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Introducción
La fragmentación del hábitat natural de los recursos fitogenéticos a nivel global, ha ocasionado pérdidas del germoplasma en especies vegetales (Aguilar et al., 2019; Salgotra & Chauhan, 2023). Por tanto, es necesario implementar estrategias para la conservación de estos recursos (Sahu et al., 2023). La biotecnología a través del cultivo de tejidos vegetales nos brinda la oportunidad de conservar el germoplasma en condiciones in vitro a mediano plazo (Chandran et al., 2023) En la conservación in vitro, recurrentemente se utiliza un sistema de cultivo por mínimo crecimiento o crecimiento lento, consistiendo en agregar al medio de cultivo inhibidores del crecimiento o la disminución de los nutrientes en el medio de cultivo (Benelli et al., 2022; Spinoso-Castillo et al., 2022). Recientemente, esta técnica se ha utilizado con éxito en la conservación de diversas especies vegetales como: anturios (Anthurium andraeanum Linden), caña de azúcar (Saccharum spp. Híbridos) y agave (Agave potatorum Zucc.) (Spinoso-Castillo et al., 2022). Así como en la conservación de plantas ornamentales, particularmente orquídeas como: Catasetum integerrimum Hook. (López-Puc & Herrera-Cool., 2022). Laelia anceps Lindl. (Ramírez-Mosqueda et al., 2019) y Stanhopea tigrina Bateman ex Lind. (Cruz-Cruz et al., 2022).
El saqueo de especies de orquídeas con fines ornamentales es un problema recurrente en todo el mundo (Mackenzie & Yates, 2016; Castillo-Pérez et al., 2019). En México, se extraen especímenes silvestres y en algunas ocasiones especies endémicas de las zonas con alta biodiversidad para su comercio clandestino (Castillo-Pérez et al., 2019; Gutiérrez-Rodríguez, 2022) Aunado a esto, el uso tradicional y cultural de algunas orquídeas contribuye a la reducción de sus poblaciones silvestres (Sosa-Nishizaki, 2009; Beltrán-Rodríguez et al., 2012; Molina-Luna et al., 2015).
Guarianthe skinneri (Bateman) Dressler & E.W. Higgins es una orquídea que se distribuye naturalmente desde México hasta Panamá (Bertolini et al., 2016) Posee alto valor ornamental debido al tamaño y color de sus flores, favoreciendo su extracción ilegal y la reducción de sus poblaciones naturales (Coutiño-Cortés et al., 2018). Este miembro de la familia Orchidaceae se encuentra catalogado como amenazado en la NOM-ECOL-059-SEMARNAT-2010 (SEMARNAT, 2010)., e internacionalmente se encuentra en la categoría II del CITES (Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestre) (CITES, 2023). En consecuencia, el problema radica en que no existe un medio de cultivo in vitro o protocolo que garantice la conservación in vitro de la especie con la finalidad de salvaguardar este valioso germoplasma. El objetivo de este estudio fue evaluar diferentes concentraciones de ácido abscísico (ABA), paclobutrazol (PBZ), ancimidol (ACD) y Polietilenglicol (PEG), para desarrollar un medio de cultivo capaz de lograr la conservación in vitro del germoplasma de G. skinneri, que contribuya a implementar estrategias de preservación de esta orquídea que se encuentra el peligro de extinción.
Materiales y métodos
Material vegetal
Se utilizaron plantas de G. skinneri previamente establecida, provenientes de la germinación asimbiótica de las semillas de esta orquídea. La germinación se realizó en medio MS (Murashige & Skoog, 1962) sin reguladores del crecimiento vegetal (RCVs), suplementado con 30 g L-1 de sacarosa. Se ajustó el pH del medio de cultivo a 5.8 ± 0.2, posteriormente se agregaron 2.2 g L-1 de Phytagel® como agente gelificante. Se dosificaron 20 mL de medio de cultivo en frascos de vidrio de 120 ml, por último, se esterilizaron en una autoclave a 1.5 kg cm-2 de presión y 121°C por 15 min. Los cultivos fueron incubados a una temperatura de 25 ± 2 ºC, bajo una irradianza de 50 ± 5 µmol m-2 s-1 proporcionada por lámparas LEDs.
