Obtención de material vegetal

Hojas frescas de trueno (Ligustrum lucidum) fueron recolectadas en la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (3532º latitud norte, 101.0332º longitud oeste: 1 786 msnm), las hojas de Moringa (Moringa oleífera) fueron obtenidas en Ciudad Obregón, Sonora (27° 22’ 04’’ latitud norte, 109° 55’ 28’’ longitud oeste y 37 msnm), los granos de Sorgo (Sorghum bicolor) se obtuvieron de la variedad BRS-72 (con alto contenido de taninos) en la Ciudad de Tecomán, Colima (18° 54’ 51’’ latitud norte 103° 52’ 30’’ longitud oeste y 33 msnm.) El material vegetal fue trasladado a los laboratorios del Departamento de Alimentos de la Facultad de Ciencias Químicas, donde se seleccionaron hojas y granos en base al tamaño y sin presencia de daño, para ser sometidas a deshidratación por un periodo de dos semanas a temperatura ambiente, posteriormente se pulverizaron y tamizaron (RO-TAP; TYLER), utilizando un tamiz de 150 µ.

Extracción asistida mediante ultrasonido-microondas

El material vegetal pulverizado se colocó en el reactor con las cantidades obtenidas de las relaciones que se muestran en la (Cuadro 1) y se introdujo este reactor en el equipo de ultrasonido y microondas (Nanjing ATPIO Instrumens Manufacture Co., Ltd Company, China) bajo las siguientes condiciones: Ultrasonic (VS): Power Radio 20, Ultrasonic on Relay 10, Ultrasonic off Relay 3, Amplitud off Relay 25 y Set Time 20. Microwave (MV): Power Radio 800, Display power 0, Set Temp 70 °C y Holding Time 5. Después del proceso de ultrasonido y microondas las muestras fueron almacenadas en un ultracongelador a una temperatura de -70 °C.

Cromatografía de columna con amberita

La cromatografía por columna se realizó con el relleno cromatográfico de amberlita XAD- 16N. Esto incluye la activación de la amberlita con el metanol, el empaquetado de la columna, la filtración de los extractos, secado de los extractos y el desempaquetado de la columna cromatografía ^{De Asmundis et al. (2011}).

Recuperación de extracto seco

Una vez obtenida la fracción etanólica, ésta se repartió en recipientes de vidrio y se secaron en estufa a 60 °C, sin exponer a la luz por 24 a 48 h. Finalmente se colectó el extracto seco en forma de polvo en un frasco ámbar a temperatura ambiente para su posterior análisis.

Caracterización de fitoquímicos presentes en los extractos vegetales mediante cromatografía de líquidos de fase inversa (HPLC masas)

El análisis por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa se realizó siguiendo la metodología de ^{Ascacio et al. (2016}), que consiste en utilizar un sistema de HPLC Varian que incluye un inyector automático (Varian ProStar 410, EE. UU.), una bomba ternaria (Varian ProStar 2310, EE. UU.) y un decantor PDA (Varian ProStar 330, EE. UU.). También se utilizó un espectrómetro de masas con trampa de iones de cromatógrafo de líquidos (Varian 500-MS IT Mass Spectrometer, EE. UU.) equipado con una fuente de iones por electropulverización.

Se inyectaron muestras (5 μl) en una columna Denali C18 (150 mm x 2.1 mm, 3 μm, Grace, EE. UU.). La temperatura del horno se mantuvo a 30 °C. Los eluyentes fueron ácido fórmico (0.2%, V/V; disolvente A) y acetontrilo (disolvente B). Se aplicó el siguiente gradiente: inicial, 3% B; 0-5 min, 9% B lineal; 5-15 min, 16% B lineal; 15-45 min, 50% B lineal. Después la columna se lavó y se reacondicionó, el caudal se mantuvo a 0.2 ml min^-1 y la elución se controló a 245, 280, 320 y 550 nm. Se inyectó todo el efluente (0.2 ml min^-1) en la fuente del espectrómetro de masas, sin dividir.

