Material vegetal y autenticidad

Se recolectaron hojas de ambas especies, Vismia baccifera fue recolectada en septiembre de 2011 en la localidad La Esperanza, municipio de Santiago Comaltepec, Oaxaca. Buddleja cordata se recolectó en noviembre de 2015 en las instalaciones de Ciudad Universitaria, UNAM en la Ciudad de México. Se depositó un ejemplar de cada especie en el herbario de la Facultad de Ciencias de la UNAM, con número de registro 134792 y 160639, respectivamente. La identificación fue hecha por los coautores, quienes corroboraron las especies con el M. en C. Ramiro Cruz Durán.

Obtención de los extractos orgánicos

Se obtuvieron extractos de las hojas secas (a temperatura ambiente y en sombra) de ambas especies mediante el método de maceración en frío (^{Chen et al., 2016}), que consiste en obtener un extracto a partir de disolventes orgánicos puestos en contacto con el material vegetal. Se colocaron 118 g de hojas secas y molidas en un matraz (de manera independiente), se cubrió con diclorometano-metanol (CH₂Cl₂-MeOH) (1:1) y cada tercer día se recolectaron los extractos, se colocó nuevamente mezcla de disolventes. El disolvente se eliminó a presión reducida. Este proceso se repitió hasta que el disolvente fue incoloro. Los extractos finales se denominaron vismia y tepozán. Los extractos de diferente polaridad de tepozán se obtuvieron a partir de 470 g de hoja seca y molida bajo el mismo procedimiento; primero, se extrajo con hexano, luego con acetato de etilo y finalmente con metanol. Los extractos secos se nombraron como THex, TAcOEt y TMeOH, respectivamente.

En todos los casos se hizo una solución stock a partir de 1 mg de extracto seco que se disolvió en la cantidad mínima necesaria de dimetilsulfoxido (DMSO; Sigma Aldrich). Esta solución stock se filtró con una membrana de 0.22 µm (Merck Millipore) y se aforó hasta 2 mL con medio de cultivo celular (DMEM-F12 complementado; DMEM-F12 con 10 % suero fetal bovino y 1 % antibiótico-antimicótico; Gibco). Los extractos de vismia y tepozán se evaluaron en las concentraciones 5, 10, 50 y 100 µg mL^-1, mientras que los extractos de diferente polaridad de tepozán se usaron en las concentraciones 5, 10 y 50 µg mL^-1. Los tratamientos se mantuvieron a 4-8 ºC hasta su uso.

Cultivo celular y condiciones

Los fibroblastos (FBH) en criopreservación (INR, México) se obtuvieron de remanentes de cirugía de circuncisión (Firma de Consentimiento Informado). Los FBH se descongelaron y expandieron en cajas de cultivo Corning T25, el cultivo se mantuvo con DMEM-F12 complementado en una incubadora a 37 ºC y con 5 % de CO₂ (^{Velasquillo et al., 2017}).

Viabilidad celular MTT

Se cultivaron 7000 células por pozo en placas Costar de 48 pozos con DMEM:F12 complementado a 37 ºC y 5 % de CO₂ hasta alcanzar 80 % de confluencia celular; después, se retiró el medio de cultivo, se agregaron 200 µL del tratamiento correspondiente y se incubaron. Como control negativo se evaluó el vehículo de disolución de los extractos (DMSO); para ello, se incubaron pozos con diluciones de DMSO:DMEM-F12 complementado (con el DMSO correspondiente usado en los extractos).

Para el control positivo se incubaron pozos con DMEM:F12 complementado (sin DMSO ni extractos) para evaluar el proceso normal de las monocapas. Después de 24 h se retiraron los tratamientos y se hicieron lavados con buffer (PBS; Phosphate Buffer Saline 1X, pH 7; Gibco). Se agregaron 150 µL de una solución 9:1 DMEM-F12:MTT (sal de tetrazolio; Sigma Aldrich) y se incubaron durante 3 h. La mezcla DMEM-F12:MTT se retiró, se hicieron lavados con PBS y se añadieron 150 µL de DMSO-isopropanol 1:1 para solubilizar los cristales de formazán producidos. Se tomó una alícuota de 100 µL de esta solución, se colocó en una placa de cultivo Costar de 96 pozos para tomar la lectura de absorbancia de la placa a 620 nm. Aunque la absorbancia máxima ocurre a 570 nm, se pueden hacer lecturas incluso a 630 nm, mientras se encuentre dentro de la curva de absorbancia (^{Riss et al., 2016}). Los datos se normalizaron con respecto al control (DMEM-F12) como el 100 % de viabilidad. Se hicieron tres ensayos independientes.

