Artículos de revisión

 

Desarrollo de Mapas Genéticos y Físicos de Hongos Fitopatógenos: Aplicaciones y Perspectivas

 

Development of genetical and physical maps of phytopathogenic fungi: Applications and perspectives

 

Gilberto Manzo-Sánchez¹, Andrew James-Kay², Elizabeth Ortiz-Vázquez³, y June Simpson-Williamson⁴

 

¹ Universidad de Colima, Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Laboratorio de Biotecnología, Apdo. Postal 36, km 40 Autopista Colima-Manzanillo, Tecomán, Colima, México CP 28100. Correspondencia: gmanzo@cicy.mx.

² Centro de Investigación Científica de Yucatán, Unidad de Biotecnología, Calle 43 No. 130, Colonia Chuburná de Hidalgo, Mérida, Yucatán, México CP 97200.

³ Instituto Tecnológico de Mérida, Depto. Ingeniería Química-Bioquímica, km 5 Carr. Mérida-Progreso, Mérida, Yucatán, México CP 97118.

⁴ CINVESTAV Unidad Irapuato, Depto. de Ingeniería Genética de Plantas, Apdo. Postal 629, km 9.6 Lib. Norte, Carr. Irapuato-León, Irapuato, Guanajuato, México CP 36500.

 

Recibido: Abril 26, 2006
Aceptado: Agosto 24, 2006

 

Resumen

El objetivo de la presente revisión es informar los avances que se han logrado sobre el desarrollo de mapas de genomas de hongos fitopatógenos, sus principales ventajas y aplicaciones. Para un mejor entendimiento y manejo de los patógenos se han desarrollado mapas genéticos en algunos hongos fitopatógenos; además, mediante el apoyo de los marcadores de DNA se han podido identificar y desarrollar mapas de algunos genes de interés [avirulencia/ patogenicidad, el locus MAT (grupo de apareamiento), algunos que están involucrados en la producción de toxinas, y en la producción de pigmentos, ínter estériles, principalmente]. Por otra parte, uno de los usos principales de los mapas físicos es localizar e identificar la región en el cromosoma de algún gene en particular. Algunos genes son usados como sondas para hibridar con algún cromosoma, como: DNAr (DNA ribosomal), âtub (â-tubulina), sodl (superóxido dismutasa), niaD (nitrato reductasa), Skn-7 (histidina kinasa 7), y ops (opsina), por mencionar algunos de ellos. Con el fin de lograr entender la estructura, función y evolución del genoma de hongos fitopatógenos, algunos grupos de investigación mantienen prioridades como obtener mapas genéticos de alta densidad, desarrollar mapas físicos, obtener la secuencia completa del genoma y localizar genes en base a secuencias (STE's o secuencias de genomas) ya conocidas por similaridad de secuencias.

Palabras claves: Marcadores de DNA, genes de avirulencia, cariotipo electroforético, mapas genéticos, mapas físicos.

 

Abstract

The objective of this review is to inform about the progress achieved on genome mapping of phytopathogenic fungi, its main advantages, and applications. In order to better understand and manage pathogens, genetic linkage maps have been developed for some phytopathogenic fungi; also, through support of DNA markers it has been possible to map and identify some genes of interest [avirulence/pathogenicity genes, MAT (mating type) locus, some which are involved in toxin production, and pigment production, mainly intersterile]. On the other hand, one of the main uses of physical maps is to locate and identify the region of a particular gene within a chromosome. Some genes are used as primers to hybridize with a specific chromosome, for example: ribosomal DNA (DNAr), â-tubuline (âtub), superoxidise dismutase (sodl), nitrate reductase (niaD), histidine kinase 7 (Skn-7), and opsine (ops), just to mention some of them. In order to understand the structure, function, and evolution of the genome of phytopathogenic fungi, some research groups maintain priorities like: Producing genetic maps of high density, develop physical maps, obtain the complete sequence of the genome, and to locate genes based on sequences (EST's or genome sequences) known by sequence similarity.

Keywords: DNA markers, avirulence genes, electrophoretic karyotype, genetic map, physical maps.

 

INTRODUCCIÓN

El desarrollo de la genética y la biología en el siglo pasado y en los últimos años, ha generado importantes logros, como son: El "redescubrimiento" de las leyes de Mendel en 1900 surgió como un logro trascendental para las bases de la genética clásica , la determinación del DNA como el material genético, el descubrimiento de la estructura de la doble hélice del DNA y sus aplicaciones, los análisis de DNA por medio de marcadores, la manipulación y clonación de fragmentos grandes de DNA y por último la obtención de la secuencia del DNA que puede ser en información digital y almacenada en una computadora para su análisis posterior (Lander y Weinberg, 2000; Zhang y Wing, 1997). Los mapas genéticos y mapas físicos forman la base para numerosas investigaciones básicas y aplicadas, incluyendo estudios de la organización, estructura y evolución del genoma, clonación de genes blanco, comparaciones evolutivas entre especies y otras aplicaciones. Los mapas genéticos de hongos fitopatógenos se han construido con la ayuda de marcadores de DNA y recientemente con la información de secuencias genómicas, siendo su principal aplicación el mapeo de genes de avirulencia (avr) y el locus MAT (grupo de apareamiento). Hoy en día, se han desarrollado mapas genéticos en varios hongos fitopatógenos (Cuadro 1), dentro de los cuales, los Ascomicetos son los más estudiados. Por otra parte, los mapas físicos se han iniciado a partir de la determinación del cariotipo electroforético, la construcción y caracterización de bibliotecas de cromosomas artificiales de bacterias (BAC = Bacterial Artificial Chromosome), las cuales han permitido realizar estudios en genómica comparativa entre especies relacionadas y determinar la localización física de algún gene. El mapeo genético, el mapeo físico y la secuenciación de genomas podrían ayudar a elucidar la función de un gene, su regulación y su expresión bajo condiciones específicas (Peters et al., 2003), siendo estas herramientas una prioridad en los proyectos de análisis de genomas. Se plantea exponer en esta revisión los avances que se han logrado sobre la construcción de mapas genéticos y físicos en hongos fitopatógenos, y otras aplicaciones para estudiar y comprender el genoma de este tipo de microorganismos.

