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Introducción
El Huanglongbing (HLB) se considera la enfermedad más destructiva de los cítricos; su capacidad de diseminación y patogenicidad representa un riesgo alto para la producción citrícola en México y otros lugares del mundo (SENASICA, 2014). Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), también conocido como el Psílido Asiático de los Cítricos (PAC), es el vector primario del HLB, por lo que su control es vital para el manejo adecuado de la enfermedad (Halbert y Manjunath, 2004; SENASICA, 2014). La asociación del PAC y el HLB han puesto en riesgo a más de 67,000 productores de cítricos de México, que concentran una producción de más de 7 millones Mg, con valor aproximado de MX$10.2 mil millones (SENASICA, 2014). Para frenar la expansión de la enfermedad, el gobierno de México, igual que en otros países, ha impulsado un programa de control basado en tres estrategias: el control químico del vector (PAC) en Áreas Regionales de Control (ARCO), la producción y uso de plantas certificadas y la eliminación de árboles infectados en el momento de su detección (SENASICA, 2014; Lewis-Rosenblum et al., 2015). Sin embargo, la práctica común entre los productores es la aplicación indiscriminada de varias materias activas insecticidas cada temporada (Boina et al., 2009). Ante la situación actual se prevé que el desarrollo de resistencia a diferentes ingredientes activos aumente considerablemente en los próximos años. Tiwari et al. (2012) documentaron que el PAC puede sobrevivir a la aplicación de varios insecticidas, principalmente los que comparten al menos un mecanismo de resistencia y que fueron utilizados de manera intensiva anteriormente para controlar otras plagas de cítricos. Esto significó que para controlar a D. citri en huertas de Florida, EE.UU., se elevara hasta 35 veces la dosis inicial de imidacloprid y 18 veces la de clorpirifos (Tiwari et al., 2011).
En el manejo integrado de plagas es importante detectar cambios tempranos en la susceptibilidad a los insecticidas en uso en poblaciones de campo y así evitar aplicaciones innecesarias para alargar la vida útil de los insecticidas disponibles (Georghiou y Taylor, 1986; Díaz-Zorrilla et al., 2011). Esta detección temprana facilita aplicar medidas opcionales de control y es la base de los programas de control químico de una determinada plaga o vector. El objetivo de esta investigación fue determinar la susceptibilidad de una población de D. citri, proveniente de Martínez de la Torre, a diferentes materias insecticidas de uso común en las regiones citrícolas de Veracruz, México. La susceptibilidad de esta población fue comparada con la de una población de laboratorio para determinar la respuesta relativa de actividad e inferir el desarrollo de resistencia.
Materiales y métodos
El estudio se realizó de mayo del 2012 a abril del 2013 en el Laboratorio de Vectores del Postgrado de Fitosanidad-Entomología y Acarología, del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, Estado de México, y en la Junta Local de Sanidad Vegetal del Ejido la Palma en Martínez de la Torre, Veracruz.
Poblaciones de Diaphorina citri
Para el estudio se obtuvieron dos poblaciones de Diaphorina citri; se denominaron colonia Cazones y colonia Martínez y su identidad fue corroborada mediante claves para Psylloidea propuestas por Yang (1984) y Burckhardt (2007). La colonia Cazones se recolectó de plantas de limonaria (Murraya paniculata L., Rutaceae) y en huertas de naranja (Citrus sinensis L. cv. Valencia, Rutaceae), en ambos casos sin aplicaciones regulares de insecticidas, en la comunidad de Cazones de Herrera, Veracruz. Esta colonia se mantuvo aislada en un invernadero y libre de presión de selección por insecticidas desde el año 2009. Adultos de esta colonia fueron transferidos a plantas de naranja cv. Valencia de 4 meses de edad, mantenidas en un sustrato de vermicompost, tierra de hoja, y agrolita (3:2:1), en bolsas plásticas de 30 x 30 cm colocadas en jaulas entomológicas de madera (60 x 40 x 60 cm) cubiertas con tela de organza. Los adultos permanecieron en los brotes de las plantas durante una semana para permitir la oviposición, luego se retiraron con un aspirador. Las plantas infestadas se mantuvieron en las jaulas en invernadero (25±5 °C y 12:12 h luz:oscuridad) y hasta la emergencia de nuevos adultos, con los que se realizaron los bioensayos.