Ensayo de scratch (reparación de herida)

El ensayo de cierre de herida in vitro en monocapas celulares (in vitro wound healing scratch assay) es un modelo sencillo para evaluar la migración celular, al mimetizar este proceso que ocurre durante el cierre de heridas in vivo (^{Liang et al., 2007}). Este ensayo ha sido usado por diferentes autores como un modelo para evaluar o predecir el potencial de diferentes compuestos o tratamientos para acelerar el cierre o reparación de heridas cutáneas (^{Walter et al., 2010}), por lo que se decidió evaluar los extractos de vismia y tepozán bajo condiciones similares a las de ^{Dinda et al. (2015)}.

Se sembraron 45,500 FBH por pozo en placas Costar de 12 pozos y se cultivaron con DMEM-F12 complementado hasta alcanzar 80 % de confluencia celular. A partir de estas monocapas celulares se simuló una herida, al hacer un rayado con una punta estéril de micropipeta (Axygen) de 1000 µL. Los restos celulares fueron removidos con PBS. Inmediatamente después se aplicaron 800 µL del tratamiento correspondiente y se tomaron fotografías (5X) de la herida en un microscopio invertido (Carl Zeiss, Thornwood, NY, EUA) al tiempo 0 h. Las muestras se incubaron por 24 h a 37 ºC y 5 % CO₂. Posteriormente, se tomaron fotografías (t = 24 h) de la misma zona que se fotografió al tiempo 0 h. Primero se evaluaron los extractos de tepozán y vismia (5, 10, 50 y 100 µg mL^-1) para determinar el efecto de las dos especies sobre la promoción del cierre de la herida en la monocapa.

Una vez que se descubrió que tepozán presentó mayor potencial, se evaluaron los extractos de diferente polaridad en las dosis de 5, 10 y 50 µg mL^-1 con el mismo procedimiento. Como controles se usaron el vehículo DMSO (concentraciones presentes en los tratamientos) y DMEM-F12 (sin DMSO ni extracto) para conocer el proceso natural del cierre de la herida en las monocapas. Los ensayos se hicieron por triplicado. Las micrografías se analizaron con el software Tscratch (ETH Zürich, Suiza) que analiza las micrografías a partir de un algoritmo que permite medir el porcentaje del área que ocupa la herida con respecto al área total. Posteriormente, se aplicó la siguiente fórmula para obtener el porcentaje de cierre de la herida ocurrido a las 24 h de cultivo con tratamiento, con respecto al área inicial de cada herida (0 h de cultivo con los tratamientos):

donde: T _i es el porcentaje de área ocupada por la herida a 0 h respecto del área total analizada y T _f es el porcentaje que ocupó la herida a las 24 h de cultivo con tratamiento, con respecto al área total analizada. El área analizada de la monocapa fue la misma a las 0 y 24 h.

Actividad inhibitoria contra Pseudomonas aeruginosa

La cepa de Pseudomonas aeruginosa PA14 fue donada por el Dr. Rodolfo García Contreras de la UNAM; corresponde a un aislado clínico de un paciente con quemaduras, previamente caracterizada por ^{Kukavica-Ibrulj et al. (2008)}. La bacteria se reactivó con medio Luria Bertani (LB) sólido (Sigma Aldrich) y se incubó a 35 ºC por 24 h. Para preparar el inóculo se homogenizaron de dos a tres colonias en 10 mL de medio LB líquido, se incubó por 8 h a 35 ºC con agitación orbital. El inoculo se ajustó a una densidad óptica de 0.025 (≈ 1 × 10⁶ UFC) a 600 nm en un espectrofotómetro. El método de microdilución se realizó de acuerdo con ^{Al-Bayati y Al-Mola (2008)}.

