Selección y caracterización de HMA nativos

Con el fin de aislar los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) nativos de suelos cultivados con plantas de caña para panela, se realizó un muestreo de suelo rizoférico, en la hoya del Río Suárez, que comprende los departamentos de Boyacá, Cundinamarca y Santander. Se tomaron muestras en 23 fincas de producción de caña para panela, en cada una de las cuales se tomaron entre dos y tres muestras, dependiendo de la heterogeneidad del cultivo en términos de variabilidad topográfica y suelo según el caso. Cada muestra se conformó por cinco submuestras tomadas a lo largo de un surco.

Las muestras de suelo y raíz fueron analizadas en el laboratorio de microbiología agrícola de Agrosavia, con el fin de identificar las poblaciones de HMA, que de forma natural se presentan en suelos mediante la técnica de tinción diferencial con azul de tripán de ^{Phillips y Hayman (1970)}, esta metodología permite identificar dentro de la raíz estructuras típicas del HMA como hifas, esporas, vesículas y arbúsculos y determinar el porcentaje de colonización de raíz.

Para la caracterización morfológica de las muestras de suelo se obtuvieron esporas mediante la técnica de tamizado húmedo y decantación propuesta por ^{Gerdemann y Nicolson (1963)} y posteriormente se montaron en portaobjetos con alcohol polivinílico-ácido láctico glicerol (PVLG) o PVLG mezclado con reactivo de Melzer’s en proporción 1:1 (v/v) (^{Sieverding, 1991}) y se dejaron secar por 24 horas a temperatura ambiente para su observación al microscopio. Se realizó la identificación de esporas de HMA a nivel de género con base en caracteres morfológicos de la espora como: formación de tipo de espora (glomoide, acaulosporoide, entrophosporoide, gigasporoide y scutellosporoide), formación de esporocarpo, tamaño y color; estructura y tinción de paredes, así como características de germinación. Se utilizaron claves de clasificación de ^{Schenck y Pérez (1990)} y del INVAM (International Culture Collection of Arbuscular and Vesicular-Arbuscular Mycorrhizal Fungi) así como publicaciones científicas que dan soporte en la clasificación a nivel de género y especie (^{Blaszkowski, et al., 2006}, ²⁰⁰⁸; ^{Redecker et al., 2013}; ^{Sieverding et al., 2014}).

Los HMA son simbiontes obligados y por lo tanto requieren de la asociación con una planta hospedera para completar su ciclo de vida, con el fin de multiplicar los propágulos infectivos de HMA (esporas, hifas, raíces colonizadas), cada una de las muestras colectadas, fue tomada como inóculo inicial para un proceso de multiplicación y escalamiento de HMA en invernadero con macetas de 500 g, utilizando plantas de sorgo y caléndula como hospederos. Después de tres meses las plantas fueron sometidas a estrés hídrico con el f in de tener material suficiente para las evaluaciones en vivero.

Evaluación de la inoculación de plantas de caña con HMA en etapa de vivero

Las muestras que presentaron mayor contenido de esporas y mayor porcentaje de colonización fueron mezcladas por región y se obtuvieron tres inóculos de HMA nativos de Cundinamarca (127.5 esp/10 g, 21% colonización en raíz), Boyacá ( 82.3 esp/10 g, 7.5 % colonización en raíz) y Santander ( 182.5 esp/10g, 9.5% colonización en raíz), éstos fueron incorporados en un experimento desarrollado en el centro de investigación Cimpa-Agrosavia (Barbosa, Santander-Colombia; 5° 56’ 50.79” N y 73° 36’ 24.14” O), a 1574 m de altitud.

El experimento se estableció bajo un diseño de bloques completamente al azar, con tres repeticiones, nueve unidades experimentales por tratamiento en tres variedades (CC93-7711, CC93-714 y CC93-7510), cada variedad se evaluó como un ensayo individual. Se evaluaron 11 tratamientos de la siguiente manera: del T1 al T3, fueron inoculados con HMA nativos de los departamentos de Cundinamarca, Boyacá y Santander respectivamente; T4 y T5 fueron inoculados con diferentes HMA pertenecientes a la colección de trabajo de Agrosavia; T6 a T8 se inocularon con productos comerciales de HMA, y de T9 a T11 fueron tratamientos testigos con fertilizaciones de 10, 50 y 100%. Las plantas se fertilizaron con urea, de acuerdo a las recomendaciones hechas por el Cimpa-Agrosavia en la etapa de vivero. La concentración de esta aplicación consiste en una relación de 5 gramos de urea por litro de agua en este caso el testigo con el 100% de fertilización tiene dos aplicaciones semanales, los tratamientos inoculados con HMA y el testigo con el 50% de fertilización tuvo solo una aplicación semanal y el testigo con el 10% se dio una aplicación mensual (Cuadro 1).