La colonia Martínez se recolectó de huertas comerciales de lima (Citrus latifolia (Tan) cv. Persa) en el ejido La Palma, Martínez de la Torre, Veracruz. Los productores de este ejido indicaron la falta de efectividad de algunas aplicaciones de insecticidas realizados contra D. citri en campo. Árboles con brotes infestados por ninfas de 5° instar se localizaron durante febrero, marzo y abril del 2013, y se cubrieron anticipadamente con tela de organza para capturar los adultos. Los adultos emergidos entre 24 a 48 h (aproximadamente 10 mil insectos en total), se confinaron en los aspiradores y en grupos de 20 individuos por aspirador; luego se trasladaron en una hielera al laboratorio donde se evaluaron.
Insecticidas
Los insecticidas más utilizados por los productores se seleccionaron para el control del PAC; seis en grado analítico y una formulación comercial; ellos representaron diferentes grupos toxicológicos de acuerdo con la clasificación de Lagunes-Tejeda y Villanueva-Jiménez (1994). Los nombres comunes, concentración del ingrediente activo, compañía fabricante y grupo toxicológico al que pertenecen estos insecticidas son: endosulfán, 96 %, Syngenta, organoclorado-ciclodieno (OC-Cd); dimetoato, 98 %, Sigma Aldrich, organofosforado dimetil alifático (FA-SM); malatión, 96 %, ChemService, organofosforado carboxilado (F-Cx); metomilo, 90 %, Sinochem Hebei Corp., monometil carbamato (CA-MM); abamectina, 95 %, Sigma-Aldrich, insecticida microbiano (I-MICR); lambda-cialotrina, 92.1 %, Syngenta Agro, piretroide (PIRT-I); e imidacloprid, formulación comercial utilizada al 30.20 %, Helmfidor de México, neonicotenoide (NIC). Las diluciones de imidacloprid en los bioensayos se realizaron con agua destilada; el resto de los insecticidas se diluyeron en acetona grado analítico (Reasol®).
Bioensayos
Los bioensayos con insecticidas de contacto en grado técnico se realizaron con el método tópico descrito por Tiwari et al. (2011). Para evaluar cada dosis de insecticida, se utilizaron 20 adultos de 1 a 3 d de emergidos y 2 h en ayuno previo por cada repetición. Los adultos se anestesiaron con CO2 por 2 min para facilitar la aplicación de los tratamientos (Mann et al., 2012). Luego, con un pincel entomológico (000), los adultos se colocaron en el envés de un disco de hoja de naranja C. sinensis cv. Valencia que puso en una caja Petri (Ø 4.0 cm), con una base de 3 mm de agar-agar 1 % (Merck®); la caja fue cubierta con malla de nylon para mantenerla ventilada. Los insecticidas (0.2 μL) se aplicaron con una jeringa de repetición para cromatografía (Hamilton®) de 10 μL, acoplada a un microaplicador (Hamilton® modelo PB-600-1), sobre el pronoto de cada individuo. Las cajas con los insectos tratados se mantuvieron a 27±1 °C, 50 % HR y fotoperiodo de 14:10 h luz:oscuridad. La mortalidad se registró 24 h después de la aplicación.
El bioensayo con imidacloprid se realizó con el método sistémico propuesto por Boina et al. (2009). Las raíces de una plántula de naranja cv. Valencia de 120 d de edad, se sumergieron 48 h en una concentración conocida del insecticida diluido en agua destilada. Luego la plántula se transfirió a un recipiente con agua destilada. En una de las hojas se sujetó una jaula entomológica tipo clip, de poliuretano circular (Ø 4.0 cm). Por un orificio lateral de la jaula se introdujeron 20 adultos de 1 a 3 d de emergidos y 2 h en ayuno previo. La mortalidad se registró 24 h después de la aplicación y los tratamientos se mantuvieron en invernadero en las condiciones ya señaladas.
