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Introducción
El conocimiento de las características genéticas de un recurso vegetal representa un importante prerrequisito para su conservación y uso. El frijol (Phaseolus vulgaris L.) es un cultivo que en la actualidad ha cobrado mucha importancia en países alejados de su lugar de origen y distribución como Etiopía, Slovenia y Uganda (Gebeyehu et al., 2006; Mwale et al., 2009; Worku, 2013). En México siempre ha formado parte de la alimentación básica. En Jalisco se realizaba tradicionalmente la siembra de frijol de guía en asociación con maíz, sobre todo en algunas zonas de cultivo de temporal. Esto ha sido modificado por la necesidad de incrementar los rendimientos y por el desarrollo de tecnología propia para este cultivo ahora manejado en espaldera (Gebeyehu et al., 2006; Lépiz et al., 2015).
Las poblaciones utilizadas en el presente estudio difieren principalmente en el grado de manejo al que fueron o están siendo sujetas por el hombre, lo cual es notable también en los caracteres morfológicos. En el frijol de guía se distinguen tres formas principales: cultivada, intermedia y silvestre. El concepto de forma se utiliza como categoría jerárquica dentro de una especie de acuerdo a la divergencia morfológica y genética, distribución ecogeográfica, posibilidades de hibridación, y fertilidad de los híbridos y sus derivados (Lépiz, 2014). Las formas se distinguen de manera general con base en una sola característica morfológica, es decir, su hábito trepador, sus rangos geográficos son simpátricos, la divergencia genética está bajo control genético simple, la hibridación es común y los híbridos son completamente fértiles, además de la notable diferencia en el tamaño y forma de las semillas (Lépiz et al., 2010; Poczai et al., 2013; Lépiz, 2014). La variabilidad genética del frijol se encuentra expuesta a diversas presiones que fomentan la uniformidad de las variedades comerciales y reducen la variación genética de las distintas formas de la especie (cultivada, intermedia y silvestre). Bitocchi et al. (2012) reportaron la diversidad de frijol existente hasta el presente siglo y confirmaron el origen mesoamericano de esta especie así como la diversidad mayor en las líneas originarias de esta región contra la presente en los frijoles andinos. Esos estudios estuvieron basados en la comparación de frijoles silvestres de cada origen (Mesoamericano y Andino) contra los cultivados encontrados en ambas regiones y ubicaron al Occidente de México entre los sitios con mayor diversidad en esta especie.
Algunas poblaciones de frijol silvestre han desaparecido por completo y en otras se ha reducido significativamente el número de individuos con la consecuente deriva genética (Rosales-Serna, 2009; Lépiz, 2014). Además, en México la forma domesticada de esta leguminosa se enfrenta a modificaciones importantes ante una sociedad cambiante en hábitos alimenticios. Al respecto, es importante mencionar que los estudios de caracterización que incluyen líneas o colectas de especies silvestres tienen la ventaja de proporcionar información de genes que no están incluidos en el germoplasma cultivado y que pueden ser usados como fuente de mejoramiento genético (Burle et al., 2010; Bitocchi et al., 2012; Hernández-López et al., 2013; Govindaraj et al., 2015).
La importancia de este estudio radica en la posibilidad de caracterizar y diferenciar, a través del uso de herramientas moleculares, las diferentes formas de frijol común de guía (silvestres, intermedias y cultivadas) pertenecientes al complejo genético mesoamericano (Blair et al., 2009). Se trata de colectas realizadas en una zona que fue muy importante para el cultivo de frijol asociado con maíz y donde se encontraban frijoles silvestres que posteriormente produjeron las líneas intermedias. Esta asociación maíz-frijol actualmente no se utiliza y el cultivo de frijol de guía tiende a ser manejado en espalderas. Este trabajo tiene la finalidad de definir sus diferencias y similitudes genéticas generando información valiosa para la caracterización de la variabilidad de este recurso fitogenético, así como en la obtención de datos importantes para el diseño de planes de conservación y mejoramiento.
Para ello, se utilizó el marcador molecular ISTR (Inverse Sequence Tagged Repeat) que está basado en secuencias de retrotransposones copia-like, un mecanismo de transposición similar a la familia de virus Metaviridae, cuya presencia se ha reportado para esta especie en un número de 40 secuencias (Galindo et al., 2004; Xiao et al., 2004). Los retrotransposones contienen secuencias muy conservadas LTR (Long Terminal Repeat) que contienen genes que codifican para proteínas estructurales y enzimas, que se utilizan para la síntesis de los iniciadores de marcadores moleculares como los ISTR (Pearce et al., 1996; Kalendar et al., 2011; Dongying et al., 2016). Los marcadores de este tipo han sido utilizados en muchos estudios de variabilidad y diversidad genética ya que se ha probado que las mutaciones inducidas por este tipo de transposición son usualmente muy estables en contraposición con los transposones, y el polimorfismo que detectan ha permitido estudios de etiquetado de genes y diversos análisis funcionales (Aga y Bryngelsson, 2006; Zou et al., 2009; Jing et al., 2010).