Todos los experimentos de EM se llevaron a cabo en modo negativo [M-H]^-1. Se utilizó nitrógeno como gas nebulizador y helio como gas amortiguador. Los parámetros de la fuente de iones fueron: voltaje de pulverización 5 kV y voltaje capilar y temperatura fueron 90 V y 350 °C, respectivamente. Los datos se recopilaron y procesaron utilizando el Software MS Workstation (V 6.9). Las muestras se analizaron en primer lugar en modo de barrido completo adquiridas en el rango m/z 50-2000.

Obtención e identificación de hongos

Las cepas empleadas en los bioensayos fueron aisladas de plantas de garbanzo con síntomas de marchitamiento y amarillamiento, localizadas en el Valle del Yaqui a una latitud 27° 29.185’ longitud -109° 56.45’ oeste. Pequeños trozos de raíces de plantas con síntomas de la enfermedad se desinfectaron con una solución de cloro al 3% y fueron enjuagadas con agua destilada estéril. Se colocaron en cajas Petri con medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA) y se incubaron por tres días a 28 °C. Finalmente el aislamiento se realizó mediante punta de hifa.

Identificación molecular mediante PCR y amplificación aleatoria de polimorfismo del ADN (RAPD)

Para la extracción del ADN de cada uno de los aislados de los hongos, se utilizaron cultivos de micelio puro crecidos en 50 ml de caldo papa dextrosa, incubados a 25 °C durante ocho días. Al término de este tiempo, los cultivos se centrifugaron a 10 000 rpm por 10 min a temperatura ambiente, se descartó el sobrenadante y la pastilla celular se lavó con PBS. La lisis de la muestra se realizó con 3 ciclos de congelamiento-calentamiento (-80 °C, 75 °C) durante 15 min, maceración e incubación por 15 min en buffer TES (Tris-HCl 50 Mm pH 7.5, EDTA 20 Mm, SDS 1%).

El ADN total del micelio se obtuvo por purificación con el método de fenol-cloroformo-alcohol isoamilico (25:24:1) y se precipitó con etanol. La determinación de la concentración y calidad del material genético se realizó por espectrofotometría (EPOCH; BioTek). Para la identificación de M. phaseolina y F. solani se utilizaron oligonucleótidos específicos que amplifican para una región conservada adyacente al gen 5.8 S y el gen TEF-1α, respectivamente (^{Babu, 2007}; ^{Arif, 2012}).

La amplificación se realizó por PCR con la enzima Taq ADN polimerasa (qARTA Bio) y 100 ng/μL de material genético, utilizando las condiciones de amplificación descritas por estos autores: 25 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 30 s, alineamiento a 56 °C por 1 min, extensión a 72 °C por 2 min, y un paso de extensión final a 72 °C por 10 min para M. phaseolina y 40 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 1 min, alineamiento a 58 °C por 1 min, extensión a 72 °C por 2 min para F. solani.

Aparte, la identificación de las razas patogénicas de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris se realizó mediante la técnica de amplificación aleatoria de polimorfismo del ADN (RAPD) utilizando los marcadores OPF y OPI, en donde se distinguen las razas mediante la ausencia o presencia de patrones electroforéticos con la misma movilidad, las condiciones de amplificación fueron las siguientes, desnaturalización a 94° C por 4 min, seguida de 30 ciclos de 94 °C por 1 min, alineamiento a 40 °C por 1 min, extensión a 72 °C por 3 min y extensión final a 72 °C por 7 min (^{Jiménez-Gasco, 2001}). Los productos amplificados se separaron por electroforesis en geles de agarosa (Ultra Pure Agarose Invitrogen) al 1%, en amortiguador TAE. Los geles fueron teñidos con nucleic acid gel stain (Invitrogen). Las bandas correspondientes de los productos amplificados fueron observadas con luz UV. Se capturaron las imágenes con cámara digital (UVP; GDS-8000).

