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Introducción
Los metales pesados son elementos como Pb, Hg, Cu, Ni, Cr, Tl, Se, Cd, Zn, Al, Br y As, con una densidad al menos cinco veces mayor a la del agua, se distinguen por su persistencia en el medioambiente (Tchounwou et al., 2012; Yuan et al., 2016). Por ser elementos de la corteza terrestre, no se pueden destruir ni degradar, su biodisponibilidad y toxicidad dependen completamente de su comportamiento químico (Bulgariu y Bulgariu, 2012; Pretorius et al., 2001). Aunque algunos metales pesados se consideran micronutrientes, la bioacumulación de estos contaminantes en los organismos vivos, puede causar serios efectos tóxicos y carcinogénicos aún en pequeñas dosis, por lo que encabezan la lista de sustancias tóxicas más peligrosas (Dippong y Mihali, 2016; Khalilova y Mammadov, 2016; Osunkiyesi et al., 2014; Zhiqiang, 2015).
Los metales pesados se encuentran de manera natural en la roca madre y se distribuyen a partir de interacciones geológicas como erosión y sedimentación o por medio de procesos biogeoquímicos (Acosta et al., 2010; Venkatramanan et al., 2015). Sin embargo, actividades antropogénicas como la minería, los procesos industriales y de urbanización, son los principales causantes de esta contaminación (Krami et al., 2013). Los metales tóxicos producidos por las actividades del hombre se acumulan en el aire y permanecen en él, en forma de partículas, las cuales pasan al suelo, a las aguas superficiales, a la flora y por lo tanto a la cadena alimentaria hasta llegar al organismo de las personas. (Vullo, 2003). Por lo tanto, la biodisponibilidad de los metales pesados representa un riesgo latente a la salud (Juozulynas et al., 2008; Yang et al., 2016), pudiendo afectar al sistema digestivo, nervioso e incluso se les relaciona con el cáncer, siendo los niños el grupo de edad más vulnerable a sus efectos (Benselhoub et al., 2015; Latif et al., 2014).
Uno de los metales que provoca mayores estragos a nivel mundial es el arsénico, debido a la alta toxicidad que representa su acumulación en agua, aire y suelo (Han et al., 2003). El arsénico puede ser absorbido como materia particulada de su forma química reducida arsenito (As III) y su forma oxidada arseniato (As V) (Mandal y Suzuki, 2002). Además, por su efecto metabólico, tras una exposición prolongada a dosis elevadas puede llegar a ser mortal (Flanagan et al., 2012).
En países como Chile, Taiwan, India y Bangladesh los niveles de arsénico en agua potable superan los 300 µg L-1, una cifra alarmante si consideramos que debería oscilar entre los 0.26‑0.83 µg L-1 (Jochem et al., 2016). La Norma Nacional Mexicana NOM-001-CONAGUA-(2011) solo permite 50 µg L-1 y el valor guía de la OMS establecido en 1993 indica 10 µg L-1 (Ali y Tarafdar, 2003; Ferdosi et al., 2016; Kumar et al., 2016; Wu et al., 2015). La problemática resulta igual de preocupante en el suelo, ya que éste es el principal proveedor de nutrientes para los organismos vivos y es la base de la producción humana (Deng et al., 2015). El arsénico en suelos se debe principalmente al uso de pesticidas a base de arsénico o el riego con agua contaminada (Banik y Sanyal, 2016).
Por años se han utilizado diferentes técnicas de remediación que consisten en el uso intencional de procesos de degradación químicos o físicos que intentan reducir la toxicidad, movilidad o volumen de sustancias contaminantes en el ambiente (Lim et al., 2014). Procesos como la electrocinética, el lavado de suelos, la extracción por solventes y vapores, las técnicas químicas que utilizan peróxido de hidrógeno y de ozono; e incluso las metodologías físicas como la precipitación, la adsorción, la filtración de membrana u ósmosis inversa son alternativas utilizadas actualmente para la remoción de As de suelo y agua (Drewniak et al., 2015; Jahan et al., 2006; Vullo, 2003). Sin embargo, estas técnicas presentan algunas dificultades como son los costos elevados o el requerimiento de una gran cantidad de permisos gubernamentales para aplicarlas, además, si no son suficientemente específicas pueden resultar contraproducentes en presencia de otros metales (Volke-Sepúlveda y Velasco-Trejo, 2002).
