animales, las garrapatas fueron colectadas directamente del cuerpo del animal con la ayuda de pinzas entomológicas. Para este muestreo, el Comité de Ética en Investigación del Instituto Nacional de Salud Pública dio su aprobación. Las garrapatas se almacenaron individualmente en un vial con etanol al 70%, etiquetado con la información de la colecta. En las casas donde se encontraron animales infestados de garrapatas, se llevó a cabo la revisión y colecta de ectoparásitos en voluntarios y con trampas de franela en la vegetación alrededor de las casas. Para la identificación taxonómica de las garrapatas se utilizaron los criterios morfológicos notificados en 196610 y 2011.11 Para la separación del complejo cajennense, se mantuvo el criterio de Nava y colaboradores12 para la identificación de A. mixtum. Una vez realizada dicha identificación, los especímenes fueron almacenados a -70 °C.
Extracción de ADN y PCR
Los especímenes fueron agrupados en viales de trabajo (1-10 garrapatas). Para la extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN) se utilizó un kit especialmente diseñado para ello, siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN de cada vial de trabajo se eluyó en agua estéril y se almacenó a -20 ºC. Para determinar la presencia de ADN del género de Rickettsia se amplificaron regiones de los genes htrA (proteína de 17 kDa) y gltA (enzima citrato sintetasa) por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) convencional, y por PCR anidado para el gen ompB, de tal manera que se generaron productos de amplificación de 434, 381 y 237 pb. Para todos los ensayos de PCR se utilizó agua estéril en una reacción como control negativo y una muestra de ADN de Rickettsia parkeri. Las condiciones de PCR se realizaron en un termociclador. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro de etidio, y se visualizaron en un transiluminador de luz UV.
Secuenciación
Los amplicones fueron purificados mediante un kit de PCR y enviados a secuenciar al Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México. Las secuencias parciales, recibidas en un archivo de extensión Seq, fueron visualizadas empleando el visor Chromas para su posterior análisis y comparación mediante el programa de análisis de secuencias (BLAST, por sus siglas en inglés), de la página http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Resultados
Especies de garrapatas
Se identificaron dos géneros de garrapatas, representados en tres especies que incluyen Rh. sanguineus s.l (Latreille, 1806), Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canastrini, 1887) y A. mixtum. La especie más frecuente fue Rh. sanguineus s.l., con un total de 345 individuos (62.38%; proporción de sexos h:m 0.91:1), seguido de Rh. (Boophilus) microplus con 94 (17%; h:m 1:0.36) y A. mixtum con 94 (17%; h:m 1:0.8). No se incluyeron para el análisis 20 especímenes, debido a que no se pudieron identificar por daño de estructuras anatómicas (cuadro I).
Cuadro I: Clasificación de garrapatas por especie y sexo, colectadas en diferentes hospederos/sitios. Sureste de Chiapas, México, 2012-2013
| Sitio de colecta | Rh. sanguineus | Rh. (Boophilus) microplus | Amblyomma mixtum | Indeterminado | ||||||||||||
| Machos | Hembras | Machos | Hembras | Machos | Hembras | Machos | Hembras | |||||||||
| Perros | 181 | 164 | 4 | 22 | 0 | 1 | 0 | 12 | ||||||||
| Vacas | 21 | 47 | 0 | 7 | 0 | 2 | ||||||||||
| Caballos | 15 | 33 | 6 | 0 | ||||||||||||
| Humanos | 3 | 16 | ||||||||||||||
| Gatos | 1 | 1 | ||||||||||||||
| Vegetación | 5 | 11 | ||||||||||||||
| Pabellón | 1 | 0 | ||||||||||||||
| Subtotal | 181 | 164 | 25 | 69 | 25 | 69 | 6 | 14 | ||||||||
| Total | 345 | 94 | 94 | 20 | ||||||||||||
Número de garrapatas por tipo de hospedero
De un total de 551 garrapatas, 93.49% fueron colectadas en animales domésticos, 3.43% en humanos y 3.07% en ambientes de vida libre. En los perros (C. familiaris) analizados se colectó un total de 384 garrapatas (n=20; x=19.2 ±4.33); en vacas (Bos Taurus), 77 ejemplares (n=3; x=25.66±20.16); en caballos (Equus caballus), 54 ejemplares (n=5; x=10.80±4.49), y en gatos (F, catus), dos ejemplares (no considerados en el análisis). En humanos se colectó un total de 19 ejemplares (n=6; x=3.16±0.98). El análisis de varianza descartó diferencias significativas entre las medias de las colecciones por tipo de hospedero (F=1.80, df=3.30, p=0.16) (cuadro II).
