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INTRODUCCIÓN
Los islotes pancreáticos tienen una capacidad antioxidante reducida comparada con otros tejidos (Wang et al., 2017; Lenzen, 2017), es por esto que la disfunción y apoptosis de las células beta se han asociado a los efectos del estrés oxidativo (Eguchi, Vaziri, Dafoe & Ichii, 2021; Drews & Düffer, 2012) en modelos animales de diabetes (Salazar-García & Corona 2021; Lee et al., 2012) y en pacientes diabéticos (Mizukami et al., 2014; Yaribeygi, Sathyapalan, Atkin & Sahebkar, 2020).
El tratamiento con estreptozotocina (STZ) en roedores incrementa la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que resulta en estrés oxidativo que afecta a las células beta pancreáticas (Sasikumar, Jyoti Das & Chandra Deka, 2021; Zhang et al., 2016) además de favorecer su muerte por apoptosis (King, 2012). Nuestro grupo de trabajo demostró el efecto protector de los andrógenos en contra del daño por apoptosis temprana producido en las células beta pancreáticas (Morimoto et al., 2005). En este estudio se encontró que la testosterona protegía directamente a las células beta en contra del daño producido por el tratamiento con STZ (50 mg/kg de peso); dado que este efecto fue totalmente bloqueado por la flutamida (antagonista del receptor de andrógenos) se demostró que el receptor de andrógenos tiene un papel central en este efecto protector (Morimoto et al., 2005). La participación de los receptores de andrógenos en el efecto protector inducido por la testosterona está respaldada por evidencias previas de su expresión y regulación en el páncreas de rata (Pousette, 1976; Díaz-Sánchez, Morimoto, Morales, Robles-Díaz & Cerbón, 1995). Además, recientemente se ha demostrado la localización de los receptores de andrógenos en el núcleo de las células beta pancreáticas de ratas macho, así como en la línea celular INS-1 de las células beta pancreáticas (Harada et al., 2015, 2018). Como prueba adicional de la participación de los receptores de andrógenos, la citoprotección proporcionada por la testosterona es específica del género y parece estar vinculada a los niveles diferenciales de las enzimas antioxidantes presentes en ratas hembra y macho (Palomar-Morales, Morimoto, Mendoza-Rodríguez & Cerbón, 2010).
Aunque se sabe que la testosterona reduce el daño por apoptosis en las células beta pancreáticas (Morimoto et al., 2005; Harada et al., 2015, 2018), el mecanismo a través del cual se da la protección no está del todo claro. Una posibilidad es que la testosterona ejerza su efecto protector a través de la inducción de enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa dependiente de manganeso (MnSOD) y la catalasa. La MnSOD está en la primera línea de defensa antioxidante, neutraliza el oxígeno singulete y convierte espontáneamente los radicales superóxido en peróxido de hidrógeno (H2O2). Posteriormente, la catalasa promueve la descomposición del H2O2 (Wang et al., 2017). El objetivo del presente estudio fue explorar el posible papel de la testosterona en la regulación de los niveles de proteína y de la expresión génica de dos enzimas antioxidantes, la MnSOD y la catalasa, en los islotes pancreáticos de ratas macho.
Materiales y Métodos
Animales
Todos los procedimientos realizados fueron llevados a cabo de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999 para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio.
Se trabajó con ratas Wistar machos de 200 a 250 g de peso, procedentes del bioterio del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición, “Salvador Zubirán” (INCMNSZ). Los animales se alojaron en cajas de acrílico (Macrolon, Tipo III, México) a razón de 5 animales por caja y se mantuvieron bajo condiciones de 12/12 horas luz/obscuridad a una temperatura de 22 ± 1 °C y a una humedad relativa de 50-80%. La comida que se les proporcionó fue alimento estándar para roedores y agua ad libitum. Se plantearon dos aproximaciones experimentales, in vivo e in vitro, en el modelo in vivo se estudió el nivel de la proteína de las enzimas MnSOD y catalasa. En el modelo in vitro se estudió la expresión del ARNm de estas dos enzimas antioxidantes.
Modelo in vivo
Grupos experimentales
Para estudiar el efecto de la testosterona en la expresión de la proteína de las enzimas MnSOD y catalasa en el páncreas de ratas macho adultas, se hicieron 3 grupos (5 ratas por grupo) a los cuales se asignaron las ratas aleatoriamente. El grupo 1, fueron las ratas control; el grupo 2, las ratas gonadectomizadas e inyectadas con el vehículo; y el grupo 3, las ratas gonadectomizadas y tratadas con testosterona (enantato de testosterona; Shering Mexicana, Ciudad de México, México).