Mapas genéticos. Los mapas genéticos ayudan a entender la estructura, función y evolución del genoma y pueden ser una herramienta importante para la identificación de genes de interés (Jurgenson et al., 2002a). Los mapas genéticos muestran la localización relativa de marcadores específicos de DNA a lo largo de los cromosomas. Cuanto más cercanos estén dos marcadores, es poco probable que durante un proceso de recombinación genética se separen y lo más probable es que se hereden juntos en una población segregante (Jones et al., 1997). En los últimos años, los polimorfismos son revelados por técnicas moleculares, tales como los marcadores RFLP (polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción), RAPD (DNA polimórfico amplificado al azar), SSR (secuencias simples repetitivas) y AFLP (polimorfismos de la longitud de fragmentos amplificados), entre otras. Una característica que deben de tener este tipo de marcadores para ser utilizados en la construcción de un mapa genético, es que deben ser altamente polimórficos, es decir, deben existir formas alternativas (alelos) entre los padres para ser detectables entre los miembros de la progenie y que segreguen en una proporción 1:1. Para organismos haploides, el análisis de ligamiento es uno de los métodos básicos e indispensables en la genética clásica (Jones et al., 1997). El ligamiento puede definir las distancias genéticas entre algunos genes o loci polimórficos existentes dentro del genoma, las cuales podrían ser reconocidas como diferencias en apariencia de longitudes de fragmentos de restricción o secuencias de nucleótidos en un locus alélico (Jones et al., 1997 y Peters et al., 2003). Un mapa genético determina las distancias entre dos puntos, la cual es una medida de la frecuencia de recombinación entre los dos puntos. Los mapas se miden en términos de centimorgans (cM). Dos marcadores están a 1.0 cM si están separados por una frecuencia de recombinación del 1% (o una recombinación en 100 eventos de meiosis). Para llevar a cabo la construcción de mapas genéticos de hongos fitopatógenos, primeramente se lleva a cabo una selección de aislados compatibles sexualmente y principalmente que sean genéticamente diversos y / o que porten genes de interés, por ejemplo: genes de avirulencia/patogenicidad, locus MAT (grupo de compatibilidad, involucrados en la producción de alguna toxina). En organismos haploides, en una cruza entre aislados genéticamente distantes, las poblaciones segregantes o poblaciones F₁ que se obtengan podrían ser ricas en marcadores polimórficos, los cuales podrían usarse para generar un mapa genético detallado (Jurgenson et al., 2002a). Respecto a los estudios genéticos de algunos genes de resistencia a los fungicidas, Faretra y Pollastro (1996) determinaron los parámetros de segregación del locus MAT y genes involucrados para la resistencia a los fungicidas dicarboximida y benzimidazol en Botrytis cinerea Pers.:Fr. mediante el análisis de tétradas ordenadas. Sin embargo, para mapear dichos genes es necesario contar con una población segregante de 60 a 100 individuos aproximadamente, que tengan una segregación 1:1 y por último que mantengan un ligamiento con al menos un marcador de DNA. Por otra parte, Brown et al. (1996) mencionan que los genes para la resistencia a los grupos de fungicidas ethirimol, triadimenol y morfolinas son independientes, por consiguiente existen diferentes genes que controlan la respuesta de Blumeria graminis (DC.) Speer f. sp. hordei Marschal (Bgh) a los fungicidas antes mencionados. En base a lo anterior, es difícil llevar a cabo estudios para el mapeo de genes de resistencia a fungicidas, ya que será necesario mapear el gene o los genes involucrados para la resistencia para cada uno de los grupos químicos de fungicidas.

Mapas físicos. Un mapa físico es un arreglo ordenado de fragmentos de DNA, dentro de los cuales las distancias se expresan en unidades de distancias físicas (pares de bases). Un mapa físico usualmente comprende un arreglo de insertos de clones grandes ordenados, tales como bibliotecas BAC. Los mapas físicos pueden proporcionar información independiente de la información genética, pero tienen más valor si están ligados a marcadores genéticamente mapeados, y son mucho más importantes si están integrados con los datos de la secuencia del genoma (Meyer et al., 2004). Un mapa físico completo podría facilitar la clonación de genes por varios métodos, podría también proveer las bases para anclar y ordenar la secuencia expresada etiquetada (EST). El desarrollo reciente de la manipulación de fragmentos grandes de DNA y su clonación en levadura (biblioteca YAC: Cromosoma Artificial de Levadura = Yeast Artificial Chromosome = ) o bacteria (biblioteca BAC), son herramientas poderosas para la generación de mapas físicos. Por otra parte, las características del genoma en términos del número y tamaño de cromosomas obtenidos por separación en geles de campo pulsante (PFGE) se conocen como el cariotipo electroforético. Con la ayuda de la técnica de PFGE se puede realizar la separación de DNA de tamaño cromosomal (Mills y McCluskey, 1990; Zolan, 1995). La metodología de PFGE se ha aplicado para mapear genes sobre un cromosoma en particular y correlacionarlos con algún grupo ó grupos de ligamiento (GL) (Luo et al., 2005). En casos donde una sonda de un gene está disponible, por ejemplo: DNAr (DNA ribosomal), âtub (â-tubulina), sodl (superóxido dismutasa), niaD (nitrato reductasa), Skn-7 (histidina kinasa 7) y ops (opsina), el análisis tipo Southern Blot se puede usar para identificar el cromosoma en el cual el gene reside (Mills y McCluskey, 1990). En varios hongos fitopatógenos, el análisis de su cariotipo ha sido aplicado y su tamaño de genoma se ha determinado con más precisión (Cuadro 1), generando información importante sobre la variación en el número y tamaños de los cromosomas, dentro y entre especies, así como también en las aplicaciones en el mapeo de genes y su clonación (Zolan, 1995). Una aplicación basada en el desarrollo de un mapa genético, es la correlación con bandas (cromosomas) específicas en el cariotipo electroforético mediante la hibridación, usando sondas específicas de marcadores encontrados en un GL en particular (Zolan, 1995) y así poder correlacionar el mapa genético con el mapa físico, dando la facilidad de identificar marcadores de DNA cercanos a un gene de interés (< 2 cM). Los mapas físicos proveen virtualmente un número ilimitado de marcadores de DNA de una región específica de cualquier cromosoma, lo cual permite el etiquetado de genes, su aislamiento y su manipulación. Los mapas físicos también proveen una fuente importante de información para realizar estudios en la estructura molecular del genoma, su organización y evolución, la regulación de un gene y sus interacciones. El interés es desarrollar mapas genéticos densos y culminar en mapas físicos, en donde los genes o marcadores están localizados en una posición precisa de secuencia. Como resultado, la definición de la secuencia y función de un gene puede realizarse durante un período de 4 años y en algunos casos dependiendo del tamaño del genoma se requerirá de más tiempo.