Actividad antifúngica de los extractos vegetales contra M. phaseolina por el método de medio envenenado

Se determinó la actividad antifúngica por el método de medio envenenado propuesto por ^{Jasso de Rodríguez et al. (2011)}, los tratamientos de los polifenoles obtenidos de: Ligustrum lucidum, Moringa oleifera y Sorghum bicolor fueron en concentraciones de 50 mg L^-1, 100 mg L^-1, 200 mg L^-1, 300 mg L^-1, 400 mg L^-1, 500 mg L^-1 y 600 mg L^-1: con cuatro repeticiones por tratamiento. Primero se determinó la concentración y el volumen para cada uno de los polifenoles y se añadió a un matraz con la cantidad requerida de PDA estéril. Posteriormente se colocaron discos de 0.4 cm de diámetro con micelio activo del hongo de siete días de crecimiento, finalmente se incubaron a 28 ±2 °C hasta que el testigo absoluto lleno la caja por completo. Se determinó el porcentaje de inhibición mediante la siguiente formula: porcentaje de inhibición= (DC-DT/DC)*100. Donde DC es el diámetro del tratamiento control, y DT es el diámetro de las diferentes concentraciones.

Actividad antifúngica de los extractos vegetales contra F. oxysporum f. sp. ciceris y F. solani por el método de microdilución en placa

Se utilizó el método de microdilución en placa adaptada de las técnicas propuestas por ^{Masoko et al. (2005}); ^{Gabrielson et al. (2002}). Para esto se usaron placas de poliestireno de 96 pozos. El procedimiento inicio colocando 100 μl de medio líquido sabouraud en cada pozo de la placa, posteriormente cada grupo de polifenoles se preparó a una concentración de 2 000 mg L^-1 utilizando etanol como solvente, posteriormente se colocaron 100 μl de los polifenoles preparados a 2 000 mg L^-1 en la columna cuatro, se mezclaron y se volvió a tomar 100 μl y se transfirieron a la siguiente columna y así sucesivamente realizando diluciones seriadas al 50% hasta la columna 12, teniendo como resultado concentraciones de 1 000 mg L^-1, 500 mg L^-1, 250 mg L^-1, 125 mg L^-1, 62.5 mg L^-1, 31.2 mg L^-1, 15.6 mg L^-1, 7.8 mg L^-1 y 3.9 mg L^-1, el siguiente paso fue agregar 40 μl de 2,3,5- cloruro de trifeniltetrazolio como revelador de crecimiento a todos los pozos; finalmente a partir de la columna dos se colocó una solución de esporas de F. oxysporum y F. solani a una concentración de 1x10⁸.

Cada placa se consideró una repetición, y se realizaron tres repeticiones por tratamiento, se incubaron a 28 °C por 48 h y finalmente se realizó una lectura de absorbancia a 490 nm en espectrofotómetro. Se consideró crecimiento positivo del hongo a los tratamientos donde el pozo presentó un color rosado y negativo a los que no presentaron ningún color, además de sus respectivos valores de absorbancia. El porcentaje de inhibición se calculó adaptando la fórmula propuesta por ^{Moreno-Limón et al. (2011}), considerando que el porcentaje de inhibición es el inverso del porcentaje de crecimiento. Porcentaje de crecimiento= (A-B)/C(100). Donde: A= absorbancia de tratamiento, B= absorbancia del testigo negativo, C= absorbancia del testigo positivo. Porcentaje de inhibición= 100 - porcentaje de crecimiento.

Análisis estadístico

Los experimentos fueron establecidos bajo un diseño de bloques completamente al azar con tres repeticiones. Se realizó un análisis Probit para determinar la concentración inhibitoria (CI₅₀) de cada grupo de polifenoles, posteriormente se realizó un análisis de varianza con las concentraciones inhibitorias (CI₅₀) y se compararon las medias de los tratamientos utilizando la prueba de rango múltiple de Tukey (α< 0.05).

Fitoquímicos presentes en los extractos vegetales, caracterizados mediante cromatografía de líquidos de fase inversa (HPLC)

Dentro de los resultados obtenidos por HPLC se pueden observar con mayor frecuencia la presencia de compuestos de la familia de flavonas, ácido hidroxicinámico y antocianinas (Cuadro 2).