Tratamientos
Las ratas de los grupos 2 y 3 se gonadectomizaron bajo anestesia con ketamina-xilazina (Ritschl et al., 2015). La cirugía inició con una incisión a través del saco escrotal para abrir la cavidad peritoneal y exponer los testículos. El paquete testicular se ligó con sutura de seda 4-0 antes de suturar la incisión. A las 72 horas posteriores a la gonadectomía, las ratas del grupo 2 recibieron una inyección intramuscular del vehículo (500 µL de aceite de maíz) y las del grupo 3 recibieron una inyección de enantato de testosterona (5 mg/kg de peso) en una dosis única. Para determinar el tiempo ideal de la administración de testosterona post-gonadectomía, se realizó una curva de concentraciones de testosterona en suero contra los días después del tratamiento (datos no mostrados). Tres días después del tratamiento con testosterona, se procedió a la eutanasia de las ratas, al aplicarles una sobredosis de anestesia y tomarles muestras de sangre por punción cardiaca (Parasuraman, Raveendran & Kesavan, 2010). Las muestras sanguíneas se centrifugaron para obtener el suero, que se almacenó a -20°C hasta su análisis.
Cuantificación de glucosa y diversas hormonas
Las concentraciones de glucosa, insulina, estradiol y testosterona se midieron en el suero de las ratas. Las hormonas se cuantificaron por radioinmunoanálisis (RIA) específico, usando estuches comerciales (Diagnostic Product Corporation, Los Angeles, CA, USA) y con base en las instrucciones del protocolo incluido en el estuche. La sensibilidad del RIA fue de 0.05 ng/mL para insulina, 5 pg/mL para estradiol y 2.47 pg/mL para testosterona. Los coeficientes de variación intra- e inter-ensayo fueron de 3.6% y 6%, 5.3% y 8%, 4.9 y 8.2%, respectivamente. La concentración de glucosa fue cuantificada con un glucómetro portátil (Prestige Smart System, Home Diagnostics, Ft Lauderdale, FL, USA).
Análisis de la proteína por inmunohistoquímica
El tejido pancreático fue disecado y fijado en paraformaldehido al 4% (p/v) en solución salina de fosfatos (PBS, 100 mM, pH 7.4). El tejido se deshidrató sumergiéndolo en una solución de etanol en concentraciones crecientes (25, 50, 70, 80, 96%, absoluto), se enjuagó con xileno y se incluyó en parafina (Paraplast Plus, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA). Se hicieron cortes histológicos de 5 μm de grosor de los bloques de páncreas y se montaron en laminillas recubiertas con poli-L-lisina (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA). Los cortes fueron desparafinados sumergiéndolos en xileno (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) y después rehidratados en etanol en concentraciones decrecientes. La actividad endógena de la peroxidasa se bloqueó con 3% de H2O2/ metanol (v/v) a temperatura ambiente, durante 30 minutos. Para prevenir la unión no específica del anticuerpo, los cortes de tejido se incubaron en 10% de suero normal diluido en solución salina de fosfatos (PBS) con albúmina sérica bovina (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) al 1% (p/v), durante 60 minutos. Después de lavar las preparaciones con PBS, se incubaron toda la noche a 4 °C con el anticuerpo primario, para la detección de MnSOD (E-10 sc-137254; dilución, 1:150) o de catalasa (H-9, sc-271803; dilución, 1:100). Al final de la incubación las preparaciones se enjuagaron con PBS por 10 minutos. La detección del anticuerpo primario, se llevó a cabo con el uso de un anticuerpo secundario (Goat-anti-Mouse IgG-HRP) a una dilución 1:100 por 2 horas a 37 °C. Todos los anticuerpos utilizados se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA). Al finalizar este tiempo, las preparaciones se enjuagaron en agua destilada y posteriormente se incubaron con el substrato 3,3′-diaminobenzidina (DAB, Zymed®/Invitrogen Inc., CA, USA). Después de la tinción nuclear con hematoxilina de Mayer’s (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), las laminillas se enjuagaron con agua destilada y se montaron con medio de montaje (Entellan; Merck, Darmstadt, Germany; OB046327) y se cubrieron con un cubreobjetos. Los controles negativos se procesaron con el procedimiento descrito previamente, pero no se les agregó el anticuerpo primario (datos no mostrados). Las preparaciones se analizaron usando un microscopio de luz y se tomaron fotografías de ellas. La señal de inmunomarcaje se evaluó con un software de análisis para obtener el valor promedio de la señal convertida en tonos de gris (Zeiss KS 300 Carl Zeiss IMT Corporation, Oberkochen, Germany). La intensidad del gris se convirtió a valores numéricos en una escala de 0 (blanco) a 255 (negro), mientras más cercano a 255 sea este valor de gris, habrá una mayor abundancia de la expresión de la enzima que se está analizando.