En placas Costar de 96 pozos se agregaron 200 µL del inoculo por pozo (≈ 1 × 10⁵ UFC). Se adicionó la cantidad necesaria de extracto de vismia o tepozán previamente disuelto en DMSO, las concentraciones finales fueron de 1, 10, 100 y 1000 µg mL^-1. También se colocaron pozos con agua estéril o DMSO (control negativo) y como control positivo se usó colistina (concentración fija de 500 µg mL^-1) y se tomó la lectura para restar la absorbancia de fondo. Finalmente, se incubaron todas las muestras a 28 ºC con agitación orbital para reducir la evaporación de los pozos. Se tomaron las absorbancias a 3, 6, 9 y 12 h. Se hicieron tres ensayos independientes con seis réplicas en cada caso.

Análisis estadístico

Los datos se promediaron y se muestran con ± ee (error estándar). Se hicieron análisis de varianza de una vía con comparación de Dunnett´s (GraphPad Prism5). Se consideraron diferencias significativas P < 0.05 y P < 0.01, las que se representaron como * y **, respectivamente.

Viabilidad celular, ensayo de MTT

Ninguno de los extractos de CH₂Cl₂-metanol de vismia ni de tepozán mostró un efecto citotóxico en los cultivos celulares a las 24 h de incubación (Figura 1), pues ninguno de los tratamientos disminuyó más del 50 % la actividad metabólica-viabilidad de los FBH con respecto al control (^{Riss et al., 2016}). Tampoco se encontró un efecto citotóxico por parte de los extractos de diferente polaridad de tepozán (TMeOH, THex y TAcOEt) (Figura 2) ni de los controles con DMSO con respecto al control (DMEM-F12).

Figura 1 Ensayo de MTT a las 24 h de incubación celular en presencia de extractos de CH₂Cl₂-metanol de vismia y tepozán. *:P ≤ 0.05 con respecto al control DMEM-F12. 

Figura 2 Ensayo de MTT a las 24 h de incubación celular en presencia de extractos de diferente polaridad de tepozán (Hexano, THex; Acetato de etilo, TAcOEt y metanólico, TMeOH). No existen diferencias significativas, con respecto al control DMEM-F12. 

Previamente ^{Mensah et al. (2001)} evaluaron el potencial de proliferación de fibroblastos tratados con el extracto acuoso de B. globosa mediante el ensayo de rojo neutral, en el que se encontró que a 0.1, 1 y 10 µg mL^-1 el extracto favorece la proliferación celular, pero con 100 µg mL^-1 se presentó un efecto tóxico. ^{Nuñez et al. (2013)} estudiaron la actividad citotóxica de V. guianensis en células de riñón de embrión de mono, en el ensayo de MTT; encontraron que a partir de 250 µg mL^-1 los extractos hexánicos de hojas inducen muerte celular, mientras que el extracto metanólico no tuvo efecto citotóxico, incluso a 500 µg mL^-1. En el presente estudio no se encontró efecto citotóxico en ninguno de los tratamientos evaluados, tanto de vismia como de tepozán, lo cual se puede deber a que corresponden a especies diferentes a las ya reportadas, o a que no se evaluaron dosis mayores de 100 µg mL^-1.

Cierre de herida in vitro; ensayo de “scratch” en monocapas celulares

En los ensayos de herida in vitro donde se evaluaron los extractos de vismia y tepozán se encontró que el extracto de tepozán (50 µg mL^-1) incrementó significativamente el cierre de la herida en la monocapa a las 24 h con respecto al control (DMEM-F12). El extracto de vismia no mostró una mejora significativa en ninguna dosis (Figura 3).

Figura 3 Ensayo de herida "scratch" con los extractos de CH₂Cl₂-metanol de vismia y tepozán. Micrografías de 0 y 24 h. Promedio del porcentaje de cierre de herida por tratamiento. *: P ≤ 0.05 con respecto al control DMEM-F12. 

Al evaluar los extractos de diferente polaridad de tepozán (THex, TAcOEt y TMeOH) se encontró que ninguno de los tratamientos incrementó significativamente el cierre de la herida en la monocapa celular con respecto al control (Figura 4); sin embargo, los tratamientos de TMeOH (5 y 10 µg mL^-1) mostraron el mayor porcentaje de cierre de la herida. El tratamiento con DMSO:DMEM-F12 no tuvo efecto en el cierre de la herida.