Mapas genéticos y físicos de genomas de hongos fitopatógenos. A continuación se describen los avances de investigación obtenidos a la fecha sobre la construcción de mapas genéticos, la determinación del cariotipo electroforético, la determinación del tamaño de genoma, y la construcción y caracterización de bibliotecas BAC en hongo fitopatógenos (Fig. 1). El mapeo genético se inició en busca de los genes de avirulencia, de la patogenicidad y el locus MAT, así como también de los genes que están involucrados en la producción de alguna toxina, en la producción de pigmentos, en los grupos ínter estériles y con genes específicos de hospedero (Cuadro 1). En algunos casos se mencionan los resultados sobre la comparación entre mapas genéticos y mapas físicos, las aplicaciones hacia el mapeo y clonación de genes de avirulencia, así como estudios de genómica comparativa mediante el análisis de bibliotecas BAC.

Blumeria graminis f. sp. hordei. Este hongo, agente causal del oídium o moho de la cebada (Hordeum vulgare L.), es un parásito biotrófico obligado. Los primeros trabajos sobre el mapeo genético de genes de avirulencia en este organismo los iniciaron Christiansen y Giese (1990); ellos analizaron la segregación de 31 marcadores RFLP y tres genes de avirulencia (Avrla10, AvrIc y Avrlh) en una población obtenida por la cruza entre el aislado C15 de Escocia obtenido en 1964 y el aislado TY4 de Dinamarca obtenido en 1978, los cuales difieren en el nivel de avirulencia en 8 de los 14 loci de avirulencia. Estos análisis arrojaron un mapa de 7 GL con una longitud de ~326 cM, en dos GL se encontraron los genes de avirulencia. En otro estudio posterior, se analizó una población segregante de una cruza entre los aislamientos C15 y JEH31 (aislado de Dinamarca en 1972), difiriendo en siete genes de avirulencia. Éstos se analizaron con marcadores AFLP, RFLP, así como también el locus MAT y siete genes de avirulencia (Avr_a2, Avr_a3, Avr_a6 , Avr_a7, Avr_a10, Avr_a22 y Avr_k1 ). Un total de 359 loci fueron mapeados y todos los genes de avirulencia. Con estos resultados se pudo construir un mapa genético de 34 GL cubriendo una longitud total de 2114 cM; se determinó que un gene de avirulencia fue fuertemente ligado a marcadores moleculares, lo que lo hace apropiado para realizar la clonación basada en el mapeo (Pedersen et al., 2002a). Por lo anterior, Pedersen et al. (2002b), llevaron a cabo la construcción de una biblioteca BAC del aislamiento C15. Su análisis mostró un alto contenido de secuencias repetitivas, dificultando la construcción de contigs (clonas BAC traslapadas). Sin embargo, la biblioteca BAC permitió identificar el tamaño del genoma de B. graminis, el cual fue de 100-160 Mb. También se desarrollaron dos contigs, los cuales contenían dos loci de avirulencia (Avr_a6 y Avr_a22). Se desarrollaron marcadores de polimorfismos de nucleótidos simples (SNP) de secuencias de extremos BAC para ligar los contigs al mapa genético previamente reportado por Pedersen et al. (2002a). Posteriormente, dos contigs BAC de B. graminis se utilizaron para llevar a cabo estudios de microsintenia con Neurospora crassa Shear y Dodge y Aspergillus fumigatus Fresen. Un dato importante de estas comparaciones, es que algunos genes ortólogos de N. crassa fueron correspondientes a B. graminis. La biblioteca BAC en combinación con los mapas genéticos provee herramientas invaluables para el aislamiento de genes de avirulencia de B. graminis y para el estudio de sintenia con otros hongos.