Al inicio, seis dosis logarítmicas entre 0.00001 y 1 % se usaron para detectar las dosis que ocasionaban porcentajes de mortalidad del insecto en el intervalo 10 a 90 %. Al final se seleccionaron ocho dosis logarítmicas en el intervalo para realizar el bioensayo completo. Para cada dosis se utilizaron cinco repeticiones de 20 individuos cada uno de 1 a 3 d de edad, en días diferentes y se obtuvieron 800 insectos tratados con cada insecticida. Cada repetición incluyó un testigo, al que se le aplicó acetona en el bioensayo tópico o agua destilada en el bioensayo sistémico.
El porcentaje de mortalidad individual se registró 24 h después de cada aplicación; el individuo se consideró muerto cuando no presentó movilidad al presionar el abdomen con una aguja de disección. El nivel máximo de mortalidad aceptable en el testigo fue ≤12 %. La mortalidad en los tratamientos se corrigió con la ecuación de Abbott (1925). El diseño experimental fue completamente al azar con cinco repeticiones.
Análisis estadístico
Los resultados se analizaron mediante el procedimiento Probit en SAS® v. 9.2 (SAS, 2009). Los valores obtenidos fueron DL50 o CL50 (dosis o concentración letal que mata al 50 % de la población expuesta, expresada en ng IA insecto-1 o mg mL-1, respectivamente), sus límites de confianza (LC) al 95 % y la línea de respuesta log dosis-mortalidad. El factor de resistencia (FR) se obtuvo al dividir la DL50 o CL50 de la población Martínez entre la DL50 o CL50 de la población Cazones. Las DL50’s o CL50 ́s de las poblaciones comparadas no se consideraron significativamente diferentes entre sí cuando se traslaparon sus LC (Finney, 1971; Robertson y Priester, 1992).
Resultados y discusión
Los adultos de D. citri mostraron susceptibilidad diferente a los siete insecticidas evaluados. La colonia Cazones fue más susceptible que la colonia Martínez; la primera se mantuvo aislada de la presión de selección de insecticidas por más de cinco años lo que permitió considerarla como la colonia de referencia en este estudio. La resistencia de las plagas a los insecticidas es uno de los problemas más graves que impide el avance de los programas de manejo de vectores. Cambiar insecticida, cuando el usado anteriormente ya no funciona, no es una solución efectiva (Ortega et al., 1998). Conocer la susceptibilidad de las poblaciones de campo a los insecticidas puede ayudar a disminuir el uso de productos no efectivos, que encarecen la producción y contaminan el ambiente.
Lambda-cialotrina mostró la toxicidad mayor en la colonia Cazones, según la DL50; en orden decreciente le siguieron abamectina, dimetoato, metomilo, malatión, imidacloprid y endosulfán. El grupo de los piretroides (PIRT) mostró la toxicidad mayor, le siguieron los microbiales (I-MICR), fosforados alifáticos (FA-SM), carbamatos (CA-MM) y fosforados carboxílicos (F-Cx). El grupo de los organoclorados ciclodienos (OC-Cd) fue el menos tóxico (Cuadro 1). Las pendientes registradas para todos los insecticidas fueron mayores de 0.84±0.13, lo cual indicó cierta uniformidad de la colonia para responder a la aplicación de los productos evaluados.
Cuadro 1 Toxicidad de insecticidas en adultos de D. citri, procedentes de Cazones de Herrera (colonia Cazones) y Martínez de la Torre (colonia Martínez), Veracruz, México.
†DL50 o CL50: dosis o concentración letal 50 en ng de ingrediente activo por insecto (ng IA por insecto); ¶LC: límites de confianza al 95%; §b±EE: pendiente con su error estándar; ϸϰ2 : estimación de la línea recta en la regresión; ¤FR50: factor de resistencia 50 (DL50 o CL50 de Martínez/ DL50 o CL50 de Cazones). El valor de imidacloprid está expresado en mg mL-1 para representar una Concentración Letal 50 (CL50).
Lambda-cialotrina también fue el producto más tóxico para la población Martínez, según la DL50. El metomilo mostró la toxicidad menor. Entre estos dos productos en orden de efectividad están abamectina, endosulfán, malatión y dimetoato. El grupo PIRT también fue efectivo, y a diferencia de la colonia de Cazones los menos tóxicos fueron los CA-MM. Las pendientes registradas variaron de 0.51±0.03 (dimetoato) a 1.29±0.087 (abamectina), es decir, la respuesta de la población fue uniforme a la selección con abamectina, lambdacialotrina y endosulfán, y heterogeneidad para malatión, dimetoato y metomilo. Los dos últimos presentaron un factor de resistencia (FR50) elevado (Cuadro 1).
