Extracción e identificación de quistes

Se utilizó una muestra de suelo de papa (Solanum tuberosum) proveniente del ejido Navidad, municipio de Galeana, Nuevo León, a la cual se le realizó la extracción de quistes de Globodera spp. por la metodología del embudo de ^{Fenwick (1940)}, donde el sobrenadante retenido por el tamiz se secó con papel absorbente y posteriormente bajo el microscopio estereoscópico, los quistes fueron separados e identificados morfológicamente por las medidas morfométricas del patrón fenestral en el microscopio compuesto (^{Baldwin & Mundo-Ocampo, 1991}).

Obtención e identificación de hongos entomopatógenos (Beauveria spp.)

Durante los meses de octubre a enero, se realizaron muestreos de suelos en los siguientes sitios:

Se colectaron 5 muestras de suelo en cada uno de los sitios mencionados a una profundidad de 15 cm a 30 cm, mismas que fueron colocadas en bolsas de plástico negras previamente etiquetadas y rotuladas, posteriormente se trasladaron al laboratorio para llevar a cabo el aislamiento de entomopatógenos para lo cual se utilizó la técnica del insecto cebo descrita por ^{Zimmermann (1986)}. Las muestras de suelo se repartieron en recipientes de 500 ml, se les agregó humedad y se liberaron dos larvas de Tenebrio molitor (insecto cebo) en cada en cada una. Estas fueron revisadas a los 7 días y 14 días y las larvas muertas se separaron y se desinfectaron con hipoclorito de sodio, posteriormente se colocaron en cámara húmeda para darle las condiciones a los hongos entomopatógenos. Una vez observado el crecimiento micelial, el aislamiento se llevó a cabo mediante la metodología de ^{Goettel & Inglis (1997)}. Los aislamientos utilizados se propagaron en cajas Petri con medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) y se incubaron a 28 °C ± 2 °C hasta la esporulación del hongo. Las cepas aisladas fueron identificadas por medio de sus estructuras, observadas bajo el microscopio compuesto utilizando las claves de ^{Barnett & Hunter (1998)}.

Infección de quistes de Globodera rostochiensis con el hongo Beauveria spp.

Se seleccionaron cuatro diferentes cepas de Beauveria spp. con base en la rapidez en su crecimiento y esporulación para posteriormente reactivarlas en PDA e incubarlas durante un lapso de siete días a 28 °C ± 2 °C. Finalmente, se realizó un lavado de esporas, mismo que fue utilizado para preparar diluciones contando el número de conidias con la cámara de Neubauer y ajustadas a concentraciones de 1 × 10⁴ conidias/mL, 1 × 10⁵ conidias/mL, 1 × 10⁶ conidias/mL. Para el bioensayo se utilizaron quistes desinfectados con una solución de hipoclorito de sodio en una concentración al 2% durante 30 s, enjuagándolos tres veces con agua destilada estéril y se secaron sobre un papel secante estéril.

Se colocaron cuatro quistes en cajas Petri con medidas de 60 mm × 15 mm, con agar agua y se adicionaron 500 µL de las diferentes diluciones por separado, distribuidos por toda la caja y sobre ellos. Se realizaron cuatro repeticiones por dilución y un testigo con agua destilada estéril.

Las cajas se mantuvieron en el laboratorio, a temperatura de 27 °C ± 2 °C, observando los quistes cada 24 h bajo el microscopio estereoscópico, abriéndolos con un bisturí con el fin de observar la infección del hongo sobre los huevecillos y juveniles de G. rostochiensis.

A los datos obtenidos se les realizó un análisis de varianza (Anova) y prueba de comparación de medias de Tukey con un nivel de significancia de 0.01.

Identificación del nematodo

Los quistes aislados del suelo se observaron de forma esférica, algunos con coloración de amarillo a dorado y otros de color café. Para la identificación de especie se realizó la observación del patrón fenestral contando un número de 17 estrías cuticulares, entrecruzadas entre el ano y la vulva, que presentó un diámetro de 17.29 μm y se localizó a una distancia de 59.28 μm del ano, con un radio de Granek de 3.42 μm (Figuras 1 y 2). Al ser este nematodo una plaga cuarentenaria, se realizaron análisis moleculares para su identificación en un laboratorio de referencia, donde se corroboró la especie como G. rostochiensis.

Fuente: Elaboración propia

Figura 1 Quiste sano de G. rostochiesis. 

Fuente: Elaboración propia

Figura 2 Patrón fenestral de Globodera rostochiensis. 

Aislamiento de hongos

De los aislamientos realizados a partir de las muestras de suelo, se obtuvieron un total de 4 cepas. Mediante observación de sus estructuras se les identificó como pertenecientes al género Beauveria, que se caracteriza por presentar un crecimiento lanoso de color blanco y con abundantes conidias.

En el microscopio compuesto, se observaron hifas cenocíticas con fiálides en forma de racimo, irregularmente agrupados, en forma de botella, sosteniendo a las esporas en forma de zig-zag. Las conidias son hialinas, lisas de forma globosa a elipsoidal, como lo descrito por las claves de ^{Barnett & Hunter (1998)} (Tabla 1, Figura 3).

Fuente. Elaboración propia

Figura 3 Hifas, fialides y esporas de Beauveria spp. 

Infección de quistes de Globodera rostochiensis con Beauveria spp.

A las 48 h después de la aplicación, la cepa RH4 presentó mayor número de quistes infectados. La comparación de medias solo se le realizó en este tiempo, ya que fue donde se obtuvo diferencias estadísticamente significativas. A las 72 h se observó el efecto del hongo sobre los quistes en todas las cepas y todas las diluciones, (Tabla 2; Figura 4), en huevos solo se presentaron infecciones aisladas, en concentraciones de 1 × 10⁶ de cada cepa, excepto la RH4 que infectó en todas las concentraciones en este lapso de tiempo. Siendo hasta las 96 h en donde se presentan infecciones mayores en huevos, en todas las concentraciones para cada cepa (Figura 5). Para el caso de los juveniles se observaron efectos hasta las 96 h de evaluación en algunos huevos eclosionados (Figura 6), a excepción de la cepa U9, que la infección en juveniles se presentó hasta las 120 h. La cepa que mostró los mejores resultados fue la RH4.

Fuente. Elaboración propia

Figura 4 Quiste de G. rostochiensis parasitado in vitro a las 72 h con Beauveria spp. 

Fuente. Elaboración propia

Figura 5 Huevo de G. rostochiensis parasitado con Beauveria sp. 

Fuente. Elaboración propia

Figura 6 Huevo eclosionado de G. rostochiensis parasitado con Beauveria sp.