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Introducción
La cría calcárea, ascosferosis o cría de cal, es una enfermedad ocasionada por el hongo Ascosphaera apis, que al reproducirse y esporular en las larvas de abejas melíferas (Apis mellifera) provoca su momificación (momias blancas y negras), reduce el tamaño poblacional de sus colonias, y en algunas regiones puede provocar pérdidas elevadas de la producción de miel1,2.
Ante la presencia de A. apis y otros problemas sanitarios de las crías, las abejas melíferas pueden responder con mecanismos de resistencia conductuales y fisiológicos3,4. Un importante mecanismo conductual es el comportamiento higiénico (CH), que consiste en la capacidad de las obreras de detectar, desopercular y remover del interior de las celdas a la cría que se encuentra enferma o muerta5,6. La evaluación del nivel de CH de una colonia de abejas se basa en sacrificar crías dentro de celdas operculadas por punción7 o congelamiento8 y determinar el porcentaje de remoción en un periodo corto de tiempo por parte de las obreras. Se ha reportado que las colonias con muy alto CH ((95 % de remoción de la cría muerta en 24 a 48 h) muestran cierto grado de resistencia a la cría calcárea9,10 y loque americana11-13, y existen algunas evidencias de resistencia de colonias altamente higiénicas contra el ácaro parasitario Varroa destructor14 y el virus de las alas deformes15. También se ha argumentado que mecanismos fisiológicos asociados a la inmunidad celular y humoral de las abejas pudieran conferirles resistencia contra la ascosferosis4. Por lo anterior, no es claro cual es la contribución e importancia relativa del CH a la resistencia de las abejas contra la cría calcárea, particularmente en poblaciones de abejas africanizadas.
Se ha reportado que el CH brinda protección contra el hongo A. apis en colonias de abejas africanizadas cruzadas con europeas de Sudamérica10. Sin embargo, se desconoce si esto también sucede en poblaciones de abejas africanizadas en otros países. Además, la relación entre la expresión del CH y la susceptibilidad de la cría en abejas africanizadas infectadas con el hongo A. apis no ha sido estudiada. Generar dicha información sería de gran utilidad para diseñar estrategias de control contra la enfermedad, como por ejemplo, establecer programas de crianza selectiva.
En México en particular, se sabe que en ciertas regiones la prevalencia de cría calcárea puede rebasar el 50 %, sobre todo en zonas húmedas16, y que esta enfermedad puede interactuar con otras y hacer colapsar las colonias de abejas17. Además, en México no se han estudiado las relaciones del CH con la ascosferosis y la susceptibilidad de larvas de abejas africanizadas al hongo.
Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue evaluar el grado de CH de colonias de abejas africanizadas y su impacto en la resistencia y susceptibilidad de estos insectos a la cría calcárea.
Material y métodos
Lugar de estudio
Este estudio fue llevado a cabo en apiarios experimentales del Departamento de Apicultura del Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad Autónoma de Yucatán, en Xmatkuil, Mérida, Yucatán, México (20° 52' 3.00" N, 89° 37' 29.15" O). Esta región presenta un clima cálido-subhúmedo con lluvias en verano (Awo), con precipitación pluvial anual de 985 mm, temperatura anual de 26.8 ºC y humedad relativa anual de 78 %18.
Comportamiento higiénico y población de abejas
Los estudios se llevaron a cabo en 50 colonias de abejas comerciales a las que se realizó un análisis morfométrico con el propósito de confirmar que eran africanizadas19. Las colonias se encontraban alojadas en colmenas tipo Langstroth, distribuidas en cinco apiarios y tenían diferentes condiciones poblacionales y de reservas de alimento, pero sin signos clínicos de enfermedades. Las poblaciones de abejas de las colonias se determinaron tanto para el área de cría operculada como para la cantidad de abejas adultas. Para determinar el área de cría de cada colonia, dos operadores estimaron el porcentaje de la superficie de ambos lados de cada panal ocupada por cría operculada. La superficie porcentual de las áreas de cría se convirtió a cm2, considerando el área que tiene un panal tipo Langstroth en ambos lados (1,760 cm2). Además, se registró el número de panales cubiertos con abejas y se multiplicó por el número de abejas que ocupan un panal Langstroth en la cámara de cría por ambos lados (2,430 abejas)20. Las mediciones se realizaron por las tardes (> 1700 h) cuando la mayoría de las abejas se encontraban en el interior de las colmenas y en todas las mediciones participaron los mismos operadores.