Materiales y Métodos
Material vegetal
El material vegetal para este estudio consistió en semillas de 30 colectas de frijol de guía de las cuales cinco corresponden a formas cultivadas o domesticadas, cinco silvestres y 20 intermedias (Cuadro 1). Todas fueron colectadas en el estado de Jalisco con la excepción de una que proviene de Nayarit (Fig. 1). La variación de tamaño y color de las semillas se muestra en la Figura 2. Las colectas permanecen conservadas como accesiones del Banco de Germoplasma del Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Guadalajara (CUCBA). Se entiende como accesión un volumen de semilla asignado, con número secuencial y de identificación de colecta, al banco de germoplasma y a una base de datos nacional o internacional (Aubry et al., 2005).
Cuadro 1 Características de las poblaciones utilizadas en el presente trabajo. C=cultivada, I=intermedia y S=silvestre. *Municipio de Etzatlán, Jal.
| Accesión | Forma | Número de identificación | Sitio de colecta | Latitud (N) | Longitud (O) | Altitud (m s.n.m.) | Color de semilla | Peso de 100 semillas (g) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| G. ZARCO TP | C | I | Tepatitlán, Jal. | 20°55' | 102°47' | 2,067 | Amarillo crema | 32.2 |
| M. DE AGUA | C | II | Tepatitlán, Jal. | 20°55' | 102°47' | 2,067 | Morado | 39.2 |
| BURRO | C | III | Zapopan, Jal. | 20°44' | 103°30' | 1,578 | Ojo de cabra | 56.0 |
| PEREGRINO | C | IV | Tepatitlán, Jal. | 20°55' | 102°47' | 2,067 | Rosa jaspeado | 28.0 |
| G. ZARCO SS | C | V | Tequila, Jal. | 20°54' | 103°43' | 1,189 | Amarillo crema | 44.4 |
| ROL-133-1 | I | VI | Tequila, Jal. | 20°54' | 103°49' | 1,122 | Crema jaspeado | 13.2 |
| ROL-168-1-2 | I | VII | Zapopan, Jal. | 20°44' | 103°30' | 1,578 | Ojo de cabra | 10.8 |
| ROL-172-3-1 | I | VIII | Jala, Nay. | 21°06' | 104°27' | 1,165 | Crema jaspeado | 15.8 |
| ROL-227-1-2 | I | IX | San Pedro*, Jal. | 20°49' | 104°04' | 1,472 | Bayo bola | 14.8 |
| ROL-227-2-1 | I | X | San Pedro*, Jal. | 20°49' | 104°04' | 1,472 | Rosa | 22.2 |
| ROL-227-2-2 | I | XI | San Pedro*, Jal. | 20°49' | 104°04' | 1,472 | Negro | 13.6 |
| ROL-227-3-1 | I | XII | San Pedro*, Jal. | 20°49' | 104°04' | 1,472 | Café oscuro | 21.0 |
| ROL-312-1-1 | I | XIII | San Pedro*, Jal. | 20°49' | 104°04' | 1,472 | Café verde | 16.8 |
| ROL-323 | I | XIV | Acatic, Jal. | 20°49' | 102°59' | 1,633 | Negro | 16.0 |
| ROL-323-1 | I | XV | Acatic, Jal. | 20°49' | 102°59' | 1,633 | Bayo bola | 25.4 |
| ROL-323-3 | I | XVI | Acatic, Jal. | 20°49' | 102°59' | 1,633 | Rosa oscuro | 17.2 |
| ROL-328-1-1-2 | I | XVII | Acatic, Jal. | 20°49' | 102°59' | 1,348 | Café jaspeado | 18.0 |
| ROL-328-1-2 | I | XVIII | Acatic, Jal. | 20°49' | 102°59' | 1,348 | Rosita crema | 25.6 |
| ROL-328-1-5 | I | XIX | Acatic, Jal. | 20°49' | 102°59' | 1,348 | Bayo estriado | 20.2 |
| ROL-328-2-1-1 | I | XX | Acatic, Jal. | 20°49' | 102°59' | 1,348 | Amarillo jaspeado | 21.8 |
| ROL-328-2-1-2 | I | XXI | Acatic, Jal. | 20°49' | 102°59' | 1,348 | Bayo jaspeado | 18.6 |
| ROL-328-3-1 | I | XXII | Acatic, Jal. | 20°49' | 102°59' | 1,348 | Negro brillante | 11.9 |
| ROL-330-1 | I | XXIII | Acatic, Jal. | 20°49' | 102°59' | 1,600 | Bayo estriado | 20.6 |