Didymella rabiei (Kovachevski) (anamorfo: Ascochyta rabiei Pass. Labr.). D. rabiei es un hongo necrotrófico que causa el tizón por Ascochyta del garbanzo (Cicer arietinum L.), el cual es una de las enfermedades más importantes de este cultivo a nivel mundial. Existe poca información sobre los factores genéticos involucrados en la interacción hospedero-patógeno, por lo que Lichtenzveig et al. (2002), desarrollaron un mapa genético a partir del análisis genético de la progenie obtenida de la cruza entre un aislado de A. rabiei originario de Estados Unidos (ATCC76501) y otro de Siria (AA13), difiriendo en su agresividad. Se mapearon cincuenta marcadores de los cuales 36 fueron huellas génicas de DNA amplificado (marcadores DAF) y 14 marcadores SSR. El mapa genético estuvo comprendido por diez GL y tuvo una longitud de 261.4 cM. Sin embargo, en un estudio posterior Phan et al. (2003), desarrollaron otro mapa genético de este hongo, cruzando el aislado ATCC76502 MAT 2 de Estados Unidos con VIC0013 MAT 1 de Australia. Ellos emplearon 126 marcadores de DNA, de los cuales 69 fueron marcadores RAPD, 46 fueron marcadores AFLP, 10 fueron marcadores SSR, y uno SCAR. Se caracterizaron dieciocho GL mayores y 10 GL menores, mientras que el locus MAT (de apareamiento) fue mapeado. El mapa tuvo una longitud de 1271 cM y un promedio de distancia entre marcadores de 15.1 cM. Desafortunadamente, los dos mapas no pueden ser integrados ya que solamente dos marcadores SSR fueron comunes para ambos mapas. Por otra parte, Akamatsu y Peever (2005), reportaron el cariotipo electroforético de A. rabiei. Ellos usaron una colección mundial de A. rabiei y Ascochyta spp. incluyendo A. fabae Speg., A. lentis Vassiljevsky, A. pisi Lib. y A. viciae-villosae Ondrej. El cariotipo electroforético de 45 aislados de A. rabiei originarios de 19 países mostró de 10-14 cromosomas y un tamaño estimado del genoma de 20.5 a 30.5 Mb.

Fusarium oxysporum Schlechtend.: Fr. f. sp. lycopersici (Sacc.) W.C. Snyder y H.N. Hansen. El hongo F. oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) es el agente causal de la marchitez del tomate (Lycopersicon esculentum Mill.). El ciclo sexual de este patógeno no se ha observado en campo. Los aislamientos de Fol se clasifican dentro de razas fisiológicas y grupos vegetativamente compatibles (VCGs). Tres razas fisiológicas se distinguen por su virulencia diferencial sobre cultivares de tomate conteniendo diferentes genes de resistencia dominantes. Por lo anterior, para mapear genes de avirulencia en este hongo, una población generada a partir de cruzas parasexuales se desarrolló de dos aislados, uno de la raza 1 (aislado Fo1004), conteniendo el gene de avirulencia A1 y el otro de la raza 3 (aislado Fo1029), conteniendo A3. Ambos aislados fueron transformados con el gene de la resistencia a fleomicina (ble) y el gene de la resistencia a higromicina (hph), respectivamente. Se llevó a cabo la fusión de protoplastos y la progenie obtenida se seleccionó por la presencia de ambos genes de resistencia a los antibióticos mencionados. Se obtuvieron un total de 32 productos fusionados; los resultados mostraron el intercambio de DNA parental, la recombinación y segregación de los genes de avirulencia (Teunissen et al., 2002). Se emplearon marcadores AFLP con una técnica modificada, la cual combina un oligonucleótido específico al retotransposon Foxy (el cual está presente y es altamente variable dentro del genoma de Fusarium) con adaptadores de oligonucleótidos standard. Esta metodología se utilizó para construir un mapa genético de Fol. Los análisis de ligamiento revelaron 23 GL usando 83 marcadores Foxy-AFLP (Teunissen et al., 2003). A la fecha, este es el único mapa creado en base a la fusión de protoplastos de un hongo fitopatógeno.

Gibberella moniliforme Wineland (anamorfo: Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenberg). El primer trabajo sobre la construcción de un mapa genético en G. moniliforme se realizó por Xu y Leslie (1996) quienes analizaron marcadores RFLP, dos genes auxotróficos (arg 1, nic 1), el locus MAT (matA+ / matA-), la esterilidad femenina (ste 1), la característica de espora muerta (Sk) y un gene gobernando la producción de la micotoxina fumosina B1 (fum 1). Usaron el aislado A00015 (produce fuml, matA+, Skk, arg 1, nic 1 y ste 1) y lo cruzaron con A04643 (no produce fum 1, matA-, Sks). Los análisis arrojaron 12 GL correspondiendo a los 12 cromosomas que fueron previamente identificados mediante el cariotipo electroforético (Xu et al., 1995). Los GL y los cromosomas fueron correlacionados mediante la técnica de Southern Blot entre marcadores apropiados RFLP de cada uno de los GL. Sin embargo, uno de los problemas que presentó este mapa fue su contenido significativo de huecos dentro de los GL, dificultando la localización rutinaria con precisión de algunos genes biológicamente importantes. Por lo tanto, usando la misma población segregante, Jurgenson et al. (2002b) expandieron el mismo mapa descrito por Xu et al. (1995), adicionándole 486 marcadores AFLP. El mapa genético resultante tuvo un promedio de intervalo entre marcadores de 3.9 cM y aproximadamente 21 kb / cM, por lo que se pudieron identificar marcadores AFLP en menos de 1 unidad de mapa del locus MAT y 2.5 cM del locus de sk; mientras que ocho marcadores AFLP estuvieron dentro de 8.5 cM del locus fum 1 . Estos resultados podrían ser útiles para la localización y clonación de genes de interés en este hongo.