El CH de las colonias se evaluó en dos ocasiones. Las dos evaluaciones se realizaron durante el mes de julio cuando no existen floraciones importantes en el área y se hicieron con un intervalo de 14 días. Para estimar el nivel de CH de cada colonia, se seleccionó un panal con cría operculada con pupas de 3 a 4 días de edad, identificadas por el cuerpo de color blanco y ojos color púrpura21, la etapa más adecuada para determinar el CH22. Se colocó un cilindro de lámina galvanizada (8 cm diámetro x 10 cm altura) sobre un área compacta de cría operculada y se vertieron 300 ml de N2 líquido para sacrificar por congelamiento a las pupas en el interior de las celdas. Al evaporarse el N2 se removió el cilindro y se fotografiaron las áreas congeladas y el panal se introdujo nuevamente en la colonia que estaba siendo evaluada. Los panales con la cría sacrificada de las colonias experimentales se inspeccionaron 48 h después del anterior procedimiento y las áreas congeladas fueron fotografiadas nuevamente para registrar el número de pupas muertas que fueron removidas, y así poder determinar el porcentaje de remoción de la cría muerta. Las evaluaciones se realizaron 48 h posteriores al congelamiento debido a que es tiempo suficiente para limitar la reproducción y propagación de un agente infeccioso, lo que es menos estricto que a las 24 h y permite identificar la expresión del CH en colonias no seleccionadas para esta característica y apareadas naturalmente. Las colonias que en las dos pruebas desopercularon y removieron el 95 % de la cría congelada o más, fueron clasificadas como altamente higiénicas (alto CH) mientras que las colonias que removieron 50 % o menos de la cría congelada fueron consideradas como de bajo CH8,12. Posteriormente, se seleccionaron 10 colonias que presentaron un alto CH y 10 colonias que presentaron un bajo CH con la finalidad de evaluar su resistencia relativa a la ascosferosis.
Efecto del comportamiento higiénico sobre la ascosferosis
Las 20 colonias con alto y bajo CH seleccionadas del experimento anterior fueron reubicadas en un apiario aislado y sus reinas fueron marcadas con tinta indeleble en el tórax para su identificación. Las poblaciones de abejas de ambos grupos de colonias fueron homogenizadas tomando como base a la colonia que contaba con menor cantidad de abejas, área de cría, reservas de miel y polen. Por ello, al inicio del experimento las 20 colonias tenían aproximadamente la misma cantidad de panales cubiertos con abejas adultas (8), cría operculada (3), cría abierta (2), miel (2) y polen (1). Adicionalmente, se corroboró que ninguna colonia seleccionada presentara signos clínicos de cría calcárea (momias presentes en los panales, piso, o piquera).
Para obtener el hongo A. apis, inicialmente se identificaron momias negras (hongo esporulado) de colonias ajenas al experimento. Este signo clínico es patognomónico de la ascosferosis por lo que existe la certeza de obtener el hongo a partir de dichas momias. Adicionalmente, se observaron al microscopio los esporocistos del hongo en muestras de momias23. Para inducir la infección de A. apis en cría de las colonias experimentales se siguió el protocolo de Flores et al24. Se maceraron tres momias por mililitro de agua destilada. Cada una de las 20 colonias experimentales se inoculó con 6 ml del macerado diluido en 120 ml de jarabe de sacarosa (1:1), que fue suministrado a cada colonia por medio de alimentadores tipo Boardman. Además, dos panales conteniendo larvas jóvenes (cría abierta) en al menos 80 % de su superficie, así como las abejas presentes en esos panales, se asperjaron con 6 ml del mismo macerado diluido en 14 ml de jarabe de sacarosa (1:1), suministrando 5 ml del inóculo por cada lado de cada panal. Las colonias se revisaron para registrar el número de momias blancas y negras presentes en las celdas de los panales en los días 3, 5, 7, 9, 12 y 17, post-exposición25.