Modelo in vitro
Obtención de islotes pancreáticos
La expresión de los genes de las enzimas antioxidantes MnSOD y catalasa, se estudiaron en islotes pancreáticos en cultivo. La eutanasia de las ratas se realizó con una sobredosis de pentobarbital (120 mg/kg BW) (Zatroch, Knight, Reimer & Pang, 2017). El páncreas fue canulado a través del ducto pancreático y distendido con una inyección de 10 mL de solución salina de Hank’s y se disecó, posteriormente se digirió con 10 mg de colagenasa V (Merck, México). Los islotes se separaron de entre el tejido acinar, usando un gradiente discontinuo de ficol, como se describió previamente (Morimoto, Fernandez-Mejia, Romero-Navarro, Morales-Peza & Díaz-Sánchez, 2001). Los islotes fueron colectados manualmente bajo un microscopio estereoscópico y transferidos a una caja de cultivo de 6 pozos con medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal y 100 U/mL de penicilina más 100 mg/mL de estreptomicina (Invitrogen Inc. CA, USA) para mantenerlos en una incubadora de cultivo a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 y 95% de aire. Los islotes pancreáticos, se incubaron por toda la noche para su recuperación.
Incubación de los cultivos
Los islotes en cultivo se lavaron y se incubaron en solución salina de Krebs modificada (Alonso-Magdalena, Morimoto, Ripoll, Fuentes & Nadal, 2006), se trataron con vehículo (etanol al 0.01%), testosterona disuelta en etanol absoluto (0.01, 0.1 y 1 µg/mL) o dihidrotestosterona (DHT), un andrógeno no aromatizable, también disuelto en etanol absoluto (0.01, 0.1 y 1 µg/mL) durante 1 hora. Después de la incubación se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1.5 mL donde se almacenaron a -70 °C hasta su procesamiento para la obtención de ARN.
Extracción de ARN y análisis por retro transcripción y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR)
El ARN fue extraído de los islotes pancreáticos usando un estuche comercial (RNeasy plus Mini Kit Qiagen, Valencia, CA, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN fue determinada por espectrofotometría usando un equipo Biodrop duo (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA). La retrotranscripción del ARN se realizó con el estuche SuperScript II (Invitrogen Inc., CA, USA) usando oligo dT como cebador. La expresión de los genes correspondientes a la MnSOD y a la catalasa fue analizada por PCR en tiempo real en un termociclador Light Cycler 2.0 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) usando el estuche Light Cycler Taqman Master de Roche, de acuerdo con el siguiente protocolo: activación de la Taq ADN polimerasa y desnaturalización del ADN a 95 °C por 10 minutos, después 40 ciclos de amplificación a 95 °C por 10 segundos, 60 °C por 30 segundos y 72 °C por 10 segundos. Los datos fueron normalizados contra un control de expresión constitutiva que en este caso fue la β-actina. La expresión relativa de los genes de interés se calculó con el valor del Ct, y el método del 2-ΔΔCt.
