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Introducción
El locus del código de barras de la vida en animales (658 pares de bases del gen mitocondrial citocromo oxidasa I) es un marcador genético de gran utilidad para el reconocimiento de especies, debido a que su tasa de divergencia nucleotídica es generalmente mucho menor a nivel intra- que interespecífico (Gregory, 2005; Hebert y Gregory, 2005; Hebert, Ratnasingham y de Waard, 2003). Esta característica hace que sea particularmente atractivo para el estudio taxonómico de grupos megadiversos y poco estudiados de invertebrados, ayudando a detectar problemas taxonómicos, especies crípticas, plasticidad fenotípica e inclusive asociar estadios dentro del ciclo de vida de una especie (Ceccarelli, Sharkey y Zaldívar-Riverón, 2012; Hebert et al., 2003; Lanteri, 2007). En este sentido, el uso de información genética representa una herramienta muy útil para la identificación y resolución de problemas taxonómicos en varias familias de coleópteros (p. ej. Raupach et al., 2010; Cline y Huether, 2011; Davis et al., 2011).
La familia Cerambycidae es una de las familias con mayor riqueza de especies en el orden Coleoptera, se estiman en el mundo alrededor de 35,000 especies descritas (Švácha y Lawrence, 2014), para el Continente Americano se registran alrededor de 9,000 (Bezark, 2016). En México se han registrado 1,621 especies de cerambícidos, siendo 788 (alrededor del 50%) endémicas para el país (Noguera, 2014) y se pueden encontrar desde el nivel del mar hasta sitios de alta montaña a más de 4,000 metros de altitud (Bezark, 2016). La familia está dividida en 8 subfamilias (Švácha y Lawrence, 2014), de las cuales solo Dorcasominae no se ha reportado para el territorio mexicano (Noguera, 2014). Los cerambícidos tienen una considerable diversidad morfológica, aunque casi siempre es posible distinguirlos por la presencia de antenas que a veces son 2 o 3 veces más largas que el cuerpo, así como por tener ojos facetados y tarsos pseudotetrámeros, con el cuarto tarsómero muy reducido (Linsley, 1961; Noguera, 2014). El tamaño de los cerambícidos es muy variable, presentando especies con una longitud que va de los 2.5 (Cyrtinus sp.) hasta los 180 mm (Titanus giganteus). Este grupo comprende especies fitófagas, aunque las larvas son generalmente xilófagas, razón por la que adquieren un importante papel ecológico ya que participan en la descomposición de materia orgánica y circulación de los minerales hacia el suelo (Linsley, 1961). La considerable riqueza específica y la gran diversidad de formas y hábitos presentes en Cerambycidae se relacionan directamente con un gran número de problemas taxonómicos en cuanto a su clasificación y reconocimiento de especies. En México, son pocos los estudios dirigidos a resolver problemas taxonómicos en Cerambycidae, siendo las principales revisiones genéricas (Toledo, 1997; 2005; Noguera, 2002).
La Estación de Biología de Chamela (EBCh) del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México (IBUNAM), se encuentra localizada en una de las regiones de bosque tropical caducifolio mejor preservadas en territorio mexicano. Esta estación representa uno de los principales sitios en el país en donde se realiza investigación tanto de tipo faunístico como florístico. En cuanto a coleópteros, pocos son los trabajos que han permitido conocer la riqueza de especies de algunas familias presentes en esta región (p. ej. Noguera, Vega, García y Quesada, 2002). Con respecto a Cerambycidae, en la EBCh se realizó un estudio faunístico derivado de 10 años de muestreo (Chemsak y Noguera, 1993), en el que se reportaron 306 especies, de las cuales solo 260 están determinadas a nivel específico y se describieron 2 géneros y 23 especies nuevas para la ciencia. No obstante, a pesar de lo exhaustivo de este estudio, la lista de especies en la región podría aumentar debido a la biología que caracteriza a los cerambícidos y a su problemática en la taxonomía de varios géneros y especies reportados.
En el presente estudio se obtuvieron secuencias del código de barras de la vida para ejemplares pertenecientes a 120 especies de Cerambycidae en la EBCh. La generación de esta base de datos genética y su posterior comparación con la morfología externa de los ejemplares examinados permitió identificar 8 casos de especies en donde existe incongruencia entre estos 2 tipos de evidencia, y en las cuales, por lo tanto, es necesario realizar estudios taxonómicos más detallados. Además, se reportan 11 nuevos registros de especies para la región, 8 para el estado de Jalisco, así como un nuevo registro para el país. Este estudio representa el primer inventario para la familia en una región del territorio mexicano en donde se emplea como herramienta para la delimitación de especies el código de barras de la vida, y demuestra el valor que puede tener el uso de diferentes sistemas de caracteres para la realización de inventarios faunísticos de grupos megadiversos y poco estudiados.