Susceptibilidad de larvas de colonias de alto y bajo CH a la ascosferosis
Con la finalidad de evaluar si las diferencias en número de momias en los panales entre colonias con alto y bajo CH del experimento anterior se debió en alguna medida a diferencias en la susceptibilidad de sus larvas al hongo A. apis, se utilizaron larvas de cinco colonias de cada tipo seleccionadas al azar para inocularlas y permitir su desarrollo en un medio ambiente común. De cada colonia se cortó con un cuchillo, una sección de panal (7 x 7 cm) conteniendo un promedio de 264 ( 3.4 larvas de 3 a 4 días de edad. Inmediatamente después se armaron bastidores, cada uno conteniendo una sección procedente de una colonia con alto CH y otra de una colonia con bajo CH, estas secciones y cinco colonias receptoras que tenían un bajo CH, fueron inoculadas con el hongo A. apis como se describió antes. Cada panal ensamblado de esta manera se colocó en el centro de la cámara de cría de una colonia receptora con la finalidad de dar a las larvas el mismo ambiente de nido, y que la probabilidad de ser removidas por el CH de las abejas de las colonias receptoras fuera similar para ambos tipos de larvas. Hacer cohabitar larvas y abejas en el mismo nido de cría se ha usado exitosamente en el pasado para separar efectos ambientales de genotípicos en estudios de diversos comportamientos de las abejas, incluyendo el CH26-29. Se registró el número de momias de cría calcárea en las secciones de panal los días 5, 9 y 13, post-exposición del hongo.
Análisis estadísticos
Se obtuvieron medidas de tendencia central y de dispersión para los datos de las evaluaciones de CH y de las condiciones poblacionales de las 50 colonias. También se realizaron pruebas de correlación de Pearson entre los datos de la primera y segunda prueba del CH, así como entre los del CH y los de la población de abejas, las áreas de cría y el número de momias registradas en los panales. El porcentaje de CH, las áreas de cría y la población de abejas de las colonias con alto y bajo CH que se seleccionaron para las pruebas del efecto del CH sobre la cría calcárea, así como la proporción de larvas clínicamente afectadas por la ascosferosis de los dos tipos de colonias que se usaron en el experimento de susceptibilidad, se analizaron con pruebas t de Student. El número de momias de las colonias con alto y bajo CH y el efecto del tiempo en esta variable se analizaron por medio de varianza de medidas repetidas y de pruebas de comparación de medias de Newman-Keuls. Antes de los análisis, los valores porcentuales del CH y de crías momificadas (prueba de susceptibilidad) se transformaron a raíz cuadrada del arcoseno y el número de momias a logaritmo, para garantizar una distribución normal de los datos. Los análisis estadísticos se realizaron en el programa SAS30.
Resultados
Comportamiento higiénico y población de abejas
El Cuadro 1 muestra el grado de CH y las condiciones poblacionales de las 50 colonias, así como la variación para estos parámetros. Claramente, hubo un amplio rango y variabilidad para el grado de CH entre las colonias evaluadas (CV>36 %). Sin embargo, es de destacar que el 20 % de ellas tuvieron un alto CH ((95 %), el 30 % tuvieron un bajo CH ((50 %) y el 50 % registraron un nivel intermedio de CH (51-94 % de remoción de cría congelada). La población de abejas adultas también fue muy variable (CV>37 %), pero no así la cantidad de cría en las colonias (CV<18 %).
Cuadro 1 Valores medios y de dispersión del comportamiento higiénico, población estimada de abejas y áreas de cría en dos pruebas a 50 colonias de abejas melíferas
| Estadístico descriptivo | Comportamiento higiénico (%) |
Áreas de cría (cm2) |
Población de abejas adultas |
|---|---|---|---|
| Media | 66.12 | 9,574.4 | 32,683 |
| Error estándar | 0.48 | 33.8 | 245.43 |
| Coeficiente de variabilidad, % | 36.2 | 17.5 | 37.5 |
| Valor mínimo | 12.5 | 5,820 | 9,720 |
| Valor máximo | 100 | 12,320 | 53,460 |
| Rango | 87.5 | 6,500 | 43,740 |
Hubo una correlación positiva y significativa entre el nivel de CH de la primera y la segunda evaluación (r= 0.60, P= 0.0001), por lo que la prueba de congelamiento de pupas mostró repetitividad. Por otro lado, no se encontró relación del nivel de CH con el número de abejas adultas (r= - 0.03, P= 0.84) o con el área de cría operculada de las colonias (r= 0.02, P= 0.87), por lo que se presume que estos factores no influyeron significativamente en el grado de CH de las colonias.
Efecto del comportamiento higiénico sobre la ascosferosis
Las colonias con alto y bajo grado de CH que fueron seleccionadas para las pruebas de resistencia relativa a la cría calcárea, difirieron significativamente en su nivel de CH (t= 8.71, P(0.0001), pero no difirieron en cuanto a población de abejas adultas (t= 0.10, P= 0.75) o de cría (t= 2.02, P= 0.17). Los niveles medios de CH fueron 31 ± 0.81 y 97 ± 0.20 %, para las colonias con bajo y alto CH, respectivamente.