Gibberella zeae (Schwein.) Petch. (anamorfo: Fusarium graminearum Schwabe). El hongo F. graminearum provoca varios tipos de enfermedades en diferentes cultivos agrícolas. Por ejemplo, en trigo (Triticum aestivum L.) y cebada causa la pudrición de la corona, en maíz (Zea mays L.) pudrición del tallo y de la espiga, y en clavel (Dianthus caryophyllus L.) la pudrición de la corona. Uno de los daños más importantes es cuando ocasiona la reducción de la calidad del grano de cebada, ya que los granos cosechados frecuentemente están contaminados con las toxinas nivalenol (NIV), deoxinivalenol (DON) y zearalenona. Jurgenson et al. (2002a) construyeron un mapa genético a partir del análisis de una cruza obtenida de dos mutantes complementarios de G zeae que no utilizan nitrato (nit), el aislado R-5470 originario del Japón (línea 6 que produce NIV) y Z-3639 de Kansas (línea 7 que produce DON). La progenie se analizó mediante marcadores AFLP, dando como resultado un total de 468 marcadores AFLP, los cuales se mapearon sobre nueve GL, obteniéndose una longitud total del mapa de 1300 cM con un promedio de intervalo de 2.8 unidades de mapa entre loci. Uno de los resultados mostró que algunos loci que gobiernan la cantidad y tipo de toxina (DON o NIV) se localizaron en los GL IV y I, respectivamente. También se demostró que el locus que gobierna el tipo de tricoteceno (DON o NIV) cosegregó con el gene TR15 (codifica para una tricodieno sintasa). Posteriormente, en otro estudio con la ayuda de este mapa se pudieron identificar loci asociados con la patogenicidad y agresividad de G zeae en trigo (Cumagun et al., 2004). Los resultados mostraron que la progenie segregó cualitativamente (61:38) para la patogenicidad:no patogenicidad, respectivamente. Las 61 progenie patogénicas mostraron que la cantidad de enfermedad inducida (agresividad) varió cuantitativamente. Enseguida, se pudo determinar que dos reproducibles loci de características cuantitativas (QTL = quantitative trait loci) para la agresividad fueron detectados en el GL I del mapa genético. En base a estos resultados, ahora puede ser posible entender las interacciones hospedero-patógeno, en base al análisis de agresividad de aislados que contenien los genes NIV y DON sobre un conjunto de variedades de trigo altamente resistentes. Así, el mapeo de los QTL de esas características de G. zeae podría identificar genes involucrados en las interacciones específicas entre el hospedero y el patógeno, y proveer información básica necesaria para el manejo del hospedero y poblaciones del patógeno dentro del agroecosistema de trigo (Cumagun et al., 2004). En un estudio reciente, Gale et al. (2005) construyeron un nuevo mapa genético para validar la información generada de la secuencia del genoma de F. graminearum. Ellos utilizaron el aislado PH-1 (de Michigan) que se utilizó para secuenciar el genoma, y lo cruzaron con el aislado 00-676 (de Minnesota). Se obtuvieron un total de 111 ascosporas, las cuales se analizaron para la segregación de 235 loci. Se determinó por estudio del cariotipo citológico, un número de cuatro cromosomas. Los marcadores genéticos consistieron de sitios de secuencias etiquetadas (STS), AFLP y otros marcadores. Se construyó un mapa genético con nueve GL, cubriendo una longitud de 1234 cM y anclando 99.83% de la secuencia del genoma. Los nueve GL y 22 secuencias de correlación ancladas de la secuencia pudieron ser ensamblados dentro de los cuatro cromosomas.

Leptosphaeria maculans (Desmaz.) Ces. y De Not. [anamorfo: Phoma lingam (Tode:Fr.) Desmaz.]. El hongo L. maculans es el agente causal de la pudrición seca o pierna negra de la colza (Brassica napus L.), la cual provoca pérdidas de más del 90% de la producción. En este patógeno se han realizado diferentes estudios para el mapeo genético y físico de su genoma. Tres mapas genéticos han sido reportados por varios grupos (Attard et al., 2002; Cozijnsen et al., 2000; Pongam et al., 1998), pero ninguno ha podido ser integrado con algún otro. El primer mapa se llevó a cabo utilizando dos aislados, PHW1245 avirulento y PHW1223 virulento sobre B. napus cv. Major. Se emplearon marcadores AFLP y se analizó el locus de avirulencia (alm1). El mapa genético arrojó nueve GL mayores y cinco GL pequeños menores conformados con al menos 3 marcadores cada uno. Dos marcadores AFLP fueron ligados al locus alm1, los cuales estaban a una longitud de 3.1 y 8.1 cM (Pongam et al., 1998). Estos datos muestran que la identificación de marcadores ligados al gene de avirulencia indican que la interacción diferencial está controlada por un solo gene (Pongam et al., 1998). En cambio, en otro estudio se llevó el análisis genético de la cruza entre el aislado C13 avirulento y M1 virulento sobre Brassica juncea (L.) Czernj. y J.M. Coulter. La población segregante se estudió usando marcadores AFLP, RAPD, el locus MAT y un locus confiriendo especificidad del hospedero (HS) por la habilidad de formar lesiones en B. juncea (Cozijnsen et al., 2000). Los resultados presentaron un mapa genético de 21 GL, el cual consistió de cinco GL pequeños y una longitud de 1520 cM. Mediante PFGE, los resultados mostraron que los aislados parentales tuvieron cada uno 16 cromosomas y un tamaño de genoma de 33.5 Mb. Se logró mapear físicamente a HS y el locus MAT dentro de los cromosomas cuatro y nueve, respectivamente, así como también a â-tubulina, cianida hidratasa, endopoligalacturonasa, celulasa 1 y celulasa 2 (Cozijnsen et al., 2000). Por lo tanto, el mapa genético y físico podría ser extremadamente útil como una base para futuros estudios de genética y genómica funcional de este hongo. Posteriormente, otro grupo de investigación realizó una cruza entre el aislado a.2 (Mat+, AvrLm1) y el H5 (Mat-, avrLm1) aislados de B. napus L. El mapa genético se obtuvo mediante el análisis de marcadores RAPD, secuencias simples repetidas internas (ISSR), AFLP y elemento repetitivo básico - reacción en cadena de la polimerasa (rep-PCR = repetitive-element-based-polimerase chain reaction); éstos produjeron 301 marcadores ligados, definiendo 18 GL de más de cinco marcadores cada uno de ellos. El locus AvrLm 1 se localizó dentro de un GL de 116.8 cM de longitud, compuesto de 14 marcadores, de los cuales siete están estrechamente agrupados alrededor del locus AvrLm1; estos marcadores fueron transformados dentro de regiones amplificadas de secuencias caracterizadas (SCARs), esto con la finalidad de realizar el proceso hacia la clonación de AvrLm1 usando la metodología de clonación posicional, mediante el análisis de una biblioteca BAC hecha de un aislado AvrLm1. Sin embargo, se observó que el locus blanco correspondió a un área deficiente de recombinación, la cual se determinó mediante el análisis en cruzas obtenidas in vitro. Como una alternativa, se eligió incrementar el número de eventos meióticos, por lo tanto, se analizaron aislados virulentos y avirulentos provenientes de diferentes campos en el cultivar que porta el gene de resistencia Rlm-1. Los resultados mostraron que existe un alto nivel de conservación de la región del genoma del locus AvrLm1 dentro de los aislados provenientes de distintos campos (Attard et al., 2002).