Identificación y caracterización molecular de los aislados de hongos fitopatógenos

La cepa de Macrophomina desarrollo colonias con las características de crecimiento micelial denso, de aspecto velloso, al inicio de color gris oscuro y posteriormente se tornó de color negro. La colonia desarrollo microesclerocios, estas características fueron similares a las de M. phaseolina Santos-Mier et al. (2015). Para el aislado fúngico analizado por PCR, se logró la amplificación de fragmentos de un tamaño de 350 pb esto confirma que la cepa pertenece a la especie de M. phaseolina, dado que los indicadores MpKF1 y MpKR1son específicos para esta especie de hongo.

De acuerdo con ^{Babu et al. (2007}) las secuencias de ADN obtenidas con los iniciadores específicos MpKFI y MpKRI pueden ser utilizadas para identificar de forma rápida, selectiva y específica el hongo M. phaseolina. De manera similar, ^{Zhang et al. (2011}); ^{Sánchez et al. (2013}) usaron iniciadores específicos MpKFI y MpKRI para identificación y detección de aislados de M. phaseolina en fresa y frijol mungo (Vigna radiata L.), respectivamente (Figura 1a). Para la identificación y discriminación de F. solani se usó el set de primers TEFFs4, para ampliar el gen TEF-1α, mostrando un producto de 658 pb (Figura 1b) como lo reportó ^{Arif et al. (2012}).

Finalmente, para la identificación de las razas patogénicas 0, 1B/C, 5 y 6 de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris por la técnica de RAPD se utilizaron siete oligonucleótidos específicos denominados OPF y OPI (^{Jiménez-Gasco, 2001}). Se examinaron todas las muestras aisladas y se evalúo el patrón de bandeo. Solamente en una muestra se observó un producto de amplificación a 900 pb con el primer OPF-10 (Figura 1c), este producto corresponde a la raza 5 de acuerdo con lo previamente reportado por Del Mar ^{Jiménez et al. (2001)}.

Figura 1 Identificación de los patógenos: a) M. phaseolina (350 pb); b) F. solani (658 pb); y c) F. oxysporum f. sp. ciceris (900 pb). Productos de amplificación separados en un gel de agarosa 1% y teñido con Nucleic acid gel stain (Invitrogen). 

Los resultados de otros estudios han demostrado que en el lugar donde se realizaron los aislamientos se han logrado identificar diferentes razas en diferentes áreas de muestreo (^{Arvayo-Ortiz et al., 2011}). Por lo tanto, los resultados obtenidos por nuestro equipo de trabajo son consistentes con estos hallazgos.

Actividad antifúngica de extractos vegetales contra M. phaseolina por el método de medio envenenado

El efecto de los polifenoles de diferentes fuentes vegetales sobre el crecimiento del hongo M. phaseolina se observan en la Figura 2. Como puede apreciarse los polifenoles de L. lucidum y S. bicolor mostraron total inhibición sobre el crecimiento micelial del hongo a partir de 300 ppm, mientras que los polifenoles de M. oleífera a la misma concentración logro inhibir el 94.5% del crecimiento micelial. Las CI₅₀ fueron desde 53.65 ppm M. oleífera hasta 78.09 ppm S. bicolor.

Figura 2 Porcentaje de inhibición de polifenoles obtenidos por extractos etanólicos de fuentes vegetales sobre M. phaseolina. 

Todos los polifenoles mostraron inhibición del crecimiento del hongo, con diferencias significativas respecto al tratamiento control. Los porcentajes de inhibición obtenidos en este trabajo fueron superiores a los reportados por Abreu et al. (2015) quienes en su investigación lograron obtener una inhibición de 60% utilizando extractos etanólicos de paraíso (Melia azedarach L), moringa (Moringa oleífera) y nim (Azadirachta indica A. Juss) contra Macrophomina phaseolina, mientras que en el presente trabajo se obtuvo una inhibición de 100%, utilizando polifenoles separados por cromatografía de columna.

Los alcaloides tienen un papel importante en las estrategias defensivas de las plantas frente a patógeno, como la reparación de daños por el sistema antioxidante (^{Matsuura et al., 2017}) y el establecimiento de barreras defensivas de naturaleza bioquímica (^{Zacarés, 2008}). Además, al ser en ocasiones inducidos a través de la ruta de señalización del jasmonato (^{Matsuura et al., 2017}), lo cual explicaría el efecto positivo de los tratamientos en el control de Macrophomina.