Diseño de oligonucleótidos
Los oligonucleótidos específicos para los genes que codifican a MnSOD, catalasa y β-actina fueron diseñados en la página www.oligo.net. Para prevenir falsos positivos debido a la amplificación de ADN genómico contaminante, todos los oligonucleótidos fueron diseñados para alinearse a secuencias de exones separadas por un intrón. Las secuencias fueron obtenidas del GenBank y son los siguientes: para MnSOD, sentido, 5’- TGGACAAACCTGAGCCCTAA-3’ y contrasentido, 5’-GACCCAAAGTCACGCTTGATA-3’, número de acceso NM_017051.2. Para catalasa oligonucleótido sentido, 5’-CAGCGACCAGATGAAGCA-3’ y contrasentido, 5’-GGTCAGGACATCGGGTTTC-3’, número de acceso NM_012520.1. Para β-actina oligonucleótido sentido, 5’- CCCGCGAGTACAACCTTCT-3’ y contrasentido 5’-CGTCATCCATGGCGAACT-3’, número de acceso NM_031144.3. Los tamaños de los amplicones resultantes fueron 77, 61 y 72 nucleótidos respectivamente. Las sondas que se utilizaron para hibridar y detectar a los productos de PCR de cada gen estudiado, fueron la 67, 12 y 69 respectivamente, de la Biblioteca universal de sondas de Roche Applied Science (Indianápolis, IN, USA).
Análisis estadístico
Los datos de inmunohistoquímica, expresión de genes y concentraciones de glucosa, insulina, estradiol y testosterona fueron analizados con la prueba de ANOVA, seguida por el método de Tukey de comparación múltiple de medias como prueba post-hoc. Se consideró significancia estadística cuando P<0.05.
Resultados
Modelo in vivo
Concentraciones de glucosa y de hormonas en respuesta al tratamiento con testosterona
No se encontraron diferencias significativas en las concentraciones de glucosa, insulina o estradiol en el suero de las ratas entre los tres grupos experimentales (Tabla I). La concentración de testosterona en las ratas gonadectomizadas, disminuyó a una quinta parte del valor observado en las ratas control e incrementó seis veces el valor en las ratas gonadectomizadas cuando fueron tratadas con testosterona. Estos resultados muestran que la gonadectomía y la substitución con una fuente exógena fueron efectivas.
Tabla I Concentraciones de insulina, estradiol y testosterona en el suero sanguíneo de ratas macho control, gonadectomizadas y tratadas con el vehículo, y gonadectomizadas y tratadas con testosterona.
| Tratamiento | Glucosa (mmol/L) |
Insulina (pmol/L) |
Estradiol (pmol/L) |
Testosterona (nmol/L) |
|---|---|---|---|---|
| Control | 6.6 ± 0.30 | 75 ± 45 | 49.9 ± 6.0 | 3.8 ± 2.6a |
| Gonadectomizados + vehículo | 6.3 ± 0.21 | 75 ± 43 | 55.8 ± 11.0 | 0.7 ± 0.2b |
| Gonadectomizados + testosterona | 6.8 ± 0.22 | 45 ± 28 | 57.6 ± 6.2 | 21.2 ± 5.6c |
Las concentraciones de testosterona fueron las únicas que mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los tres grupos estudiados. Los datos se presentan como la media ± EE, n= 5 ratas por tratamiento. Las letras diferentes refieren diferencias estadísticamente significativas (P<0.05).
Inmunohistoquímica
Para conocer el posible efecto de los andrógenos (testosterona y DHT) sobre el contenido de proteína de las enzimas antioxidantes MnSOD y catalasa, se obtuvieron cortes de tejido pancreático de ratas macho adultas de los tres grupos de estudio (intactas, gonadectomizadas inyectadas con el vehículo y gonadectomizadas e inyectadas con testosterona) que se procesaron por la técnica de inmunohistoquímica. Para las dos enzimas antioxidantes se observó una tinción positiva en la porción endocrina del páncreas, pero no en la región acinar. La tinción se localizó en el núcleo y citoplasma (Figura 1) de las células de los islotes pancreáticos.
Figura 1 Imágenes representativas de los estudios por inmunohistoquímica de MnSOD (A, B y C) y catalasa (D, E y F). Ratas intactas (control), A y D; ratas macho gonadectomizadas y tratadas con el vehículo (aceite de maíz), B y E; y ratas gonadectomizadas y tratadas con testosterona C y F. n=5 ratas por tratamiento. Escala de la barra = 50 µm.
Se encontró una señal reducida para MnSOD en los islotes de las ratas gonadectomizadas y tratadas con el vehículo (1B) comparadas con los islotes de las ratas control (1A). En las ratas gonadectomizadas y tratadas con testosterona (1C), se observó un aumento significativo de la tinción comparado con los islotes de las ratas control y gonadectomizadas y tratadas con el vehículo. Estos datos pueden ser observados numéricamente en la Figura 2 donde se muestra la inmunoreactividad expresada como la intensidad en tonos de grises, donde 0 es blanco y 255 es negro, mientras más alto sea el valor, habrá una mayor abundancia de la enzima en cuestión. La inmunoreactividad para la catalasa, fue similar en los tres grupos, no encontrándose diferencia en términos de la señal con el anticuerpo ni en la conversión a intensidad de los tonos de grises (Figuras 1D, E y F y Figura 2).