Por lo anterior, el desarrollo de nuevas metodologías de remediación se ha intensificado desde las últimas dos décadas y dio origen a una nueva rama para la eliminación de xenobióticos del medio ambiente más rentable efectiva y menos dañina: la biorremediación (Jahan et al., 2006; Das Sharma et al., 2016; Dzionek et al., 2016). La biorremediación se basa en la capacidad natural que tienen algunos microorganismos para incorporar contaminantes en sus procesos metabólicos y utilizarlos como fuente de energía o carbono (Mosa et al., 2016; Dzionek et al., 2016). Tal es el caso de algunas bacterias sulfatorreductoras de los géneros Aspergillus, Pseudomonas, Bacillus y de algunas microalgas, que han demostrado tolerar altas concentraciones de metales pesados o incluso requerirlos para sus procesos biológicos (Mehrotra et al., 2016; Hema et al., 2014; Jiang y Fan, 2008; Araie et al., 2009).
Desde hace años se han aislado microorganismos de ambientes contaminados con arsénico, que son capaces de asimilarlo a través de sus rutas metabólicas logrando un efecto detoxif icador (Kruger et al., 2013), estudios recientes se han enfocado a aumentar la capacidad de los microorganismos para resistir al arsénico a través del uso de ingeniería genética (Lorenzo et al., 2016), de manera que se podrían diseñar microorganismos más eficientes como estrategia de biorremediación. Aunque existen bacterias con la capacidad de metabolizar el arsénico, los organismos genéticamente modificados pueden detoxificar el arsénico de forma más eficiente y ecológica (Rangel-Montoya y Balagurusamy, 2015; Yang et al., 2016).
En varias ciudades de Chihuahua, México, se han encontrado altas concentraciones de arsénico en suelos y en el agua de consumo, que sobrepasan la norma oficial hasta 14 veces (Benavides et al., 2008), esta situación debe ser tratada inmediatamente. Por su situación climática, el estado de Chihuahua es susceptible a cambios constantes en el pH o temperatura del agua y el suelo, lo que dificulta la aplicación de técnicas de biorremediación con cepas bacterianas comunes es por ello que la ingeniería genética se considera una opción prometedora para la obtención de microorganismos resistentes a altas temperaturas, con mayor capacidad de resistencia a metales pesados de los que se pueden obtener proteínas recombinantes que favorezcan etapas específicas para la biorremediación de sitios contaminados, como lo es la modificación en el estado de oxidación del arsénico. Es por ello, que el objetivo de esta revisión consiste en brindar una visión general sobre la biorremediación del arsénico y algunas estrategias desarrolladas con microorganismos silvestres ó genéticamente modificados, enfatizando la importancia de la enzima arsenito oxidasa como estrategia para la detoxificación de arsénico(III) por ser su mecanismo de acción uno de los más comunes y efectivos presentes en bacterias, lo anterior con el f in de proponer esta alternativa como una herramienta clave para solucionar la problemática detectada en el estado de Chihuahua.
Formas del arsénico
El arsénico es el 52º elemento en abundancia de la corteza terrestre con 2 ppm (5 × 10−4%), es un elemento distribuido ampliamente en la atmósfera, en la hidrosfera y en la biosfera. Los estados de oxidación que lo caracterizan son As(III) y As(V) y, con menos frecuencia, As(0) y As(-III) (Bundschuh et al., 2008; Castro de Esparza, 2006)1.
En el suelo se encuentra comúnmente en la superficie combinado con S o metales como Mn, Fe, Co, Ni, Ag o Sn. “El principal mineral del As es el FeAsS (arsenopirita, pilo); otros arseniuros metálicos son los minerales FeAs2 (löllingita), NiAs (niccolita), CoAsS (cobalto brillante), NiAsS (gersdorfita) y CoAs2 (esmaltita)” (Bundschuh et al., 2008). En agua, el arsénico se encuentra formando oxianiones el As(V) aparece como H3AsO4 y sus correspondientes productos de disociación mientras que el As(III) aparece como H3AsO3 y sus correspondientes derivados protolíticos (Bundschuh et al., 2008) (Nava-Ruíz y Méndez-Armenta, 2011).
El estado de oxidación del arsénico y su movilidad, se controla fundamentalmente por el potencial redox y el pH. Tanto el As(V) como el As(III) son móviles en el medio, aunque este último es el estado más móvil y de mayor toxicidad. Los compuestos de arsénico pueden sorberse o desorberse de partículas, y cambiar de estado de oxidación fácilmente al reaccionar con oxígeno o con otras moléculas del aire, agua o suelo, o por la acción de microorganismos (Castro de Esparza, 20061; Nava-Ruíz y Méndez-Armenta, 2011).
El arseniato [As(V) ] es la especie arsenical más difundida en el medioambiente (60%), y la mayoritaria en agua y suelos. El arsenito [As(III) ] es la forma inorgánica reducida y está presente en una menor cantidad (20%); sin embargo, es de 25 a 60 veces más tóxica que la forma oxidada, arseniato. La dosis letal (DL50) de arsénico(III) es menor que la que presenta la DL50 del arsénico(V) inorgánico y esta a su vez menor que la del arsénico(V) orgánico (Cuadro 1), esto debido a la toxicidad que cada especie de arsénico posee (Litter, 2010; Pacheco-González et al., 2013; Fernández-Sanz, 2015)2.