| ROL-362-2-1 | I | XXIV | Zapopan, Jal. | 20°45' | 103°31' | 1,544 | Bayo claro bola | 17.0 |
| ROL-362-2-2 | I | XXV | Zapopan, Jal. | 20°45' | 103°31' | 1,544 | Amarillo jaspeado | 15.4` |
| ROL 228 | S | XXVI | San Pedro*, Jal. | 20°49' | 104°04' | 1,472 | Gris jaspeado | 9.8 |
| ROL 241 | S | XXVII | Jala, Nay. | 21°06' | 104°27' | 1,161 | Gris jaspeado | 12.8 |
| ROL 262 | S | XXVIII | Magdalena, Jal. | 20°51' | 103°59' | 1,474 | Gris jaspeado | 8.8 |
| ROL 322 | S | XXIX | Acatic, Jal. | 20°49' | 102°58' | 1,633 | Gris jaspeado | 12.0 |
| ROL 452 | S | XXX | Teuchitlán, Jal. | 20°41' | 103°51' | 1,273 | Gris jaspeado | 11.8 |
Figura 2 Semillas de frijol utilizadas en el presente estudio. I-V. cultivadas; VI-XXV. intermedias; XVI-XXX. silvestres. Barra=0.5 cm.
Las semillas de cada población fueron sembradas en invernadero en el CUCBA y cultivadas hasta su floración. De cada población se tomó al azar tejido foliar de 10 individuos obteniendo un total de 300 individuos para el estudio.
Análisis molecular
Se obtuvo el ADN de los individuos de cada colecta usando el método reportado por Saghai-Maroof et al. (1984), se cuantificó y evaluó por espectrofotometría y por electroforesis en geles de agarosa a 1% (Sambrook y Russell, 2001). Para la amplificación se utilizó el protocolo reportado por Torres-Morán et al. (2008) para ISTR, en un volumen final de 20 µL utilizando 25 ng de ADN, amortiguador PCR 1 X (pH 7.2 Tris-HCl), 3 mM de MgCl2, 0.3 μM de cada iniciador, 0.25 mM de dNTPs y Taq polimerasa 1U. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: un primer ciclo de desnaturalización de 95 °C por 3 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 3 s; alienación a 45 °C por 1 min y extensión a 72 °C por 2 min, con una extensión final de 10 min a 72 °C y una temperatura de almacenamiento a 4 °C. Se emplearon dos combinaciones de iniciadores F91/B31 y F10/B11, en donde F indica iniciador Forward (hacia adelante) y B Backward (hacia atrás). Las secuencias de cada uno de los iniciadores se indican en el Cuadro 2.
Cuadro 2 Secuencias de los iniciadores utilizados en el presente trabajo, tomadas de Aga y Bryngelsson (2006).
| INICIADOR | SECUENCIA 5’ - 3’ |
|---|---|
| F91 | ATA TGG ACT TAA GCA AGC CA |
| B31 | ATT CCC ATC TGC ACC AAT |
| F10 | TAA GCA AGC ATC TCG GAG |
| B11 | ATC AGG AAG GTC TGT AAA GC |
Análisis de los datos
A partir de matrices binarias de presencia ausencia, se calculó el coeficiente de similitud de Jaccard de acuerdo a lo reportado por Lowe et al. (2004). Posteriormente se realizó un procedimiento Bootstrap o remuestreo con 10,000 iteraciones y análisis de agrupamiento por el método UPGMA (Unweighted Pair Group with Arithmetic Average), utilizando el programa estadístico NTSYS v. 2.11 (Rohlf, 2002). Finalmente, se analizó la estructura genética de las poblaciones por medio del programa STRUCTURE (Pritchard et al., 2000), basado en el modelo Bayesiano de probabilidad condicional, para lo cual se usaron 5000 iteraciones por 5000 repeticiones. Los resultados se presentan en forma gráfica.
Resultados
Se produjeron un total de 660 bandas (loci); el porcentaje de polimorfismo detectado fue diferente para cada combinación de iniciadores. Los valores se reportan en el Cuadro 3.