Figura 2 Expresión de la proteína de la MnSOD (A) y catalasa (B). La determinación de la intensidad del marcaje en cada laminilla se realizó con un programa de análisis de imagen por computadora, se graficaron los valores promedio de la intensidad de marcaje de la inmunohistoquímica, convertidos a valores numéricos de intensidad de grises, en una escala del 0 (blanco) al 255 (negro), y entre más alto sea este valor, mayor abundancia de la enzima que se está analizando. Promedio de la intensidad de grises ± EE (n=5 ratas por tratamiento, 10-20 islotes por rata). Ratas gonadectomizadas (castradas) tratadas con el vehículo (Cast + V); ratas gonadectomizadas (castradas) tratadas con testosterona (Cast + T). Las letras diferentes sobre las barras indican diferencias estadísticamente significativas (P<0.05).
Modelo in vitro
Efecto de la testosterona sobre la expresión del ARNm de las enzimas MnSOD y catalasa
Para explorar si el aumento de la cantidad de las proteínas era acompañado de cambios en la expresión del ARNm, se realizó una RT-qPCR para los genes que codifican a la MnSOD y a la catalasa en los islotes pancreáticos de rata tratadas con testosterona y DHT. Tanto la testosterona como la DHT aumentaron la expresión de ARNm de la MnSOD (Figura 3). La testosterona en concentraciones de 0.1 y 1 µg/mL y la DHT a 1 µg/mL indujeron una expresión de entre 1.5 a 5 veces mayor que la expresión en los islotes tratados con el vehículo, en el caso de la catalasa, sólo la testosterona en concentraciones de 0.1 y 1 µg/mL produjo un incremento de entre 2 a 7 veces en la expresión del ARNm comparado con el control, en el caso de la DHT no se observaron resultados concluyentes, pues aunque se observa una tendencia al aumento en la expresión dependiente de la dosis, la dispersión en todos los casos anula la significancia (Figura 4).
Figura 3 Expresión del ARNm de la MnSOD en los islotes pancreáticos de ratas macho, después de 1 h de incubación con diferentes concentraciones de testosterona y DHT. Los resultados se normalizaron frente al ARNm de la β-actina. Los datos se expresan como la media ± EE (n=6-10 experimentos independientes). *P<0.05 comparado con el grupo de control.
Figura 4 Expresión del ARNm de la catalasa en los islotes pancreáticos de ratas macho, después de 1 h de incubación con diferentes concentraciones de testosterona y DHT. Los resultados se normalizaron frente al ARNm de la β-actina. Los datos se expresan como la media ± EE (n=6-10 experimentos independientes). *P<0.05 comparado con el grupo de control.
Discusión
Los radicales libres de oxígeno son producidos naturalmente en las células y juegan un papel muy importante como intermediarios reguladores de diferentes procesos celulares (Sies & Jones, 2020). Cuando ocurre un desbalance en el estado redox de la célula, entran en acción diferentes actores para restablecer la homeostasis, entre ellos las enzimas antioxidantes.
Se dice que un órgano es susceptible al estrés oxidativo cuando los mecanismos de defensa en contra de las especies reactivas de oxígeno (ROS) son inadecuados, o existe una incapacidad de reparar los daños al ADN causados por la oxidación. Los islotes pancreáticos son más sensibles al estrés oxidativo que otros tejidos, debido a una elevada producción endógena de ROS, una baja expresión de enzimas antioxidantes en las células beta y la relativa ineficacia de estas células en la reparación del ADN con daño oxidativo (Lenzen, 2017). Se ha propuesto que el estrés oxidativo es un elemento clave implicado en el deterioro de la función de las células beta durante el desarrollo de la diabetes tipo 1 y tipo 2 (Domingueti et al, 2016). La pérdida de la función de las células beta, causada por un aumento de la apoptosis y manifestada como una capacidad secretora reducida, es un evento clave en el desarrollo de ambos tipos de diabetes (Drews & Düfer, 2012).