Materiales y métodos
La EBCh del IBUNAM se localiza en el estado de Jalisco, México, en el municipio de la Huerta, a 2 km al oeste de la costa y 6 km al sureste de la Bahía de Chamela (19°30’ y 19°33’ N, 105°00’ y 105°03’ O). Los tipos de vegetación predominantes son el bosque tropical caducifolio y la selva mediana subperennifolia (Bullock y Solís-Magallanes, 1990). Por la dinámica de lluvias se originan 2 épocas marcadas: una húmeda que va de junio a octubre, y una seca entre noviembre y junio (Bullock, 1986, 1988).
Los ejemplares se obtuvieron de 10 salidas al campo realizadas de los años 2009 al 2012. De estas salidas, 4 se realizaron en periodo de secas y 6 en época de lluvias. Los ejemplares se recolectaron con trampas de luz negra y blanca, trampas malaise, red de golpeo, red aérea y por recolecta directa. Los organismos fueron preservados en alcohol de 96° y refrigerados a -20 °C hasta el momento de ser montados o procesados para su secuenciación. Los organismos fueron revisados con un microscopio estereoscópico marca Zeiss® Stemi DV4. La identificación a nivel de género y especie se realizó con base en literatura especializada y mediante la comparación directa con material depositado en la Colección Nacional de Insectos del IBUNAM. Además, algunas de las especies fueron determinadas por el Dr. Miguel Monné.
Generación de secuencias de ADN
El trabajo de laboratorio se llevó a cabo en la Universidad de Guelph, Ontario, Canadá y en el Laboratorio de Biología Molecular de Zoología del IBUNAM. En el caso de los ejemplares secuenciados en la Universidad de Guelph, se utilizó el protocolo descrito por Ivanova, Dewaard y Hebert (2006). El trabajo de laboratorio en el IBUNAM consistió en la extracción de ADN genómico y amplificación del locus del código de barras de la vida. Para la extracción de ADN genómico se usó el kit «Dneasy blood and tissue extraction» (QIAGEN®) siguiendo el protocolo del fabricante. La extracción de ADN se obtuvo a partir de aproximadamente 20 mg de tejido muscular de la pata o abdomen de cada individuo.
El marcador genético secuenciado correspondió a un fragmento de 600-658 pares de bases del gen mitocondrial citocromo oxidasa I (COI). Para la amplificación del ADN se preparó una solución con un volumen total de 15 L, el cual contenía: 10.475 L de ddH2O, 1.25 L de 10 × PCR buffer, 0.5 L de 50 mM MgCl2, 0.25 de 10 mM dNTP mix, 0.2 L de primer forward, 0.2 L de primer reverse, 0.125 L de Taq polimerasa platino (Invitrogen®, Carlsbad, CA, EE. UU.), y 2-3 L de ADN (20-50 nanogramos). Las amplificaciones se realizaron utilizando los oligonucleótidos LCO1490 y HCO2198 diseñados por Folmer, Black, Hoeh, Lutz y Vrijenhoek (1994). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: un paso inicial de desnaturalización de 3 min a 95 °C, seguido de 30 ciclos de 94 °C durante 45 segundos, 50 °C durante 45 segundos (temperatura a la cual se observó mejor alineamiento) y 72 °C durante un minuto, y un paso de extensión final a 72 °C durante 5 min, dejando por último a una temperatura constante de 4 °C.
Los productos de PCR sin purificar fueron enviados a la Unidad Genómica de Alto Rendimiento de la Universidad de Washington para la obtención de las secuencias. Todas las secuencias fueron editadas usando el programa MEGA versión 6.0 (Tamura, Stecher, Peterson, Filipski y Kumar, 2013) y alineadas manualmente con base en la traducción de aminoácidos. Se tomaron fotografías con un microscopio estereoscópico marca Leica® Z16 APOA y una cámara Leica® DFC490 para los organismos de talla menor a 2 cm. Para los insectos de mayor tamaño, se tomaron fotografías con una cámara Nikon® Coolpix P100 multiráfaga. Todas las secuencias y fotografías generadas fueron subidas a la página de BOLD (http://www.boldsystems.org/), en el proyecto público «Cerambycidae de Chamela» (CER Project). Esa información es presentada en dicha página web junto con los datos de recolecta de cada organismo y el número de acceso de GenBank de las secuencias generadas.