Estrategias de biorremediación de arsénico con el apoyo de ingeniería genética
Se ha demostrado que cepas de Corynebacterium glutamicum genéticamente modificadas pueden acumular 100 veces más arsénico que las cepas nativas (Villadangos et al., 2014). C. glutamicum es un microorganismo Gram positivo saprófito con alta resistencia al arsénico, en el cual se ha podido potencializar la entrada de arsénico y evitar su escape a través de modificaciones de genes que codifican para permeasas como el gen glfF (Feo et al., 2007; Mateos-Delgado, 2011).
C. glutamicum se ha modificado genéticamente para hacer que la bacteria funcione como un bioacumulador, con el silenciamiento de los genes arsB/acr3 codificantes para las vías de salida de As III (Mateos et al., 2006). En tanto el gen arsB codifica para una proteína transportadora que se encarga del intercambio iónico con el metaloide (Meng et al., 2004) y el gen acr3 codifica para un transportador, los dos sirven para exportar arsenito fuera de la célula. También al eliminar cgacr3-1 y cgacr3-2, que codifican para los sistemas responsables de la extrusión del As III. Además se han sobre expresado los genes cdglpF y scglpF de Corynebacterium diphtheriae y Streptomyces coelicolor, respectivamente, que codifican para los transportadores de As III (Villadangos et al., 2014).
Otra opción es la eliminación del gen arsR, que codifica para una proteína que es un represor transcripcional, permitiendo la expresión de los tres componentes: 5’arsR-arsB-arsC3’ del operonars, que da resistencia al arsénico ya que lo detoxifica (Mateos-Delgado, 2011).
Estas modificaciones demuestran que es posible trasformar genéticamente una bacteria y hacerla tolerante a altas concentraciones de arsénico y por lo tanto una posible opción de biorremediación.
Arsenito Oxidasa, Estructura y Localización
Los mecanismos de oxidación, reducción y metilación del arsénico en bacterias son probablemente una respuesta evolutiva y adaptativa debida a la ubiquidad global del arsénico y sus formas alotrópicas; se sabe que existen clústers genéticos responsables de estas respuestas, pero muchos no han sido identificados (Pandey y Bhatt, 2016).
Los genes de resistencia a arsénico están organizados generalmente en operones, siendo los más representativos los formados por unidades transcripcionales de tres (arsRBC) o cinco genes (arsRDABC). El operón de 3 genes expulsa arsenito de las células, el compuesto por 5, codifica para una arseniato reductasa que se encarga de reducir arseniato a arsenito. Existe otro gen conocido como arsA reportado en E. coli R773 y R47 que codifica para una ATPasa intracelular y arsD que codifica para una chaperona de arsénico (facilita la salida de arsenito por la bomba ArsAB) (Carlin et al., 1995).
Otro ejemplo es el clúster que codifica para la enzima arsenito oxidasa (AOX), una enzima periplasmática que transforma el As (III) a As (V). Consta de dos subunidades, la subunidad pequeña aoxA (también llamada aioB / aroB / asoB) y la subunidad grande y catalítica aoxB (también llamada aioA / aroA / asoA) (Lett et al., 2012; Ellis et al., 2001; Pacheco-González et al., 2013). aoxB tiene una estructura relacionada con la superfamilia de dimetilsulfóxido reductasa (DMSO), que tiene un centro de molibdeno y un centro de [3Fe4S] (Graham et al., 1999; Prasad et al., 2009). Actualmente se clasifica como del tipo Molibdeno-bis Piranopterin Guanosin Dinucleotido (Mo-bisPGD por sus siglas en inglés) (Duval et al., 2016). La subunidad pequeña (Aoxa) con un centro de [2Fe-2S], es una proteína Rieske que desempeña un papel en la transferencia de electrones de As III a un citocromo o azurina y cuenta con un péptido señal TAT para el transporte de la enzima hacia el citoplasma (Anderson et al., 1992; Duval et al., 2010; Muller et al., 2003). En 1992 se purificó la primera arsenito oxidasa de Alcaligenes faecalis, pero los genes que codifican para AOX se identificaron por primera vez en Herminiimonas arsenoxydans (Anderson et al., 1992; Lièvremont et al., 2009; Kang et al., 2012). Desde entonces, muchas alfa, beta y gama proteobacteria, crenarchaeota y Deinococcus Thermus se han estudiado debido a la relación filogenética de sus enzimas AOX (Lebrun et al., 2003; Muller et al., 2003, 2006).