La obtención de resultados positivos de este trabajo se asocia a la técnica de obtención de los polifenoles debido a que es una técnica en la cual se muestran buenos rendimientos en cortos periodos y a bajas temperaturas mostrando un proceso de hidratación que favorece la extracción de ciertas sustancias, ya que el ultrasonido hidrata la laminilla (presente en las membranas de células vegetales) y una vez desintegrada la laminilla, las células vegetales quedan expuestas al proceso de extracción del solvente (^{Toma et al., 2001}).

Actividad antifúngica de extractos vegetales contra F. oxysporum f. sp. ciceris por el método de microdilución en placa

La actividad antifúngica de los polifenoles seleccionados de Ligustrum lucidum (hojas), Moringa oleifera (hojas) y Sorghum bicolor (granos) fueron probados contra Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Figura 3). Los resultados mostraron que los tres grupos de polifenoles utilizados inhiben el crecimiento del patógeno entre 60 y 85% a 1 000 ppm. De igual forma, los tres grupos de polifenoles a concentraciones bajas no presentaron inhibición del crecimiento del patógeno, cabe resaltar que los polifenoles de Ligustrum lucidum fueron los que mostraron el porcentaje de inhibición más alto con 83.63%, seguido y con una diferencia mínima del grupo de polifenoles de Moringa oleífera con 82.86%, mientras que Sorghum bicolor solo inhibió 68.3%.

Figura 3 Porcentaje de inhibición de polifenoles de diferentes fuentes vegetales contra Fusarium oxysporum f. sp. Ciceris. 

Los porcentajes de inhibición fúngica obtenidos en el presente estudio usando grupos de polifenoles fueron superiores a los reportados por ^{Dwivedi y Sangeeta (2015}), según sus resultados el extracto de Moringa oleífera, Tinospora cardiofolia y Cymbopogon citratus contra Fusarium oxysporum f. sp. ciceris alcanzan una inhibición de 60.29%, de igual forma los resultados reportados por ^{Chandra y Singh (2005)} con diferentes extractos de plantas con los cuales solo alcanzó 65% de inhibición de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris. El análisis de varianza mostro diferencias significativas entre la CI₅₀ de los tres grupos de polifenoles siendo aquellos obtenidos de Ligustrum lucidum los que promovieron la CI₅₀ más baja y estadísticamente el mejor de los tres extractos con 492.02 ppm (Cuadro 3).

Actividad antifúngica de polifenoles de diferentes vegetales contra F. solani por el método de microdilución en placa

Se determinó el efecto de los grupos de polifenoles sobre Fusarium solani mediante el porcentaje de inhibición. En el análisis de varianza de la concentración inhibitoria muestra diferencias significativas entre los tratamientos, siendo el extracto de Ligustrum lucidum el que mostro la CI₅₀ más baja (Cuadro 4). Los polifenoles de extractos etanólicos de Ligustrum lucidum, Moringa oleífera y Sorghum bicolor inhibieron 100% del crecimiento de Fusarium solani en la concentración de 1 000 ppm, el resto de las concentraciones siguieron mostrando inhibición siendo las más relevantes los polifenoles de Ligustrum lucidum.

Lo anterior, es relevante si se considera que hay productos químicos que se aplican una o más veces por semana y no logran estos resultados, incluso en condiciones de laboratorio no logran inhibir al 100% el crecimiento del micelio, tal como lo reportan ^{Yossen y Conles (2016}) que, en su trabajo con moléculas comerciales, alcanzan una inhibición de entre 60 y 97%. Resultados similares al nuestro sobre Fusarium spp. (Figura 4) fueron reportados por ^{Duarte et al. (2013}), quienes con aceites esenciales de Piper aduncum subsp. ossanum y Piper aurintum inhiben totalmente el crecimiento de este hongo. Por otra parte, ^{Zaker (2014}) concluyó que el extracto etanólico de hojas de Artemisia annua es capaz de inhibir el crecimiento de F. solani.

Figura 4 Porcentaje de inhibición de polifenoles de diferentes fuentes vegetales contra F. solani.