Cuadro II: Colecta promedio de garrapatas por tipo de hospedero. Sureste de Chiapas, México, 2012-2013
| N | Media ± error estándar (IC95%) | Estadística | ||||
| Perros | 20 | 19.20 ± 4.33(10.12-28.27) | F=1.80, df = 3,30 p = 0.16 | |||
| Caballos | 5 | 10,80 ± 4.49(1.69-23.29) | ||||
| Vacas | 3 | 25.66 ± 20.16(61.11-112.44) | ||||
| Humanos | 6 | 3.16 ± 0.98(0.64-5.68) |
Identificación de la especie deRickettsia
Para el análisis molecular se seleccionaron 180 especímenes (33%), y de ellos se conformaron 39 viales de trabajo (1-10 garrapatas). De estos últimos, 29 grupos (n=121) eran de Rh. Sanguineus colectados en perros; seis grupos (n=35), de Rh. (Boophilus) microplus colectados en cuatro vacas y dos perros, respectivamente, y, por último, cuatro grupos (n=23) eran de A. mixtum colectados en caballo (un grupo), vaca (un grupo) y humano (dos grupos). Los 39 viales de trabajo fueron analizados por PCR; de éstos sólo 10/39 viales amplificaron para el fragmento del gen gltA. Asimismo, 7/10 viales de trabajo eran de la especie Rh. sanguineus colectadas de caballos, y 3/10, de A. mixtum colectadas de caballo y humano. Las muestras se sometieron a otros ensayos de PCR para amplificar los fragmentos del gen htrA y de la región del gen ompB, los cuales también resultaron positivos. El análisis de alineamiento de los amplicones positivos mostró homologías a R. typhi del 100, 99 y 99% con los fragmentos de los genes htrA (número de acceso: LS992663), y gltA y ompB (número de acceso: LS992663.1).
Las localidades que mostraron presencia de garrapatas con resultado positivo a R. typhi son: ciudad de Tapachula; Ejido Guadalupe y Cantón Gibraltar, en el municipio de Huehuetán,y San Simón y Emiliano Zapata, en el municipio de Mazatán. Los especímenes colectados en los municipios de Huixtla y Acapetahua no mostraron infección por R. typhi (cuadro III).
Cuadro III: Localidades con grupos de garrapatas en estadios positivos a Rickettsia typhi. Sureste de Chiapas, México, 2012-2013
| Sitio de muestreo | Fecha de colecta | Etapa de vida de las garrapatas | Grupos(núm. garrapataspor grupo) | Especie de garrapata | Hospedero | Muestras con amplificacióna los genesgltA y 17KDa | Especie de Rickettsia | |||||||
| Tapachula (ciudad) | Octubre 2012 | A | 3 (10) | Rh. sanguineus | Perro | 3 | R. typhi | |||||||
| Huehuetan (Ejido Guadalupe) | Octubre 2012 | A | 1 (10) | A. mixtum | Caballo | 1 | R. typhi | |||||||
| Huehuetan (Ejido el Carmen) | Marzo 2013 | A | 1 (5) | A. mixtum | Humano | 1 | R. typhi | |||||||
| Huehuetan (Cantón Gibraltar) | Marzo 2013 | N | 1(8) | A. mixtum | Humano | 1 | R. typhi | |||||||
| Mazatán (San Simón) | Mayo 2013 | N | 1(2) | Rh. sanguineus | Perro | 1 | R. typhi | |||||||
| Mazatán (Emiliano Zapata) | Mayo 2013 | N | 1 (4) | Rh. sanguineus | Perro | 1 | R. typhi | |||||||
| Huixtla (San Fernando) | Mayo 2013 | N | 1(8) | Rh. sanguineus | Perro | 1 | R. typhi | |||||||
| Acapetahua (Salvación) | Junio 2013 | N | 1 (2) | Rh. sanguineus | Perro | 1 | R. typhi | |||||||
| Totales | 10 (49) | 10 |
A: adulto
N: ninfa
Tasa mínima de infección por especies de garrapatas
La tasa de infección general porRickettsiafue de 3.88. El municipio que mostró una mayor tasa mínima de infección (TMI) fue Mazatán, con 7.69 en Rh. sanguineus, mientras que para Huehuetán la TMI fue de 6.97, en donde prevaleció la especie de A. mixtum. Por otra parte, en Tapachula se registró una TMI de 3.22 en Rh. sanguineus, menor que en Mazatán, donde se presentó la misma especie de garrapata (cuadro IV).