Conservación in vitro
Se utilizó la técnica de conservación por crecimiento mínimo. Para ello, plantas in vitro de G. skinneri (1 cm de altura) fueron transferidas a medio de cultivo MS suplementado con 30 g L-1 de sacarosa y diferentes concentraciones de ácido abscísico (ABA), paclobutrazol (PBZ), ancimidol (ACD) y polietilenglicol 8000 (PEG). 0, 0.5, 1.0 y 2.0 mg-L-1 para ABA, PBZ y ACD; 0, 10, y 20 g L-1 para PEG. El pH del medio de cultivo se ajustó a 5.8 ± 0.2, posteriormente se agregaron 2.2 g L-1 de Phytagel® como agente gelificante. Por último, se dosificó en tubos de ensayo de (22 × 220 mm) conteniendo 15 ml de medio, se esterilizaron en una autoclave a 1.5 kg cm-2 de presión y 121 °C por 15 min. Los cultivos fueron incubados a una temperatura de 25 ± 2 ºC, bajo una irradianza de 50 ± 5 µmol m-2 s-1 proporcionada por lámparas LED. Todos los reactivos fueron de la marca Sigma-Aldrich Chemical Company, MO, USA. Después de 12 meses de cultivo se evaluó el porcentaje de sobrevivencia, el número de brotes, la altura de brotes (distancia entre la base y el ápice del tallo) y el número de raíces.
Regeneración in vitro
25 plantas individuales (1.5 cm de altura) de G. skinneri obtenidas del mejor tratamiento de crecimiento mínimo fueron transferidos a frascos de vidrio de 120 ml, conteniendo 20 mL de medio de cultivo MS suplementado con 2.0 mg L-1 de 6-Bencilaminopurina (BAP) y 30 g L-1 de sacarosa. Como agente gelificante se utilizó 2.2 g L-1 de Phytagel®. Las condiciones de pH, esterilización de medios de cultivo e incubación fueron las mismas descritas anteriormente. Después de seis semanas de cultivo se evaluó el número de brotes por explante.
Aclimatización
Los brotes con una altura de 3 cm que presentaban un óptimo desarrollo radicular, fueron enjuagados con agua corriente. Posteriormente, se sembraron en sustrato estéril de musgo turboso + agrolita (1:1 v/v) utilizando charolas de 72 cavidades (5 x 5 x 8 cm). Las plántulas se mantuvieron bajo condiciones de invernadero con sombra al 50%, humedad relativa entre el 90 ± 5% y temperatura entre 30 ± 5 °C. Después de ocho semanas de cultivo se evaluó el porcentaje de supervivencia (dividiendo el número total de pantas sembradas entre el número de plantas que prevalecen vivas).
Análisis estadístico
El diseño experimental utilizado en todos los experimentos fue completamente al azar, los experimentos se realizaron por duplicado. Para la conservación in vitro, se utilizaron 25 explantes por tratamiento (un explante por tubo de ensayo). Los datos obtenidos fueron analizados mediante un análisis de varianza (ANOVA) seguido de una prueba de Tukey-Kramer (P ≤ 0.05) utilizando el software IBM SPSS Estadísticas (Versión 21 para Windows). La normalidad y la homogeneidad de la varianza se verificaron mediante las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Levene, respectivamente. Cuando las variables no mostraron estos parámetros, se transformaron en logaritmo natural (ln).
Resultados
Conservación in vitro
Posteriormente a 12 meses en conservación in vitro en todos los tratamientos se observó un 100 % de supervivencia de las platas de G. skinneri. Para la altura de los brotes se observaron diferencias significativas, las cuales se reportan en la Tabla 1. La menor altura observada fue de 1.50 cm obtenida en el tratamiento con 2 mg L-1 de PBZ (Figura 1c), seguida de 1.65 cm observado en 0.5 mg L-1 de ABA (Figura 1b) y 1.80 cm en 2 mg L-1 de ACD (Figura 1d). La mayor altura se observó en el tratamiento testigo con brotes de 7.35 cm (Figura 1a). Con el uso de PEG no se afectó drásticamente la variable altura de los brotes a diferencia del uso de inhibidores del crecimiento vegetal (Figura 1e). Para el número de raíces, se observaron diferencias significativas en los tratamientos evaluados (Tabla 1). De manera general se observó una mayor formación de brotes en el medio de conservación suplementado con ACD, en el cual se obtuvieron 22.90 brotes en el tratamiento con 2 mg L-1, seguido de 18.30 brotes en 1 mg L-1 y 16.10 en 0.5 mg L-1 (Figura 1d). El tratamiento con 2 mg L-1 de PBZ generó 15.00 brotes (Figura 1c), mientras que el menor número de brotes (2.60) se observó en el tratamiento testigo (Figura 1a). Para número de raíces, se observaron diferencias significativas entre los tratamientos (Tabla 1). La adición de PBZ y ACD estimularon la formación de raíces a diferencia de los tratamientos restantes: 22.30 raíces se obtuvieron en el tratamiento con 2 mg L-1 de ACD, 22.0 raíces en el tratamiento con 1 mg L-1 de PBZ y 19.80 raíces en el tratamiento con 1 mg L-1 de ACD. El menor número de raíces (5.70) se observó en 2 mg L-1 de ABA.