El FR50 de cada insecticida evaluado en la colonia de Martínez (Cuadro 1), en relación con la colonia Cazones, indicó susceptibilidad a los insecticidas abamectina, endosulfán, lambda-cialotrina, imidacloprid y malatión, debido a que los valores fueron semejantes a los de la población de referencia y por el traslapo de los límites de confianza. El FR50 estimado para metomilo y dimetoato indicó que se expresaron los genes que aportan resistencia a estos insecticidas en adultos de D. citri de Martínez de la Torre. La separación de los límites de confianza de las líneas log dosis-Probit permitieron confirmar la falta de susceptibilidad de la colonia Martínez, según la DL50 al tóxico evaluado. Esto mostró la capacidad de los adultos de la población de campo para sobrevivir independientemente de la presencia de esos productos (Cuadro 1).
La colonia Cazones se ha mantenido por más de cinco años libre del patógeno y de la aplicación de insecticidas. Adultos de esta colonia fueron susceptibles a los siete insecticidas evaluados, por lo que las líneas log dosis-Probit de cada insecticida pueden utilizarse como referencia para el manejo de la resistencia del psílido en Veracruz, México (Prabhaker et al., 2006). De acuerdo con Tiwari et al. (2010), el empleo de insectos libres de HLB da certeza a los bioensayos, ya que la susceptibilidad a los insecticidas se reduce en poblaciones de PAC infectadas con Candidatus Liberibacter asiaticus.
La colonia Martínez contiene genes de resistencia en frecuencia detectable para los insecticidas metomilo y dimetoato. En México, y en particular en la región productora de lima Persa de Martínez de la Torre, se ha usado insecticidas de los principales grupos químicos (organoclorados, organofosforados, carbamatos, neonicotenoides y piretroides, entre otros) contra D. citri, desde que estuvieron a la venta (Córtez-Mondaca et al., 2010; Díaz-Zorrilla et al., 2011). Es probable que los niveles de resistencia registrados en este estudio se relacionen con el historial de exposición previo. Esto concordaría con las observaciones de algunos productores de la región, respecto a la falta de control de D. citri con aplicaciones de insecticidas convencionales, y con Tiwari et al. (2011); ellos indicaron que la resistencia de D. citri a insecticidas organoclorados y neonicotenoides fue mayor en áreas de Florida, donde se usaron con frecuencia mayor.
Por el contrario, la susceptibilidad relativa de la colonia Martínez a abamectina, lambdacialotrina, endosulfán, malatión e imidacloprid podría explicarse por la selección escasa de los mecanismos de resistencia asociados a estas moléculas. Por ello, la frecuencia de genes de resistencia aún no está en niveles detectables. Los niveles altos de resistencia algunas veces han mostrado efectos opuestos. En poblaciones de D. citri de Florida expuestas a dosis subletales de imidacloprid se detectaron incrementos de enzimas detoxificadoras (glutatión transferasa (GTS) y citocromo P450 oxidasas), que les permitió sobrevivir a la exposición a insecticidas (Tiwari et al., 2011; 2012). La resistencia a clorpirifos y fenpropatrina continúa en incremento en Florida, y estos productos son utilizados intensamente para el control de esta plaga (Tiwari et al., 2013). El imidacloprid es costoso pero efectivo contra D. citri (Hernández-Fuentes et al., 2012). El producto ejerce una acción agonista en los receptores postsinápticos de acetilcolina (IRAC, 2014), que es el sitio específico de los insectos que les confiere toxicidad baja a mamíferos (Liu et al., 2005; Phua et al., 2009). Además requiere aplicarse adecuada y oportunamente para que sea traslocado y abata las poblaciones (Tomizawa y Casida, 2003).