Cuadro 3 Número de bandas polimórficas y porcentaje de polimorfismo detectado con dos combinaciones de iniciadores de ISTR en las poblaciones de Phaseolus vulgaris L.
| Iniciadores | Total de bandas producidas |
Número de bandas polimórficas |
Porcentaje de polimorfismo |
|---|---|---|---|
| F91/F31 | 480 | 427 | 88.95 |
| F10/B11 | 180 | 153 | 85.00 |
| TOTAL | 660 | 580 | 87.87 |
El análisis de agrupamiento mostró una separación de las poblaciones en ocho grupos, lo cual corresponde a una clara división entre las formas silvestres y cultivadas, ubicando poblaciones intermedias asociadas a las formas anteriores que cuentan con secuencias que coinciden o bien con las cultivadas o con las silvestres. Tal es el caso de las poblaciones VI, VII, VIII, IX, X y XI que fueron agrupadas con las cultivadas y las XXII y XXV que fueron ubicadas con las silvestres. Las XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, XX, XXI, XXII y XXIII se agruparon de manera independiente, todas correspondientes al grupo de frijoles con forma intermedia.
El coeficiente de Jaccard mostró un grado de similitud máximo de 0.66 en el cual se ubicaron las XVI y XVII, por lo que se puede concluir que son las dos poblaciones más parecidas genéticamente con base en secuencias detectadas por ISTR. El grado de similitud más bajo con base en el coeficiente de Jaccard fue de 0.17, en donde se ubican las II y XXX, siendo éstas las menos parecidas genéticamente, ya que corresponden a una población de frijol cultivado y una silvestre (Fig. 3).
Figura 3 Dendrograma obtenido con remuestreo (Bootstrap) y análisis de agrupamiento a partir de las matrices generadas con ISTR. Se muestra la asociación en ocho grupos de las accesiones analizadas y los valores de confiabilidad del remuestreo. Poblaciones marcadas con azul = cultivadas, rojo = intermedias, verde = silvestres.
Los valores del remuestreo (Bootstrap) para el dendrograma obtenido abarcaron de 49% a 100% y se produjeron 8 grupos (Fig. 3). El valor máximo de similitud se encontró entre las accesiones XVI y XVII a un nivel de 0.66 del coeficiente de Jaccard, estas accesiones son provenientes de Acatic, Jalisco. Las accesiones provenientes de esta localidad fueron agrupadas principalmente en el grupo 2.
Utilizando el programa STRUCTURE se obtuvo la diferenciación dentro de las poblaciones, donde se confirma la estructura genética del material conformada en nueve grupos diferentes, (K=9), lo que difiere muy poco con lo encontrado por similitud y agrupamiento (UPGMA) en el que se encontraron ocho grupos. Los valores de diferenciación genética calculados con este programa se reportan en el Cuadro 4. Los valores de diferenciación genética van de 0 a 1 donde 0 = no diferenciación, <0.05=diferenciación pequeña, 0.05< y <0.15=diferenciación moderada, 0.15< y <0.25=diferenciación grande, >0.25=diferenciación muy grande, 1=fijación de alelos alternativos en diferentes poblaciones o subpoblaciones. Los valores indican que el mayor grado de diferenciación corresponde al grupo 1 (0.7278) y al 6 (0.6436), lo cual corresponde al grupo de material cultivado y a los intermedios respectivamente.
Cuadro 4 Valores de diferenciación genética (FST) obtenidos para los nueve grupos sugeridos por el programa STRUCTURE.
| Grupo | FST (diferenciación genética) |
|---|---|
| 1 | 0.7278 |
| 2 | 0.3754 |
| 3 | 0.3596 |
| 4 | 0.6883 |
| 5 | 0.4371 |
| 6 | 0.6436 |
| 7 | 0.2364 |
| 8 | 0.6076 |
| 9 | 0.4537 |
En la Figura 4 se muestra el resultado de cada simulación para diferente número de grupos (K=2 hasta K=10). Se presentan los grupos en diferente color, lo cual hace posible apreciar cómo algunos individuos de la forma intermedia comparten secuencias similares con silvestres y con cultivadas. Lo cual corresponde también al resultado obtenido por similitud. La correspondencia de colores en los individuos de las colectas de frijol intermedio que son similares a los silvestres o a los domesticados se complementa con la referencia de probabilidad de pertenencia de cada individuo a cada grupo simulado.