Figura 1 Conservación in vitro de Guarianthe skinneri (Bateman) Dressler & E.W. Higgins por 12 meses en mínimo crecimiento: a) MS (tratamiento testigo), b) Ácido abscísico a 0.5, 1.0 y 2.0 mg L-1 (izquierda-derecha), c) Paclobutrazol a 0.5, 1.0 y 2.0 mg L-1 (izquierda-derecha), d) Ancimidol a 0.5, 1.0 y 2.0 mg L-1 (izquierda-derecha), e) Polietilenglicol a 5, 10 y 20 mg L-1 (izquierda-derecha).
Tabla 1 Efecto de la concentración de inhibidores del crecimiento y PEG sobre la conservación in vitro de G. skinneri.Table 1. Effect of growth inhibitor and PEG concentration on in vitro preservation of G. skinneri.
| Tratamiento | Concentración | Altura de los brotes (cm) | Núm. de brotes | Núm. de raíces |
|---|---|---|---|---|
| Testigo | MS | 7.35±0.24a | 2.60±0.49g | 8.40±1.46bc |
| ABA (mg L-1) | 0.5 | 1.65±0.11d | 6.90±0.58e | 8.30±1.54b |
| 1 | 1.85±0.14cd | 4.40±0.42f | 6.30±1.36c | |
| 2 | 1.85±0.12cd | 4.60±0.54f | 5.70±1.22c | |
| PBZ (mg L-1) | 0.5 | 1.95±0.15cd | 7.40±0.88e | 19.20±1.95a |
| 1 | 2.05±0.18cd | 11.60±1.02d | 22.00±2.14a | |
| 2 | 1.50±0.16d | 15.00±1.24bc | 19.40±1.90a | |
| ACD (mg L-1) | 0.5 | 1.90±0.19cd | 16.10±1.34bc | 19.50±1.94a |
| 1 | 2.05±0.15cd | 18.30±1.35a | 19.80±1.98a | |
| 2 | 1.80±0.12cd | 22.90±1.90a | 22.30±2.18a | |
| PEG (g L-1) | 5 | 4.65±0.20b | 7.40±0.94e | 10.30±1.49b |
| 10 | 4.50±0.21b | 6.80±0.68e | 7.50±1.79bc | |
| 20 | 3.25±0.19bc | 9.20±1.12d | 12.10±1.89b |
Los valores representan la media ± ES (error estándar). Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey, 0.05).
Regeneración in vitro y aclimatización
Del tratamiento superior de conservación (2.0 mg L-1 de PBZ), después de seis semanas de cultivo en el medio de regeneración in vitro, se logró la generación de 5.4 brotes por explante en un medio de cultivo suplementado con 2 mg L-1 de BAP (Figura 2a -b). Posterior a ocho semanas en el proceso de aclimatización, se observó un 75% de supervivencia en las plantas de G. skinneri (Figura 2c).
Figura 2 Regeneración in vitro y aclimatización del germoplasma conservado de Guarianthe skinneri (Bateman) Dressler & W. E. Higgins. a) Proliferación de brotes en medio MS con 2.0 mg L-1 de BAP, b) Proliferación de brotes después de seis semanas de cultivo, c) Plantas aclimatizadas después de ocho semanas de cultivo.
Discusión
En este estudio se estableció con éxito un protocolo de conservación in vitro de Guarianthe skinneri a través de un medio de cultivo para mínimo crecimiento. Se observó que el paclobutrazol (PBZ) permitió la conservación in vitro por 12 meses, reduciendo la altura de los brotes, aumentando la formación de brotes y el número de raíces, sin afectar la supervivencia de los mismos. El uso del mínimo crecimiento para la conservación in vitro de recursos fitogenéticos, ha sido la estrategia biotecnológica mayormente usada como conservación a mediano plazo (Chauhan et al., 2019; Spinoso-Castillo et al., 2022). Otra estrategia utilizada y reportada para la conservación a corto plazo, es la elaboración de semilla sintética y su almacenamiento in vitro (Sharma et al., 2020; Rathour et al., 2023). Mientras que la criopreservación es una técnica biotecnológica que permite la conservación a largo plazo (Bettoni et al., 2021; Nausch & Buyel, 2021).