Se realizó un muestreo a los 90 días después del trasplante (ddt) para las tres variedades, donde se analizó altura de las plantas, diámetro de cuello del tallo cuantificación de esporas de HMA y porcentaje de colonización de HMA en raíz.

Análisis estadístico

Los datos fueron analizados estadísticamente mediante análisis de varianza (alfa = 0.05). El análisis incluyó pruebas de normalidad, pruebas de igualdad de varianza y prueba de comparación múltiple de Tukey, con sus respectivas diferencias estadísticas en caso de presentarse (las letras diferentes indican diferencias significativas (P ≤ 0.05) entre los tratamientos), se utilizó el programa Statistix 9.0 ®.

Selección y caracterización de HMA nativos

Se colectaron 72 muestras en total, en Cundinamarca fueron 22 en 8 fincas y 50 en 15 fincas de la Hoya del Río Suárez (Boyacá y Santander). En el Cuadro 2 se presenta la información principal de cada una de las f incas muestreadas y su georeferenciación. La altitud de las fincas muestreadas en los tres departamentos varía entre 799 y 1735 m, con promedio de 1344 m. En el departamento de Cundinamarca la altitud promedio fue de 1040 m, en Boyacá de 1586 m y 1450 m en Santander.

Las muestras tomadas en cada una de las fincas fueron analizadas en términos de las poblaciones de HMA y su capacidad para asociarse naturalmente con plantas de caña. En términos generales se destaca que, en todas las muestras analizadas en los tres departamentos hay presencia de comunidades de HMA nativas y que éstas en mayor o menor grado dependiendo de la muestra tienen la capacidad de establecer una relación simbiótica con el cultivo (Figura 1). Es importante resaltar que las muestras de suelo de la localidad de Santander presentaron mayor contenido de esporas (182.5 esp/10 g) (Figura 1a) y las muestras de raíces de la localidad de Cundinamarca presentaron mayor porcentaje de colonización (21%) respecto a las otras localidades (Figura 1b). Se presentaron estructuras de hifas, vesículas, esporas y arbúsculos de HMA (Figura 2).

Figura 1 Análisis simbiótico en plantas de caña en fincas muestreadas. a. Cuantificación de esporas del suelo. b. Porcentaje de colonización en raíces. 

Figure 1  Symbiotic analysis in sugarcane plants on sampled farms. a. Quantification of soil spores. b. Percentage of colonization in roots. 

Figura 2 Estructuras microscópicas de HMA en raíz de caña. a = arbúsculos; b = hifas y esporas; c = hifas y vesículas.  

Figure 2  Microscopic structures of HMA in sugarcane roots. a = arbuscules; b = hyphae and spores; c = hyphae and vesicles. 

En cuanto a la identificación de morfotipos y clasificación a nivel de género de esporas, se destacó que Glomus sp. es el género más representativo de las comunidades de HMA nativas asociadas al cultivo de la caña. En otros estudios de caña de azúcar se ha reportado en orden de importancia la abundancia de las morfoespecies por género de Glomus, Acaulospora, Sclerocystis, Gigaspora, Scutellospora, y Funneliformis, siendo las ultimas similares en abundancia (^{Salgado et al., 2014}). En el presente estudio, se coincide al identificar la presencia de tres especies y cuatro morfotipos pertenecientes a este género (Glomus), dos morfotipos de Acaulospora y un morfotipo de Funneliformis, es importante destacar que la diversidad de esporas es muy amplia y es probable que dentro de estas poblaciones nativas existan otros morfotipos que no se han identificado aún. En la Figura 3, se presenta un grupo de fotografías microscópicas tomadas a algunos de los morfotipos encontrados en suelos nativos.

Figura 3 Morfotipos de HMA encontrados en suelos de caña de azúcar para la producción de panela. a) Glomus microcarpum; b) Glomus fasciculatum; c) Glomus sinuosum; d) Glomus sp.1; e) Glomus sp.2; f) Glomus sp.3; g) Glomus sp.4; h) Funneliformis sp.; i)Acaulospora sp. 1; j) Acaulospora sp. 2.  