Magnaporthe grisea [(T.T. Hebert) Yaegashi y Udagawa] Marasas (anamorfo: Pyricularia oryzae T.T. Hebert)]. El hongo M. grisea es el agente causal de la mancha foliar o quemazón del arroz (Oryza sativa L.), una de las enfermedades más perjudiciales de este cultivo. Este hongo se ha considerado como un organismo modelo para estudios fitopatológicos. Se ha demostrado que M. grisea tiene un genoma pequeño (30 Mb) y cuenta con siete cromosomas (Romao y Hamer, 1992; Skinner et al., 1993; Sweigard et al., 1993). Además está genéticamente relacionado con otros hongos modelos no patógenos como N. crassa y Aspergillus nidulans (Eidam) G. Wint. En décadas pasadas, varios grupos de investigación llevaron a cabo estudios intensos en los cuales resultaron varios mapas genéticos de este hongo; se emplearon diferentes tipos de marcadores como RFLP, RAPD, SSR, secuencias de telómeros, la secuencia de DNA repetitivo nombrada "MGR586" y genes de avirulencia (Dioh et al., 2000; Farman y Leong, 1995; Kaye et al., 2003; Luo et al., 2005; Nitta et al., 1997; Romao y Hamer, 1992; Smith y Leong, 1994; Sweigard et al., 1993). Uno de los logros obtenidos fue que se pudo integrar la información generada de dos mapas genéticos y se obtuvieron siete GL correspondientes a los siete cromosomas del hongo (Nitta et al., 1997). Por consiguiente, el mapa genético obtenido del análisis de la progenie de la cruza entre Guy11 (MAT1-2) con 2539 (MAT1-1) reportado por Nitta et al. (1997), es el que ha servido para estudios posteriores como el mapeo de genes de avirulencia. El desarrollo de los mapas genéticos enM. grisea ha facilitado el mapeo de distintos genes de avirulencia y con la ayuda de la metodología de caminado cromosomal, se han clonado varios genes Avr (PWL2, AVR1-CO39, AVR-Pita y ACE1) (Bohnert et al., 2004; Farman y Leon, 1998; Orbach et al., 2000; Sweigard et al., 1995). Recientemente, Luo et al. (2005), construyeron un nuevo mapa genético de la cruza entre el aislado 84R-62B (MAT1-1) con Y93-245c-2 (MAT1-2). Se pudo determinar las localizaciones cromosómicas de tres genes de avirulencia (AvrPik, AvrPiz y AvrPiz-t), por medio de marcadores RAPD y RFLP seleccionados como sondas para hibridar por Southern Blots a los cromosomas parentales que fueron separados por PFGE. Los GL que contenían los genes AvrPiz y AvrPiz-t fueron asignados a los cromosomas 3 y 7, respectivamente; mientras que el gene AvrPik está localizado sobre el cromosoma del tamaño de 1.6 Mb en 84R-62B, sugiriendo que los tres genes de avirulencia residen sobre diferentes cromosomas. Por otra parte, en otro estudio se analizaron algunos clones de una biblioteca BAC del aislado 70-15 y fueron ensamblados dentro de 188 contigs cubriendo todo el genoma del hongo. Ciento veinte y tres de esos contigs se anclaron al mapa genético reportado por Nitta et al. (1997), empleando marcadores RFLP (Zhu et al., 1999). El cromosoma 7 (con un tamaño de 4.2 Mb) es hoy en día la porción del genoma más estudiada (Mitchell et al., 2003). La importancia de su estudio es que este cromosoma contiene el locus MAT (mat a o á) así como también 20 marcadores mapeados. Por lo anterior, Zhu et al. (1999), construyeron un mapa físico cubriendo > 95% del cromosoma 7 de M. grisea usando una biblioteca BAC, obteniendo una importante correlación entre el mapa genético y el mapa físico de este cromosoma (Mitchell et al., 2003). En un estudio realizado para determinar el nivel de sintenia (regiones de un set de genes ortólogos) entre una biblioteca BAC (aislado 4224.7.8) del cromosoma de M. grisea, con la información de las secuencias de los genomas de N. crassa, Candida albicans (C.P. Robin) Berkhout y Saccharomyces cerevisiae Gasp., se encontró que una región fue sinténica a una porción del genoma de N. crassa, en cambio no hubo sintenia con C. albicans y S. cerevisiae. La identificación de estas regiones conteniendo genes altamente conservados a través de dos géneros que han evolucionado independientemente induce muchas preguntas biológicas, como la función y la identidad de esos genes (Hamer et al., 2001). Un estudio importante realizado en M. grisea es la secuenciación de su genoma, usando el aislado 70-15 (Dean et al., 2005). El análisis de la secuencia del genoma demostró que presenta un gran y diverso grupo de proteínas secretoras, posee una extensa familia de proteínas G receptoras, varios nuevos genes asociados a la virulencia y una gran cantidad de enzimas involucradas en el metabolismo secundario (Dean et al., 2005), siendo éste el primer análisis detallado del genoma de un hongo fitopatógeno.