Figura 4 Ensayo de herida "scratch" con los extractos de diferente polaridad de tepozán. Micrografías a 0 y 24 h. Promedio del porcentaje de cierre de herida por tratamiento. 

Estos efectos sugieren que el extracto de tepozán (CH₂Cl₂-MeOH), al ser más complejo, podría estar presentando un efecto sinérgico de sus componentes, lo que potencia su actividad, la cual disminuye al fraccionarlo. Un resultado similar se presentó en el trabajo de ^{Dinda et al. (2016)}, donde los extractos presentaron una actividad diferenciada dependiendo de su polaridad, los extractos más polares fueron más activos. El extracto de CH₂Cl₂-MeOH presentó compuestos de baja, mediana y alta polaridad, mientras que el extracto metanólico (TMeOH) sólo presentó compuestos polares, como los fenoles (^{Aleixandre-Tudo et al., 2018}). No hay estudios que hayan evaluado extractos del género Buddleja en el modelo de cierre de herida in vitro; sin embargo, sí existen estudios que han evaluado otras especies.

^{Tonin et al. (2016)} evaluaron la actividad cicatrizante del extracto metanólico de Rubus imperialis, el cual fue efectivo de 1 a 100 µg mL^-1; el mayor efecto fue a 10 µg mL^-1, mientras que ^{Lee et al. (2016)} encontraron que el extracto metanólico de Piper cambodianum fue efectivo de 1 a 50 µg mL^-1, con mayor actividad a 10 µg mL^-1. En este estudio se observó efecto positivo de 10 a 50 µg mL^-1, lo cual es semejante a lo encontrado en otras especies.

Previamente, ^{Estrada-Zúñiga et al. (2009)} analizaron el extracto metanólico de hojas de B. cordata por HPLC-UV; encontraron seis compuestos en dicho extracto, cuatro ácidos (cafeíco, cumárico, ferúlico y sinápico) y dos feniletanoides (linarina y verbascosido como compuesto mayoritario). El verbascosido aislado de Verbascum mucronatum Lam. tiene actividad cicatrizante in vivo (en modelos de escisión e incisión a los 10 y 12 d), efecto antiinflamatorio al inhibir el edema de pata trasera en rata (200 mg kg^-1) y actividad antinociceptiva en un 50 a 67 % (^{Akdemir et al., 2010}), también presenta un efecto antioxidante con un porcentaje de protección del 68 al 88 % (^{Mensah et al., 2001}), efecto fotoprotector in vitro contra la radiación UV-B (^{Ávila et al., 2005}) e inhibe la agregación plaquetaria (^{Campo et al., 2012}). Todas estas actividades favorecen el cierre de la herida de forma gradual, lo que evita anormalidades en la cicatrización.

Todo lo anterior sugiere la presencia del verbascosido en los extractos de tepozán del presente estudio, lo que ayuda a potenciar el cierre de la herida in vitro en las concentraciones activas; sin embargo, es necesario estudiar la composición química de los extractos para corroborar la presencia de este compuesto. También se deben estudiar los posibles mecanismos celulares sobre los que estarían actuando los extractos de B. cordata.

Actividad inhibitoria contra Pseudomonas aeruginosa

Ninguno de los tratamientos de tepozán y vismia tuvo actividad inhibitoria contra P. aeruginosa. Estos resultados no fueron los esperados, pues ambos géneros (Buddleja y Vismia) cuentan con estudios previos que avalan su efecto antimicrobiano. En el caso de Buddleja, ^{Ali et al. (2011)} demostraron que B. asiatica tiene efecto contra P. aeruginosa en el modelo de difusión en agar en dosis mayores a las estudiadas en el presente trabajo. ^{Kuete et al. (2007)}, ^{Núñez et al. (2013)} y ^{Salas et al. (2007)} evaluaron a V. laurentii, V. guianensis y V. baccifera, respectivamente, en las que encontraron efecto inhibitorio contra la misma bacteria en el modelo de difusión en agar, al usar dosis mayores a las aquí estudiadas. Dados los resultados obtenidos y que no se observó un efecto de dosis dependiente (datos no mostrados), no se evaluaron otros extractos ni otras dosis de tepozán y vismia.