Figure 3  Morphotypes of AMF found in sugarcane soils for panela production. a) Glomus microcarpum; b)Glomus fasciculatum; c) Glomus sinuosum; d) Glomus sp.1; e) Glomus sp.2; f) Glomus sp.3; g) Glomus sp.4; h) Funneliformis sp.; i)Acaulospora sp. 1; j) Acaulospora sp. 2. 

Promoción de crecimiento para las variedades CC-937711 (Pierna Bella), CC-93714 y CC-937510 (Vende Finca) en etapa de vivero

Los tratamientos correspondieron a los descritos en el Cuadro 1, siendo de T1 a T8 tratamientos de inoculación y T9 (10% de F), T10 (50% de F) y T11 (100% de F), testigos con diferentes grados de fertilización química.

Los datos del muestreo a los 90 ddt presentaron diferencias estadísticamente significativas en algunas variables. La variedad CC93-7711 (Pierna Bella) presentó diferencias significativas en tres de las variables analizadas, y se destaca especialmente el comportamiento de las plantas inoculadas con HMA nativas 1 y 3 (T1 y T3) que presentaron un comportamiento superior que los demás tratamientos de inoculación e incluso en las variables diámetro de cuello de raíz y altura en la planta que superan al testigo con el 100% de la fertilización química convencional (Cuadro 3).

En la variedad CC93-714, se destaca el comportamiento de las plantas inoculadas con HMA nativas (T1 a T3) y el inóculo de referencia T4 Glomus sp. para las variables diámetro de cuello de raíz y altura en la planta (Cuadro 4).

Finalmente, el comportamiento de la variedad CC 937510 (Vende Finca) fue similar al de las otras dos variedades en términos del efecto positivo que ejercen los HMA sobre el desarrollo agronómico de las plántulas de caña, que se refleja especialmente con los inóculos nativos que superan al testigo con el 100% de la fertilización química convencional (Cuadro 5).

La simbiosis entre plántulas y hongos micorrízicos es positiva con efectos tales como aumentos en las tasas de asimilación de CO₂, tasas de transpiración y una mayor tasa de apertura estomática, así como una mayor tasa de crecimiento vegetativo (^{Schwob et al., 1998}; Diniz, 2007¹; ^{Oliveira et al., 2015}). Se ha reportado que la altura de la planta de caña de azúcar puede ser debida a la influencia que ejercen los hongos micorrízicos arbusculares en el establecimiento del cultivo (^{Ventura et al., 2018}). En este estudio se logró observar para las tres variedades una mayor altura en los tratamientos de inoculación con HMA respecto a los tratamientos de fertilización química sin inoculación. Los inóculos de HMA nativas presentaron una mayor altura en las variedades CC93-7711 y C93-714 (Cuadros 3 y 4) y un mayor diámetro de tallo en las variedades CC93-711 y CC93-7510 Cuadros 3 y 5).

Asociación simbiótica

Con respecto al número de esporas en las variedades CC93-7711 (Pierna Bella) y CC93-714 no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos evaluados (Cuadros 3 y 4). ^{Ambrosano et al. (2011)} y ^{Moura et al. (2017)} mencionan que no hubo diferencias significativas en la densidad de esporas en el cultivo de caña de azúcar en diferentes variedades y a distintos tratamientos. La variedad CC93-7510 (Vende Finca) presentó diferencias significativas en el tratamiento 5 (Acaulospora mellea) donde se evidenció la mayor cuantificación de esporas (Cuadro 5).

El mayor porcentaje de colonización de HMA en las variedades CC93-7711 (Pierna Bella) y CC93-7510 (Vende Finca) se presentó en el tratamiento 4 (Glomus sp.) con diferencias estadísticamente significativas (Cuadros 3 y 5). Cabe destacar que en la caracterización inicial se encontraron morfotipos de Glomus asociados al cultivo en la zona y que autores como ^{Datta y Kulkarni (2012)} mencionan que la raíz de la caña de azúcar actúa como hospedero adecuado para la formación de simbiosis mutualista con algunas especies de Glomus (Glomus fasciculatum, Glomus intraradices, Glomus mosseae y Glomus versiforme).