La delimitación de especies a partir de las secuencias generadas del gen COI se realizó usando el criterio de divergencia genética del 2% (Hebert et al., 2003). Para este método, las distancias genéticas corregidas se calcularon empleando el modelo de evolución K2P (Kimura, 1980) y se visualizaron en un fenograma empleando el método de distancias de «neighbor joining». Las distancias genéticas y el fenograma fueron reconstruidos con la plataforma de BOLD (http://www.boldsystems.org).
Resultados
En el apéndice 1 se presenta una lista de las especies identificadas, así como el número de ejemplares recolectados y secuenciados. Se recolectaron e identificaron 720 ejemplares, obteniéndose 144 especies agrupadas en 82 géneros y 34 tribus pertenecientes a las subfamilias Prioninae, Lepturinae, Cerambycinae y Lamiinae. De estas especies, 11 son nuevos registros para la región de Chamela: Anisopodus mexicanus Bates 1881, Leptostylus cretatellus Bates 1863, Lepturges angulatus (LeConte 1852), Lepturges macilentus Bates 1881, Neoclytus augusti (Chevrolat 1835), Oreodera glauca glauca (Linnaeus 1758), Ozineus cribripennis Bates 1885, Psapharochrus borrei (Dugés 1885), Psyrassa nigroaenea Bates 1892, Ptericoptus caudalis Bates 1880 y Xeranoplium bicolor Chemsak y Linsley 1963. Para Jalisco se reportan como registros nuevos a: A. mexicanus, L. cretatellus, L. angulatus, L. macilentus, O. cribripennis, P. nigroaena, P. caudalis y X. bicolor. Además, se reporta como registro nuevo para México a O. cribripennis.
Delimitación de especies
Se generaron 228 secuencias, de las cuales se descartaron 11 por contener dobles picos en sus cromatogramas. Las 217 secuencias restantes corresponden a 120 de las 144 especies identificadas con evidencia morfológica. El fenograma obtenido se presenta en el material suplementario. La delimitación de especies con base en el criterio de 2% de divergencia genética permitió identificar 132 unidades taxonómicas moleculares, 110 de las cuales fueron congruentes con la identificación morfológica. Ocho morfoespecies presentaron incongruencia con la evidencia molecular. La información molecular dividió a estas morfoespecies en distintas unidades taxonómicas que están separadas por distancias genéticas superiores al 2%. Las especies en las que existe esta incongruencia pertenecen a los géneros Acanthoderes, Essostrutha, Nemognathomimus, Neoclytus, Ornithia, Ozineus y Psyrassa.
Discusión
Riqueza de especies de Cerambycidae en la región de Chamela
El presente trabajo representa el primer estudio faunístico de cerambícidos en una región del territorio mexicano en donde se utiliza la información del código de barras de la vida como herramienta para la delimitación de especies. Entre los resultados obtenidos se aportan 11 especies como registros adicionales al estudio faunístico previo de la familia en la región de Chamela, el cual derivó de 10 años de muestreo en la zona (Chemsak y Noguera, 1993). Los nuevos registros reportados en nuestro estudio, resaltan la importancia de llevar a cabo trabajos faunísticos para Cerambycidae por largos periodos de tiempo, lo cual permitirá conocer su riqueza real de especies y también aportará información sobre sus ciclos de vida, ya que algunas tienen ciclos de vida mayores a 10 años (Linsley, 1961).
Detección de problemas taxonómicos
El uso de herramientas moleculares en estudios de biodiversidad no solo agiliza y facilita la delimitación de especies, sino también sirve como una herramienta adicional para resolver problemas taxonómicos. Estos tipos de enfoques pueden ayudar considerablemente a la taxonomía de Cerambycidae, en donde no se tienen claros los límites de especies en varios de sus géneros. Las incongruencias encontradas entre la evidencia morfológica y molecular para algunas de las especies identificadas ocurrieron en géneros pobremente estudiados en los que no existen claves ni estudios taxonómicos exhaustivos. Además, estos géneros presentan una variación morfológica considerable en sus caracteres diagnósticos, especialmente los de coloración. A continuación se explican los casos de incongruencia morfológica y molecular encontrados y se discute la variación morfológica presente en estos taxones. Esta información facilitará la realización de estudios posteriores más profundos para los taxones involucrados con el fin de resolver de manera conclusiva los límites entre sus especies.