Por su capacidad de asimilación de metales como Se, Mn, Cr, Cd, Sb, Ni y As la bacteria Herminiimonas arsenicoxydans (antes ULPAs1) se ha estudiado ampliamente como organismo modelo (Muller et al., 2006). Pacheco González et al. (2013) describen el mecanismo de oxidación del arsenito por AOX el cual consiste en la introducción de As III a través de un orificio cónico presente en su superficie hacia el sitio de unión con el sustrato dentro de la enzima. El par de electrones del arsénico se encargan del ataque nucleofílico sobre el grupo Mo = O en el centro de molibdeno oxidado. Esta reacción produce molibdeno reducido (VI) mediante la unión coordinada del producto (arseniato) con el metal. La reacción oxidante del ciclo catalítico se completa por la disociación de los productos de la esfera de coordinación de molibdeno para generar la enzima reducida en la estructura cristalina. A partir de ese sitio, los electrones se transfieren a un citocromo o azurín (González et al., 2013; Rangel Montoya et al., 2015).
Aún cuando el sistema de oxidación del arsenito no ha sido descifrado completamente, se sabe que el operón aoxAB es regulado por controles transcripcionales. También responde a señales “quorum sensing” que pueden ser emitidas por genes lux o un sistema de dos componentes, donde una proteína transmembranal o dominio receptor recibe un estímulo extracelular (como la exposición al arsénico) y se fosforila de modo que un dominio activo permita la activación del gen (Slyemi et al., 2013; Kang et al., 2012; Barba-Ostria, 2014).
Las herramientas bioinformáticas han favorecido el estudio de los genes de la arsenito oxidasa, permitiendo determinar las similitudes y relación filogenética de varios microorganismos que poseen la enzima; por ejemplo, mientras que el gen aoxB de Agrobacterium spp. TS43, y el de Agrobacterium tumefaciens tienen un 95% de identidad, los genes de Alcaligenes faecalis NCBI 8687 y Pseudomonas sp. TS44 tienen solo 61% de similitud; se cree que todas estas discrepancias se deben a los genes involucrados en funciones complementarias de transporte, o el control transcripcional de AOX. Los mecanismos más complejos de la enzima pudieron haber sido adquiridos a través de la transferencia horizontal de genes (Van Lis et al., 2012; Muller et al., 2003; Kang et al., 2012). En el Cuadro 2 se muestran generalidades y características de algunas bacterias mencionadas a lo largo de este texto en los que se ha comprobado una actividad arsenito oxidasa.
A nivel genético, algunos de los genes que dan lugar a la enzima arsenito oxidasa aún son poco conocidos, sin embargo, se han identificado algunos con funciones muy específicas que se presentan en la Cuadro 3.
Como se ha dicho, la enzima arsenito oxidasa es crucial para la transformación de arsénico debido a que está presente en un amplio número de bacterias, de ahí que surja la necesidad de conocer tanto su mecanismo de acción como su estructura y genes involucrados, de manera que se pueda determinar que mecanismos nativos sería conveniente modificar y de qué manera resultaría más efectivo.
Perspectiva
El mecanismo de la enzima arsenito oxidasa es aceptado como herramienta en el proceso de biorremediación. El estudio de los microorganismos que poseen este sistema es el primer paso para determinar cuáles son más efectivos y a partir de ahí explorar las técnicas de ingeniería genética que permitirían potenciar su actividad y usarse in situ o bien obtener una enzima recombinante que juegue un papel importante en el proceso de biorremediación. Lo que falta por conocer es cómo actuaría dicha proteína, de modo que tras su obtención desde diferentes organismos, se realice un análisis comparativo bajo las mismas condiciones. Luego, tras la expresión proteica, su exposición a ambientes con arsénico y la cuantificación de su actividad enzimática, se podría determinar la eficiencia de remoción del contaminante respecto al tiempo y velocidad de tal actividad.
Conclusiones
El arsénico es un metaloide muy peligroso que causa daños al ambiente y a la salud de los seres vivos, por el riesgo que representa su detoxificación es de vital importancia. La biorremediación se considera una solución eficiente, económica y factible para la remediación de metales pesados. Debido a la gran diversidad de bacterias que de manera natural poseen genes relacionados con la detoxificación de arsénico y a la eficiencia que han demostrado, la ingeniería genética resulta una herramienta prometedora para potencializar esa actividad natural. Integrar los genes aox, en microorganismos conocidos y realizar experimentos de remoción y toxicidad es una propuesta viable para conocer a fondo el funcionamiento de esta enzima, y comprobar científicamente si el mecanismo de oxidación del arsénico puede ser tomado en cuenta como una forma de disminuir la contaminación por arsénico en cualquier sitio contaminado, esta acción debe realizarse pronto pues podría ser una etapa importante para el proceso de biorremediación.