Discusión
Con base en los valores del remuestreo, se puede considerar que el dendrograma obtenido es confiable y las asociaciones que se muestran se deben a la similitud genética entre las accesiones asociadas en cada grupo. La relación que se presenta en el dendrograma se asocia con el fenotipo, forma, tamaño y color de la semilla. Las plantas dentro del grupo intermedio producen pocas semillas por vaina pero más grandes que la forma silvestre (Graham y Ranalli, 1997; Zizumbo-Villareal et al., 2005). La variación en el color de la semilla es muy alta, lo cual ha sido reportado también por Blair et al. (2009). Este grupo con forma intermedia se ha encontrado en sitios donde crecen las poblaciones silvestres, pero cercanos a parcelas donde se cultiva o se cultivó frijol asociado con maíz. Las accesiones provenientes de la localidad de Acatic, Jalisco, se ubicaron en el grupo con mayor similitud genética con niveles de 0.35 hasta 0.66 del coeficiente de Jaccard; sin embargo, se muestra una gran variabilidad en el fenotipo de semillas (Fig. 3).
Las poblaciones silvestres no han sido sometidas a ningún manejo por parte del hombre y se colectaron en hábitats libres de perturbación humana, presentan semillas pequeñas y la variación en el color de la semilla es uniforme (Lépiz et al., 2010). Estos grupos se separaron más claramente en los análisis realizados.
El porcentaje de bandas polimórficas que se obtuvieron con el marcador ISTR indica que puede ser un marcador confiable para su utilización como método para diferenciar genéticamente a las poblaciones con diferente forma de frijol común. Los frijoles intermedios forman un grupo molecularmente cercano tanto a poblaciones silvestres como cultivadas; sin embargo, algunas poblaciones se agruparon aparte, sugiriendo que forman un grupo distinto y que deben considerarse de importancia para su estudio y conservación, así como materia prima para la hibridación en busca de mejoramiento genético. Esta información puede marcar una nueva dirección en el estudio de las diferencias entre accesiones, cultivares o líneas de frijol, así como la diferenciación entre formas (Poczai et al., 2013).
La manera en que se formaron los grupos en el dendrograma demostró que este marcador detecta las variaciones en el genoma de las plantas estudiadas. Dichas variaciones son representadas por elementos transponibles y presumiblemente reflejan hibridación entre las formas cultivadas y silvestres como origen de las formas intermedias.
Los altos valores de diferenciación genética (FST) obtenidos a partir del análisis con el programa STRUCTURE sugieren una gran diferenciación en términos de frecuencias alélicas, particularmente en las formas cultivadas e intermedias. Estos resultados sugieren probablemente mayor calidad homocigota en estas accesiones, bajo nivel de flujo genético y diferencias atribuibles a su origen geográfico (Rousset, 1997; Poczai et al., 2013).
La estructura obtenida mediante el análisis Bayesiano con STRUCTURE se considera robusta si se obtuvo de múltiples corridas independientes en el programa, como mencionan Jing et al. (2010), quienes trabajaron con especies de chícharo (Pisum L. spp.) como modelo, usando marcadores basados en retrotransposones. La agrupación de las formas intermedias con las cultivadas o las silvestres podría sugerir el origen de dichas formas como resultado de la hibridación natural entre poblaciones cultivadas y silvestres. Esto concuerda con los resultados obtenidos por Papa y Gepts (2003) a partir de AFLPs en poblaciones domesticadas, silvestres e intermedias de frijol común provenientes del complejo mesoamericano, en donde la ausencia de frijoles domesticados en la agrupación de los silvestres indica asimetría en el flujo genético entre estas dos formas, mientras que señalan el origen de los frijoles intermedios como resultado de hibridación entre los domesticados y silvestres.
Al analizar líneas de frijol similares provenientes del occidente de México con parámetros morfoagronómicos, comparando poblaciones de frijol cultivadas, silvestres e intermedias de frijol, Lépiz et al. (2010) encontraron a las poblaciones intermedias más cercanas a las silvestres, lo cual concuerda con los resultados obtenidos en el presente estudio. La conservación de las poblaciones bajo estudio es importante para disponer de la variabilidad genética existente. Se observó un mayor número de bandas obtenidas con el marcador ISTR en las poblaciones cultivadas e intermedias en comparación a las silvestres, lo que pudiera sugerir el efecto a través del tiempo en la generación de variación genética por el manejo del hombre sobre Phaseolus vulgaris. Sin embargo, esto también se puede deber a las regiones que detecta el marcador molecular utilizado, ya que está basado en secuencias de retrotransposones que son elementos móviles en el genoma del organismo en cuestión.