Los resultados del presente estudio demuestran que las dos enzimas estudiadas (MnSOD y catalasa), consideradas como la primera línea de defensa antioxidante (Wang et al., 2017), son reguladas al menos parcialmente de forma positiva, por la testosterona en los islotes pancreáticos de ratas macho adultas. Como lo reportó previamente nuestro grupo de trabajo (Morimoto et al., 2005), la testosterona tiene un efecto protector sobre la apoptosis temprana producida por la STZ en las células beta pancreáticas. En las ratas intactas, la STZ produjo un 20% de apoptosis de las células beta comparada con el 60% observado en las células beta pancreáticas de las ratas gonadectomizadas. Además, en las ratas gonadectomizadas y tratadas con testosterona, el porcentaje de apoptosis disminuyó al 30%, similar a lo observado en las ratas intactas. Esta protección provista por la testosterona fue bloqueada con el uso de un antiandrógeno, la flutamida, lo que indica una asociación del efecto protector con el receptor de andrógenos (Morimoto et al., 2005). Además de lo anterior, se sabe que la testosterona protege a las células beta en contra de la muerte por glucotoxicidad (Hanchang, Semprasert, Limjindaporn, Yenchitsomanus & Kooptiwut, 2013) y de la apoptosis inducida por dexametasona (Harada et al., 2015).
Los resultados obtenidos en el presente estudio demuestran que la testosterona y la DHT (un andrógeno no aromatizable) incrementan la expresión del ARNm además de los niveles de la enzima MnSOD en las células beta de los islotes pancreáticos en ratas macho. La catalasa se vio modificada en términos de expresión de ARNm, únicamente por efecto de la testosterona. Si bien los resultados producidos por la DHT sobre la expresión de ARNm de la catalasa, no son estadísticamente significativos, tampoco son concluyentes, pues se observa una tendencia al aumento en la expresión dependiente de la dosis, pero la dispersión anula su significancia.
Los resultados aquí reportados concuerdan con los de varios estudios anteriores, como el de Pang y colaboradores (2002), quienes reportaron que la expresión de la tiorredoxina, glutatión peroxidasa 1 y superóxido dismutasa 2, disminuía con la castración y aumentaba con la sustitución por testosterona. De forma similar, Hanchang y colaboradores (2013) describieron la capacidad de la testosterona para reducir los marcadores de estrés oxidativo y los marcadores de estrés del retículo endoplásmico. Según un reporte de Sadowska-Krepa et al. (2017), la suplementación con testosterona favoreció también una actividad elevada de la SOD en el hígado. Adicionalmente, una investigación reciente, reporta que tanto la testosterona como la DHT incrementan significativamente la actividad de la SOD, y reducen la de la catalasa en células endoteliales, estos efectos fueron revertidos por el antiandrógeno flutamida (Koukoulis et al., 2022).
El efecto protector de la testosterona ha sido comprobado en otros órganos y tejidos incluyendo, células neuronales en cultivo (Hammond et al., 2001), la línea celular PC3 de cáncer de próstata (Lin et al., 2009) y las células granulares del cerebelo de rata (Ahlbom, Prins & Ceccatelli, 2001), además de tejidos como la próstata (Pang et al., 2002), cerebro (Guzmán et al., 2005; Son et al., 2016), corazón (Kłapcińska et al., 2008), hipocampo (Meydan et al., 2010) e hígado (Xu et al., 2017). Así mismo, estudios epidemiológicos han descrito el papel benéfico de la testosterona en la función del páncreas endocrino, por ejemplo, se ha demostrado una asociación positiva entre bajos niveles de testosterona con estados de resistencia a la insulina (Rao et al., 2013). Adicionalmente, este andrógeno ha sido propuesto, como un factor protector contra la diabetes mellitus tipo 2 en pacientes del sexo masculino. En esta investigación se incluyeron 16,709 participantes y se mostró que a mayores concentraciones de testosterona, se reducía significativamente el riesgo de padecer diabetes mellitus tipo 2 en hombres sanos (Yao, Wang, An, Zhang & Ding, 2018). La suplementación con testosterona en hombres con una función gonadal disminuida y diabetes mellitus tipo 2, mejoró la resistencia a la insulina y el control de la glicemia (Kapoor, Goodwin, Channer & Jones, 2006).
Los estudios experimentales que apoyan el beneficio de los andrógenos en la protección contra del estrés oxidativo destacan la importancia del receptor de andrógenos (Hammond et al., 2001; Morimoto et al., 2005; Hanchang et al., 2013; Harada et al., 2015).