En este estudio se observó que el ABA (0.5 mg L-1) y el PBZ (2.0 mg L-1) tienen efectos similares en la reducción de la altura de los brotes. El ácido abscísico es un regulador del crecimiento vegetal (RCV) que regula diversos procesos fisiológicos en la planta como: el cierre de estomas, la acumulación de cera cuticular, la senescencia de las hojas (desprendimiento de hojas, frutos y otras partes de la planta), la dormancia de las yemas, la regulación osmótica, la germinación de las semillas, la respuesta al estrés y la regulación del crecimiento (Chen et al., 2020). El ABA es un inhibidor de crecimiento vegetal que ha resultado eficaz para la conservación in vitro de diversas especies vegetales como áster (Taraxacum pieninicum) (Kamińska et al., 2021), laelia (Laelia anceps) (Ramírez-Mosqueda et al., 2019), Stanhopea tigrina (Cruz-Cruz et al., 2022), tomate (Solanum lycopersicum) (Al-Abdallat et al., 2017) y vainilla (Vanilla planifolia) (Bautista-Aguilar et al., 2021). Sin embargo, en nuestro estudio se observó que el uso de PBZ influyó en la proliferación de brotes del germoplasma conservado, así como en el aumento del número de raíces a diferencia de las plantas conservadas en ABA.
El PBZ es un RCV ampliamente usado en la inducción de la floración en cultivos en campo, así como en los últimos años se utilizado en técnicas de conservación in vitro por el efecto que tiene en la reducción de brotes (Orozco-Meléndez et al., 2022; Spinoso-Castillo et al., 2022). Su acción en el metabolismo celular, es el bloqueo de la oxidación del ácido ent-kauronoico mediante la inactivación de la oxigenasa dependiente del citocromo P450 durante la síntesis de giberelina, que actúa sobre el alargamiento celular e inhibe el crecimiento de las plantas (Desta & Amare, 2021). El PBZ se ha utilizado en diferentes concentraciones en la conservación in vitro de diferentes especies vegetales. Spinoso-Castillo et al. (2022) determinaron que para la conservación in vitro en mínimo crecimiento por seis meses de anthurium (Anthurium andraeanum) y caña de azúcar (Saccharum spp. híbrido) fue necesario utilizar 1 mg L-1 de PBZ. Mientras que para agave (Agave potatorum) fue necesario adicionar 3 mg L-1 de PBZ. Esto concuerda con lo observado en nuestro estudio, debido a que para la conservación in vitro de G. skinneri por 12 meses fue necesario la adición de 2 mg L-1 de PBZ. Sin embrago, contrasta con lo observado por Cruz-Cruz et al. (2022) en Stanhopea tigrina, en donde 2 mg L-1 de ABA mostró una mayor reducción en la altura de los brotes en comparación de cualquier dosis (0.5, 1.0 y 2.0 mg L-1) de PBZ.
No solo el uso de inhibidores del crecimiento vegetal es utilizado para optimizar protocolos de conservación in vitro del germoplasma vegetal. Existen estudios en donde las condiciones de incubación tienen un papel importante y sinérgico con el uso de inhibidores, logrando conservar por un periodo mayor de tiempo. Samarina et al. (2014) demostraron que se puede conservar Citrus limon cv. Novoafonsky por 12 meses en medio ½ MS a temperaturas de 10 °C con una baja intensidad lumínica (12-14 µmol m-2 s-1). Sin embargo, algunas especies son altamente susceptibles a la reducción de la temperatura de incubación como en el caso de vainilla (V. planifolia) (Bautista-Aguilar et al., 2021).
Las plantas conservadas en PBZ y ABA fueron regeneradas (proliferación de brotes) sin alguna complicación utilizando BAP como RCV. El uso de BAP para la formación in vitro de brotes de G. skinneri ha sido ampliamente reportada: Hernández-Ramírez et al. (2023) utilizaron 1.12 mg L-1 de BAP en medio de cultivo Yasuda. Mientras que Leyva-Ovalle et al. (2020) utilizaron 3 mg L-1 de BAP en medio MS en combinación con el uso de biorreactores de inmersión temporal (BIT).
Conclusiones
Se estableció un protocolo eficiente para la conservación in vitro de G. skinneri por crecimiento mínimo mediante la inhibición en el desarrollo con la adición de PBZ y regeneración del material conservado con BAP. Los sistemas de conservación y regeneración in vitro contribuirán a las estrategias de preservación y reintroducción de germoplasma de este valioso recurso fitogenético.