Acanthoderes ramirezi
Los resultados obtenidos permitieron identificar una morfoespecie, identificada como A. ramirezi. No obstante, la información del código de barras delimitó 3 unidades taxonómicas moleculares. De acuerdo con Chemsak y Hovore (2002), A. ramirezi (figs. 1B, C y D) se reconoce por sus ojos toscamente facetados, con lóbulo inferior grande, la forma de los tubérculos del pronoto, indistintas gibosidades en la base de los élitros y la presencia de fascias blancas en los élitros. En los ejemplares recolectados, las 3 últimas características presentan una variación considerable. Por esta razón, A. ramirezi se confunde frecuentemente con otras especies de este y otros géneros que también tienen fascias de color blanco en los élitros, tales como Acanthoderes quadrigibba, Aegomorphus albosignus (fig. 1A) y P. borrei, esta última anteriormente incluida dentro de Acanthoderes (Chemsak y Hovore, 2002).
Figura 1 A) Aegomorphus albosignus Chemsak y Noguera; B, C y D), Acanthoderes ramirezi Chemsak y Hovore, vista dorsal.
Chemsak y Hovore (2002) mencionaron que la variación en coloración en las especies de Acanthoderes es congruente con la distribución geográfica de las especies reconocidas. No obstante, en las 3 unidades taxonómicas asignadas a A. ramirezi que fueron delimitadas existen diferencias morfológicas claras no solo en coloración de élitros y pronoto, sino también en la longitud que tienen las protuberancias del pronoto y élitros (fig. 1).
Essostrutha laeta
Fue identificada una especie para los ejemplares asignados a este género, E. laeta, aunque la información molecular separó a los ejemplares de color naranja con puntuaciones negras en la base y ápice de los élitros de los ejemplares con un solo color en cabeza, pronoto y élitros, y con puntuaciones menos evidentes en el pronoto. En su revisión de Essostrutha, Chemsak (1978) menciona que la variación de coloración en E. laeta representa dimorfismo sexual, y sugiere que los machos generalmente tienen una sola coloración, aunque ocasionalmente pueden presentar el ápice de los élitros de color negro, mientras que las hembras tienen los élitros con una estrecha banda negra en la base y mayor área negra en el ápice, aunque se ha registrado que ambos sexos pueden presentar los élitros totalmente oscuros o negros. La evidencia molecular para los ejemplares originalmente asignados a E. laeta refuta la propuesta de Chemsak (1978). Al revisar los ejemplares, se observó una variación considerable de coloración en ambos sexos (fig. 2), que concuerda con la delimitación con evidencia molecular, la cual separa a los ejemplares de un solo color de los que presentan puntuaciones negras en base y ápice de los élitros de color negro, independientemente de su sexo.
Nemognathomimus
La morfología de los ejemplares indica la presencia de una sola especie con dicromatismo sexual, Nemognathomimus opacipennis (fig. 3). Chemsak y Noguera (1993) describen coloración negra en la cabeza para los machos de esta especie, y coloración naranja en la cabeza para las hembras. Sin embargo, nuestros datos moleculares muestran una distancia genética intraespecífica considerable para los ejemplares secuenciados asignados a N. opacipennis (hasta 4.43%), dividiéndolos en 2 unidades taxonómicas moleculares. Solo se cuenta con secuencias de 3 ejemplares para este taxón, por lo que estudios subsecuentes con un mayor muestreo de ejemplares de ambos sexos permitirá conocer si en realidad existen 2 especies involucradas y no una sola con dicromatismo sexual.
Neoclytus
La identificación morfológica permitió reconocer una especie, N. augusti, aunque la evidencia molecular la dividió en 2 unidades taxonómicas moleculares. Chemsak y Noguera (1993) incluyen a Neoclytus en su listado con 2 especies, aunque no fueron determinadas a nivel específico. Las especies de Neoclytus no han sido estudiadas para México, lo que imposibilitó la identificación de especies usando una clave taxonómica. En este estudio, las especies de Neoclytus se identificaron con base en las descripciones originales. Giesbert (1989) y di Iorio (1995) realizaron estudios taxonómicos para Neoclytus, en los cuales elaboraron claves taxonómicas para las especies de Panamá y Argentina, respectivamente. En dichas claves, los autores hacen referencia a las bandas de setas del pronoto y élitros como carácter importante para la identificación de las especies. Estas bandas, así como la coloración y forma de los antenómeros, se utilizaron para identificar a N. augusti (fig. 4), la cual es muy similar a Neoclytus tenuiscriptus, igualmente reportada para el estado de Jalisco.