El dimetoato es un producto usado en México para el control de insectos chupadores desde hace varias décadas (Hernández-Fuentes et al., 2012). Inhibe la acción de la acetilcolinesterasa (IRAC, 2014) y se usa en el control de D. citri en huertas con tasa baja de infestación. El dimetoato es ampliamente aceptado por los productores ya que en apariencia es efectivo contra plagas diversas. Este producto es recomendado en folletos técnicos distribuidos por el Gobierno Federal (Córtez-Mondaca et al., 2010; Díaz Zorrilla et al., 2011; Robles-González et al., 2011); pero en los textos se enfatiza que el producto sólo debe aplicarse una vez al año y con la dosis recomendada para evitar la selección de insectos resistentes (Córtez-Mondaca et al., 2010). El dimetoato puede degradarse con más de cuatro tipos de enzimas detoxificadoras, de modo que podría crearse resistencia cruzada con varios insecticidas que comparten por lo menos un mecanismo de resistencia (Lagunes-Tejeda y Villanueva-Jiménez, 1994). Este fenómeno es común entre compuestos organofosforados y carbamatos (Tiwari et al., 2012) y ello puede explicar, en parte, la tolerancia de la población de campo a metomilo (83.58 X) y la separación de las líneas de respuesta entre las colonias estudiadas. La acetilcolinesterasa (AChE) y GTS (Zhu y Gao, 1999; Gao y Zhu 2000; Tiwari et al., 2012) son las enzimas en mecanismos comunes, que se han identificado en la tolerancia de varios insectos al dimetoato y metomilo. El metomilo no está autorizado para el control de D. citri en México y aparentemente no se ha empleado en años recientes para el combate del PAC en Martínez de la Torre. Esto confirma la importancia de tener la referencia de susceptibilidad de la mayoría de grupos toxicológicos posibles, inclusive de productos que podrían ser autorizados próximamente para el control del PAC, y prevenir problemas de control (Prabhaker et al., 2006). La aplicación continua y anárquica de insecticidas en las regiones citrícolas de Veracruz conducirá a disminuir la vida útil de los grupos toxicológicos. Éste puede ser el caso de dimetoato con clorpirifos, que comparten mecanismos de resistencia por acción de GTS y citocromo P450 oxidasas (Ortega, 1998; Ortega et al., 1998; Tiwari et al., 2011). El uso de dimetoato y metomilo debe limitarse en Martínez de la Torre, debido a los niveles de resistencia encontrados en D. citri, para no continuar incrementándola en estos y otros productos. Según Georghiou y Taylor (1986), el control de una especie podría perderse con 1 % de individuos resistentes en una a seis generaciones.
El desarrollo y establecimiento de la resistencia es posible en escenarios con presión de selección alta, sin rotación adecuada de insecticidas o con el uso del mismo grupo toxicológico (Ortega et al., 1998; Lagunes-Tejeda et al., 2009). La resistencia es un proceso dinámico (Georghiou y Mellon, 1983), por lo que parece necesario realizar un monitoreo constante en cada área agrícola. Las líneas base obtenidas en este estudio son una referencia para el monitoreo de la resistencia a estos insecticidas aplicados contra D. citri. Según Tiwari et al. (2011), en 1998 se reportó la presencia de D. citri en huertos de cítricos en Florida; luego, el manejo regional de la plaga se ha realizado continuamente, basado en el uso racional y selectivo de insecticidas. Lo anterior ha promovido la reducción de desarrollo de resistencia. El manejo de D. citri basado en grupos toxicológicos es factible; así disminuye la frecuencia de aplicación, se evita el uso de mezclas y de insecticidas de persistencia ambiental prolongada, se definen los momentos más oportunos para realizar acciones de control químico por región y se incorporan métodos de impacto ambiental menor.
Conclusiones
La colonia Cazones de D. citri originaria de Cazones de Herrera, Veracruz, fue susceptible a los insecticidas endosulfán, dimetoato, imidacloprid, malatión, metomilo, abamectina y lambda-cialotrina. La colonia Martínez, de Martínez de la Torre, Veracruz, mostró susceptibilidad a endosulfán, imidacloprid, abamectina, malatión y lambda-cialotrina y resistencia a dimetoato y metomilo.
Las líneas log dosis-Probit de cada insecticida de la colonia Cazones pueden ser una referencia para la toma de decisiones en el manejo de la resistencia de D. citri.