Otros hongos fitopatógenos. Tzeng et al. (1992), reportaron el uso de marcadores RFLP y cuatro marcadores fenotípicos (resistencia a cicloheximida, el locus MAT, la producción de la toxina Tox1 y nivel de patogenicidad) para construir el mapa genético de Cochliobolus heterostrophus (Drechs.) Drechs., agente causal del tizón foliar del maíz, usando el aislado Hm540 (tox1, MAT1-1 de Carolina del Norte) y el aislado B30.A3.R45 (TOX1, alb1,CyhR,MAT1-2). El cariotipo electroforético se determinó en los padres y en algunos individuos de la progenie, y se usaron sondas para detectar marcadores RFLP que hibridarían hacia algún cromosoma. Se detectaron de 15 a 16 cromosomas, 126 marcadores fueron asignados a cromosomas específicos y se confirmó el ligamiento entre 120 marcadores. Varios marcadores RFLP fueron ligados al locus Tox1 (Tzeng et al., 1992). Posteriormente, en otro estudio un mapa genético y el cariotipo electroforético fue desarrollado en Cochliobolus sativus (Ito y Kuribayashi) Drechs. Ex Dastur causante de varias enfermedades (tizón foliar y pudrición común de la raíz) de cebada y trigo. Usaron el aislado ND90Pr, el cual presenta alta virulencia al cv. Bowman de cebada y lo cruzaron con ND5883 que presenta un bajo nivel de virulencia. Se analizaron en la progenie obtenida marcadores AFLP, RFLP, el locus MAT y un gen condicionando alta virulencia a cebada cv. Bowman (VHv1). Los resultados arrojaron un mapa genético comprendido por 27 GL cubriendo una distancia de 1329 cM, y se determinó un número de 15 cromosomas estimándose un tamaño del genoma de 33 Mb. El gen de virulencia VHv1 co-segregó con seis marcadores AFLP que fueron mapeados sobre un GL. Por medio de la hibridación usando de dos a tres marcadores RFLP y AFLP de cada uno de los GL, 25 de los 27 GL fueron asignados a cromosomas específicos, mientras que el locus VHvl se localizó en un cromosoma de un tamaño de 2.8 Mb del aislado ND90Pr (Zhong et al., 2002). Otro de los patógenos estudiados a nivel de su genoma fue Pyrenophora teres f. sp. teres Drechs., causante de la mancha reticulada de la cebada, con el cual se obtuvo un mapa genético y el cariotipo electroforético. Ciento ocho marcadores AFLP fueron analizados para construir el mapa genético, el cual consistió de 15 GL y una longitud de 909 cM. El análisis del cariotipo electroforético reveló un mínimo de seis cromosomas con un tamaño del genoma de 23 Mb. Los datos de la respuesta de la infección causada por este patógeno se generó para la población analizada mediante inoculaciones de conidios de cada una de las progenies sobre cuatro líneas de cebada, las cuales mostraron una respuesta diferencial a los aislados usados como padres (Lai et al., 2005). Por último, el primer mapa genético reportado de un basidiomiceto fue hecho por Zambino et al. (2000) con el análisis de una población F₂ de Puccina graminis Pers.:Pers. tritici Eriks. y E. Henn., agente causal de la roya del tallo de trigo. Se mapearon 17 marcadores RAPD, 35 marcadores AFLP y ocho genes de avirulencia, y se logró construir un mapa genético compuesto por 7 GL con una longitud de 525 cM. Otro basidiomiceto estudiado fue Heterobasidion annosum (Fr.:Fr.) Bref. agente causal de la pudrición de la raíz en coníferas, siendo el patógeno más devastador del hemisferio Norte. Se construyó un mapa genético de la cruza entre dos aislados compatibles de los grupos ínter estériles S y P originarios de Norte América. Se obtuvo una progenie de 102 individuos, la cual se analizó con 358 marcadores AFLP. Los análisis de ligamiento mostraron 19 GL, conteniendo seis o más marcadores, los cuales cubrieron una longitud de 1468 cM; sin embargo, otros 70 marcadores AFLP fueron asignados a pequeños GL. Esos marcadores formaron otros 20 GL, por lo tanto, la longitud total del mapa fue de 2252 cM. Los loci para los dos genes ínter estériles (S y P) fueron localizados en el mapa, mientras que la segregación del locus MAT se analizó por retrocruzas entre la progenie con sus padres (Lind et al., 2005a). Sin embargo, el locus MAT no se pudo colocar en el mapa. Posteriormente, se mapearon QTLs para la patogenicidad sobre Pinus sylvestris L. Los análisis determinaron un QTL sobre el GL 15 y uno en el GL 20. Estos QTLs podrían ser identificados y caracterizados en estudios posteriores (Lind et al., 2005b).