La principal diferencia morfológica observable entre los ejemplares secuenciados de N. augusti es la coloración de las bandas sobre los élitros, así como la coloración en los antenómeros terminales. Estos 2 caracteres son muy variables en los individuos recolectados, en particular las bandas de los élitros, las cuales incluso varían en forma. La evidencia molecular separó los ejemplares con coloración amarilla en las bandas de los élitros y antenómeros terminales café claro (fig. 4A) de los que presentan coloración blanca en las bandas elitrales y antenómeros terminales café oscuro (fig. 4B). Este resultado enfatiza la necesidad de realizar una revisión del género, en particular para el territorio mexicano, en donde a la fecha se han reportado 14 especies (Bezark, 2016).
Ornithia
Este género monotípico está representado por O. mexicana (fig. 5), la cual tiene 2 subespecies reconocidas, Ornithia m. mexicana y Ornithia m. zapotensis. El carácter propuesto para distinguir a estas subespecies es la coloración de las bandas sobre el pronoto (Tippmann, 1960). En O. m. mexicana, estas bandas varían de blanco a amarillento, mientras en O. m. zapotensis son de color amarillo limón. Los resultados moleculares delimitaron a 2 unidades taxonómicas moleculares, una para los ejemplares con fémures claramente clavados y bandas blancas sobre el pronoto y élitros (figs. 5C y D), y otra representada por ejemplares con bandas amarillas en el pronoto y élitros (fig. 5A y B). Estos resultados apoyan la asignación de especies para Ornithia anteriormente propuesta por Sturm (1843) y Tippmann (1960).
Ozineus
La incongruencia que fue encontrada en este género pertenece a O. cribripennis (fig. 6), la cual no se tenía reportada para México. Ozineus había sido anteriormente reportado para el país con 2 especies, Ozineus arietinus y Ozineus spinicornis (Bezark, 2016). La delimitación mediante COI derivó en 2 unidades taxonómicas moleculares. La principal diferencia observable en los ejemplares de los 2 grupos delimitados por COI son las puntuaciones sobre el pronoto y élitros, anillos en el escapo, además de la diferencia en la abundancia de pubescencia sobre todo el cuerpo.
Psyrassa
Para este género se encontraron 2 incongruencias entre la información morfológica y molecular en 2 especies distintas. Psyrassa pertenece a una de las tribus con más problemas taxonómicos y con mayor riqueza de especies de Cerambycidae, Elaphidiini (Chemsak, Linsley y Hovore, 1988), teniendo su mayor riqueza en México y Centroamérica (Toledo, 2005). Uno de los casos de incongruencia se detectó en la especie asignada a Psyrassa cylindricollis (fig. 7A y B). Toledo (2005) indicó que esta especie es morfológicamente similar a Psyrassa brevicornis, de la cual solo se distingue por la longitud de las antenas, las cuales son más largas en P. cylindricollis. No obstante, en este trabajo se observó que la longitud de las antenas en P. cylindricollis varía considerablemente. Otro de los caracteres que delimitan a P. cylindricollis es la longitud de la espina del tercer artejo antenal, aunque también es muy variable. Incluso, en nuestros ejemplares examinados se pudieron observar ejemplares con antenas largas pero con la espina del tercer artejo pequeña (menor o igual que 1/3) o viceversa.
El segundo caso de incongruencia en Psyrassa se encontró entre los ejemplares asignados a P. nigroaena (fig. 7C y D). Toledo (2005) discutió sobre el parecido de esta especie con Psyrassa katsurae, las cuales se distinguen por diferencias en la coloración del integumento, la talla completa del ejemplar y las espinas de 2 artejos antenales. Al igual que P. cylindricollis, estos caracteres son muy variables intraespecíficamente, ya que se observaron ejemplares de talla mayor a la descrita en la revisión del género que presentaban el integumento negro.
Como consideración final, el presente trabajo remarca la importancia del uso de herramientas moleculares en estudios de biodiversidad, sobre todo para los grupos de invertebrados megadiversos y poco estudiados, ya que no solo agilizan y facilitan la identificación de especies, sino que además permiten detectar problemas taxonómicos en taxones en donde la información morfológica no logra discernir la variación intra- de la interespecífica. Las investigaciones que empleen un criterio de taxonomía integradora (sensu Padial y de la Riva, 2010) deben ser regularmente utilizadas en estudios de biodiversidad debido a su mayor nivel de resolución en el reconocimiento y delimitación de especies. Los estudios taxonómicos posteriores que se lleven a cabo para los taxones aquí mencionados se verán beneficiados con la evidencia presentada en este estudio.