Cuadro IV: Tasa mínima de infección por Rickettsia typhi, por especie de garrapatas y localidad de colecta. Sureste de Chiapas, México, 2012-2013
| Lugar | Especie de garrapata | Pooles totales | Total de garrapatas | Pooles positivos | TMI | |||||
| Tapachula | Rh. sanguineus | 8 | 62 | 2 | 3.22 | |||||
| Huehuetán | A. mixtum | 5 | 43 | 3 | 6.97 | |||||
| Mazatán | Rh. sanguineus | 10 | 26 | 2 | 7.69 | |||||
| Huixtla | Rh. sanguineus | 7 | 33 | 0 | 0 | |||||
| Acapetahua | Rh. sanguineus | 9 | 16 | 0 | 0 | |||||
| Total | 39 | 180 | 7 | 3.88 |
TMI: tasa mínima de infección
Discusión
En México la rickettsiosis más estudiada es la fiebre manchada causada por R. rickettsii, y existen datos al respecto desde la década de los cuarenta.13,14,15 En los años 1983-1993 fueron notificados brotes de rickettsiosis del grupo tifo, del tipo epidémico (causado por R. prowazekii), en Chiapas.16 En el año 2000, se registró una prevalencia de 14% de anticuerpos reactivos a Rickettsia typhi en adultos donadores de sangre.17 Además, en 2009 se presentaron más casos de rickettsiosis en Yucatán, debido a R. typhi, entre niñas de tres años de edad, con cuadro febril de tres días de duración.18 Lo anterior indica la presencia de casos; aun cuando son pocos, estos estudios demuestran la existencia de varios artrópodos transmisores de Rickettsia sp.
Los resultados obtenidos señalan la presencia de R. typhi en A. mixtum y Rh. sanguineus s.l. colectados en las siete comunidades visitadas, las cuales representan a los cinco municipios del estudio. Considerando las especies de garrapatas donde R. typhi se detectó, estos resultados podrían representar una mayor dispersión de esa bacteria en Chiapas, debido a que dichas especies están ampliamente distribuidas en ambientes rurales y urbanos.19,20 En este sentido, los datos de distribución y preferencia de hábitat señalan que las garrapatas del complejo Rh. sanguineus están adaptadas para habitar ambientes tanto urbanos como rurales,21 mientras que A. mixtum está entre las especies más comunes en ambientes rurales.22,23 Por otro lado, ambas especies se han identificado como ectoparásitos de humanos; de hecho, A. mixtum es la especie más antropofílica en algunos países como Panamá.10,23
La frecuencia con la que se colectaron garrapatas sobre un hospedero específico demuestra la preferencia de éstas por determinados sistemas biológicos. Las especies de garrapatas registradas en este estudio evidenciaron tener una especificidad por un hospedero en particular; Rh. sanguineus reveló preferencia por los perros, mientras que A. mixtum, aunque mostró preferencia por los caballos, tuvo un comportamiento polífago, ya que también fue colectada sobre vacas, perros y en vida libre; y uno de los hallazgos relevantes fue que A. mixtum tuvo preferencia también por los humanos. Estas especies han sido registradas por diversos autores como vectores de patógenos que causan enfermedades importantes en la salud veterinaria y la pública. A Rh. sanguineus se le ha considerado vector primario de Ehrlichia canis, de Babesia canis vogeli y rickettsiosis del grupo de la fiebre manchada, como R. rickettsii en el nuevo mundo y R. coroni en el viejo mundo.24,25,26 Asimismo, recientemente se detectó ADN de R. typhi en sangre de perros de Yucatán, lo que supone la importancia de estos animales domésticos en el mantenimiento de esa especie en el sureste de México.4,20 De la misma manera, A. mixtum es el vector principal de R. rickettsii y, se sospecha, vector también de Brucella y Trypanosoma cruzi,27 así como transmisor de Piroplasmosis en ganado.28 Por su parte, Rh. microplus, denominada “garrapata común del ganado”, es la especie de mayor importancia en el ámbito veterinario por su impacto en la salud bovina y es considerada vector de hemoparásitos como Babesia sp. y Anaplasma sp.29,30,31
En este trabajo se mostró evidencia molecular de la presencia de R. typhi en Rh. sanguineus provenientes de perros, y dada la interacción humana con estos vertebrados, existe un riesgo de transmisión para las personas. Resultados de aislamiento de R. typhi en R. sanguineus han sido documentados, así como la detección en sangre de perros en comunidades rurales mayas; ello sugiere que el perro podría desempeñar un papel importante en la transmisión del tifus murino, ya que se han demostrado títulos elevados de anticuerpos contra Rickettsia typhi y rickettsemia. La evidencia molecular de Rickettsia typhi notificada destaca que se necesitan estudios de competencia vectorial y transmisión animal para una mejor comprensión de la ecoepidemiología de R. typhi en la región.
Por otra lado, A. mixtum con presencia de R. typhi colectado de humanos sugiere que el tifus murino podría estar afectando la salud humana y que los síntomas respectivos podrían ser confundidos con otra enfermedad local de la región. En Rh. microplus no se encontró presencia de Rickettsia, lo que sugiere que Rh. sanguineus y A. mixtum podrían estar participando en la dispersión del tifus murino en humanos. Por tanto, estos hallazgos ameritan abordar otros estudios ecoepidemiológicos que revelen los principales vectores/patógenos que pudieran poner en riesgo la salud humana.