Investigaciones realizadas en México. En el Centro de Investigación Científica de Yucatán (CICY), Mérida, se ha estudiado al hongo Mycosphaerella fijiensis Morelet, el cual causa la Sigatoka negra del plátano (Musa spp.), ocasionando pérdidas de un 30 a 40% en la producción de fruta. Su control se basa principalmente en la aplicación de fungicidas, cuya inversión implica hasta el 40% de los costos de producción. Se ha determinado el cariotipo electroforético de aislados provenientes de los Estados de Veracruz, Tabasco, Colima, Chiapas y Yucatán, el cual mostró de 8 a 13 cromosomas y el tamaño estimado del genoma fue de 35 Mb (Rodríguez-García et al., 2007). Por otra parte, se construyó y caracterizó una biblioteca BAC de un aislado proveniente del estado de Veracruz, la cual está conformada por 1,920 clonas, con un promedio de inserto de 90 kb (Canto-Canché et al., 2007). La construcción de un mapa genético de este patógeno se llevó a cabo con la colaboración del Dr. Jean Carlier del Centro de Cooperación Internacional para el Desarrollo de la Investigación Agronómica (CIRAD = Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement), Francia y la Dra. June Simpson del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV) del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Irapuato. Se llevó a cabo un estudio preliminar del análisis de una progenie F₁ generada por la cruza entre el aislado CIRAD86 (MAT1-1 + originario de Camerún, el cual se utilizó para secuenciar el genoma de este hongo) con el aislado CIRAD139A (MAT1-1 - originario de Colombia); luego, esta población se analizó con marcadores AFLP y marcadores SSR. Apoyándose en los resultados obtenidos de la segregación de los marcadores, se generó el mapa genético que consistió de 25 GL formados por cinco o más marcadores; el mapa estuvo conformado por 270 marcadores, de los cuales 257 fueron AFLP y 13 SSR; el mapa tuvo una longitud de 1083 cM (Manzo-Sánchez et al., 2005). Estos datos concuerdan con el mapa genético de Mycosphaerella graminicola (Fuckel) J. Schrót., agente causal del tizón foliar del trigo, en donde se cruzaron los aislados IPO232 (MAT1-1, aislado de Holanda) que es virulento sobre Veranopolis, Kavazva y Shafir con IPO94269 (MAT1-2, aislado de Holanda), el cual es avirulento a los cultivares antes mencionados; en este estudio se reportaron 23 GL y con una longitud del mapa de 1216 cM (Kema et al., 2002). M. graminicola es un hongo aparentado genéticamente a M. fjiensis, por lo que en un futuro se podría mapear el locus MAT, se podría examinar en una base de datos de 40,000 EST originados de M. fijiensis la presencia de SSR y desarrollar nuevos marcadores EST-SSR para su posterior mapeo, y por último, utilizar la información que pronto será generada de la secuencia del genoma para localizar genes de interés. Otro de los objetivos es la clonación del locus MAT de M. fijiensis, por lo que se llevó a cabo la clonación del gen DNA liasa, el cual se ha demostrado está cercano al locus MAT en varios hongos. Un fragmento de este gen fue amplificado con oligonucleótidos degenerados, luego fue clonado y secuenciado. Usando una estrategia de caminado, se logró el anclaje sobre el gene de DNA liasa, en base a esto se obtuvo una región de 7 kb, la cual se localiza hacia la caja HMG incluido en el idiomorfo MAT-2. Mientras que en otro aislado, se obtuvo una región de 5 kb, la cual incluye al idiomorfo MAT-1. La anotación de los genes está en progreso actualmente (Conde-Ferráez et al., 2005). En el CINVESTAV, Unidad Irapuato, se ha llevado a cabo el análisis del mapeo genético de genes de avirulencia del Deuteromiceto Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. y Magnus) Lams.-Scrib., agente causal de la antracnosis del frijol (Phaseolus vulgaris L.). Dos aislados de origen mexicano que difieren en al menos dos genes de avirulencia fueron cruzados para obtener una población F₁. Se obtuvo un mapa genético mediante el análisis de 167 marcadores AFLP, el cual presentó una longitud de 1923.3 cM y estuvo conformado por 34 GL, con una distancia promedio entre marcadores de 11.5 cM y una distancia máxima de 39 cM. Además, se pudo determinar que los genes de avirulencia Avrc1-Mex y Avrc1-To en los aislados usados como padres, segregan dentro de la progenie en forma independiente y en una proporción de 1:1. Hoy en día, este es el primer mapa genético que se reporta para alguna especie de Colletotrichum (Luna-Martínez et al., 2007).

 

CONCLUSIONES

La búsqueda de soluciones a los problemas causados por hongos fitopatógenos en los últimos años, se ha encaminado hacia el mapeo genético y físico, así como también la secuenciación completa de sus genomas. Las herramientas involucradas en el análisis de dichos genomas han surgido a partir de su amplio uso en otros organismos modelos. El mapeo se ha enfocado hacia la búsqueda de genes de interés, tales como los de avirulencia/patogenicidad, pero hasta la fecha, han sido pocos los que se han clonado. El mapeo físico ha permitido entender la composición física del genoma (tamaño y número de cromosomas), así como también el tamaño del genoma. También se han utilizado algunos genes [DNAr (DNA ribosomal), âtub (â-tubulina), sod1 (superóxido dismutasa), niaD (nitrato reductasa), Skn-7 (histidina kinasa 7), ops (opsina), entre otros y algunos marcadores que pertenecen a los grupos de ligamiento] como sondas para hibridar con algún cromosoma. La genómica comparativa, mediante el empleo de secuencias extremas de bibliotecas BAC, es una herramienta poderosa que permite entender los aspectos evolutivos entre los genomas de organismos de la misma especie y entre especies diferentes. Uno de los logros obtenidos recientemente es el análisis de la secuencia completa del genoma de algunos hongos fitopatógenos, el cual permite conocer los recursos moleculares con que cuenta el patógeno para poder invadir y provocar daños a su hospedero. Son pocos los estudios realizados sobre el mapeo en genomas de hongos fitopatógenos, los cuales se han enfocado en mayor proporción sobre Ascomicetos. Es importante implementar este tipo de metodologías para poder entender mejor el genoma de los hongos fitopatógenos que son potencialmente dañinos a cultivos de interés comercial en México.

 

AGRADECIMIENTOS

Al CONACYT por la beca otorgada a Gilberto Manzo-Sánchez (128982) para sus estudios de Doctorado y por el financiamiento al proyecto titulado Mapeo físico y genético del patógeno de plátano Mycosphaerella fjiensis (37602-B).

 

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