La expresión del receptor de andrógenos fue recientemente descrita en el núcleo de las células beta del páncreas de la rata (Harada et al., 2018). Su relevancia para la salud de las células beta fue establecida previamente por Xu et al. (2017), quienes detectaron una disfunción e inflamación de estas células en ratones con deficiencia de receptores de andrógenos.
Los receptores nucleares de andrógenos actúan como factores de transcripción dependientes de ligando (Figura 5). Cuando un andrógeno se une a su receptor, el complejo hormona-receptor interactúa con los elementos de respuesta correspondientes, localizados en el promotor de los genes regulados, para ejercer efectos positivos o negativos en la expresión de dichos genes (Beato & Klug, 2000).
Figura 5 Mecanismo de acción clásico de la testosterona (T). La T se difunde a través de la membrana plasmática y se une a su receptor (RA) formando el complejo T-RA el cual se transloca al núcleo donde se une a secuencias específicas en el ADN (ERA) en los genes regulados por andrógenos modulando su transcripción. En la parte inferior derecha de la Figura se observa de manera simplificada, como se da la síntesis de proteínas a partir del ADN. RA: receptor de andrógenos, T: testosterona, ERA: elementos de respuesta a andrógenos. Imagen creada con BioRender.com
La presente investigación demuestra un aumento inducido por la testosterona en la expresión del ARNm de los genes codificantes para MnSOD y catalasa (en islotes pancreáticos de rata, cultivados), así como en el nivel de la proteína antioxidante MnSOD en ratas macho (utilizando tejido pancreático).
Es interesante saber que existe un dimorfismo sexual con relación al estrés oxidativo (Alonso-Alvarez, Bertrand, Faivre, Chastel & Sorci, 2007) y la actividad de los andrógenos sobre las células de los islotes pancreáticos. En ratas hembra, los andrógenos producen estrés oxidativo sistémico y predisponen a las células beta a la disfunción (Navarro et al., 2018), diferente en ratas macho, la testosterona protege frente a la apoptosis inducida por STZ (Palomar-Morales et al., 2010). En este mismo sentido, la sensibilidad al daño por STZ y la protección por hormonas esteroideas sexuales también se relaciona con el género en modelos de diabetes en ratones, se encontró que los estrógenos y sus receptores son los protagonistas de esta protección (Paik, S. G., Michelis, M. A., Kim, Y. T. & Shin, S. 1982; Le May et al., 2006; Li et al., 2008). En el presente estudio, la deficiencia de testosterona en ratas macho gonadectomizadas condujo a una disminución en los niveles de la MnSOD comparada con la observada en las ratas control. En cambio, la sustitución con testosterona exógena revirtió este efecto, al permitir que los niveles de la MnSOD se aproximaran al nivel del grupo de control. Además, la testosterona y la DHT aumentaron la expresión del ARNm del gen que codifica a la MnSOD. Los resultados del tratamiento con DHT sugieren que el efecto protector no se debió a los estrógenos, que pueden generarse por aromatización de andrógenos (Figura 6). El tratamiento de ratas gonadectomizadas con testosterona no modificó las concentraciones séricas de insulina, glucosa o estradiol, cada una de las cuales se encontró en niveles equiparables en los tres grupos experimentales. Las concentraciones similares de estradiol en todos los grupos permiten suponer que no hubo aromatización periférica de los andrógenos.
Figura 6 Conversión de la testosterona (T) a estradiol (E2), por efecto de la enzima aromatasa y conversión de T a dihidrotestosterona (DHT) por la acción de la enzima 5α reductasa. La aromatasa elimina hidrógenos del anillo A (1) e introduce dobles ligaduras alternadas (2). La 5α reductasa reduce el doble enlace del anillo A (adición de un H (3)), esta reducción impide que la DHT pueda metabolizarse a estradiol.
Conclusiones
El tratamiento con testosterona en ratas macho gonadectomizadas, induce una sobre-expresión del ARNm correspondiente al gen, así como un aumento de los niveles de la enzima MnSOD en los islotes pancreáticos, a través de un mecanismo que no se relaciona con la aromatización de andrógenos, en el que muy probablemente intervienen los receptores de estos, lo que demuestra las implicaciones de la testosterona en la prevención del daño a las células productoras de insulina como un importante factor protector frente a la diabetes mellitus tipo 2.