Después de ser expuestas a A. apis, la manifestación clínica de la cría calcárea (presencia de momias en los panales) se observó a los tres días post-exposición, y aunque la cantidad de cría afectada fue similar en ambos grupos de colonias hasta el día cinco post-exposición, las colonias de alto CH tuvieron significativamente menos momias blancas (F1,76= 32.1, P<0.0001) y negras (F1,76= 10.8, P<0.001) en los panales que las colonias de bajo CH. Además, el número de momias blancas y negras en los panales de ambos grupos de colonias disminuyó significativa y progresivamente entre los días 9 y 17 post-exposición (F 4,76 = 3.2, P= 0.01 y F4,76 = 2.6, P= 0.03, respectivamente), pero no hubo efecto de interacción entre el grado de CH y los días post-exposición del hongo en momias blancas (F4,76= 0.7, P= 0.61) y negras (F4,76= 0.95, P= 0.45; Figuras 1 y 2).
ab Diferentes literales indican diferencias significativas (P(0.05) basadas en un análisis de varianza de medidas repetidas y la prueba de comparación de medias de Newman-Keuls, previa transformación de los datos a logaritmo. Se muestran valores sin transformar.
Figura 1 Número (media ± EE) de momias blancas registradas en los panales de las colonias con alto (■) y bajo (▲) comportamiento higiénico (CH) después de la inoculación con el hongo A. apis
ab Diferentes literales indican diferencias significativas (P(0.05) basadas en un análisis de varianza de medidas repetidas y la prueba de comparación de medias de Newman-Keuls, previa transformación de los datos a logaritmo. Se muestran valores sin transformar.
Figura 2 Número (media ± EE) de momias negras registradas en los panales de las colonias con alto (■) y bajo (▲) comportamiento higiénico (CH) después de la inoculación con el hongo A. apis
Además de lo anterior, se encontró una correlación negativa y significativa entre el nivel de CH y el número de momias totales de las colonias inoculadas con A. apis para las pruebas de resistencia a cría calcárea (r= -0.63, P= 0.02). Este resultado indica que, a mayor CH, hubo menor número de momias en los panales de las colonias, por lo que este comportamiento parece conferir resistencia a las abejas melíferas contra la ascosferosis.
Susceptibilidad de larvas de colonias con alto y bajo CH a la ascosferosis
Con relación a la susceptibilidad de las larvas provenientes de colonias con alto y bajo CH al hongo A. apis, se encontró que la proporción de momias en los panales no fue diferente estadísticamente entre ambos grupos de larvas durante todo el periodo de evaluación (Cuadro 2). Además, no hubo correlación significativa entre el nivel de CH de las colonias donadoras de larvas y el porcentaje de momias encontrado en los panales post-exposición de las larvas con A. apis (r = 0.21, P= 0.55).
Cuadro 2 Porcentaje (media ( EE) de larvas de colonias con alto y bajo comportamiento higiénico (CH) que manifestaron clínicamente la ascosferosis post-exposición con A. apis
| Días post-exposición con A. apis |
Alto CH (n= 5) | Bajo CH (n= 5) | t | P |
|---|---|---|---|---|
| 5 | 6.54 ± 0.77 | 5.32 ± 0.33 | 3.93 | 0.21 |
| 9 | 5.32 ± 3.24 | 4.14 ± 1.60 | 1.30 | 0.80 |
| 13 | 1.34 ± 1.81 | 1.46 ± 1.01 | 1.91 | 0.54 |
Los valores t y P fueron obtenidos del análisis de datos del porcentaje de crías momificadas transformados a la raíz cuadrada del arcoseno.
Discusión
Las evaluaciones del CH y fortaleza de población de las colonias de abejas africanizadas estudiadas mostraron amplia variación como se esperaba, pero no mostraron correlación, lo que sugiere que es posible identificar colonias de abejas que varían en su CH independientemente de su fortaleza. Estos resultados coinciden con lo reportado en trabajos previos10,12,31. Además, la prueba de N2 usada para medir el CH mostró alta correlación entre repeticiones, lo que indica que es confiable como previamente se había demostrado32, y permite la categorización de colonias con diferentes grados de expresión para este comportamiento. La frecuencia (20 %) de colonias que expresaron un alto grado de CH se encuentra dentro de los rangos mostrados por colonias de abejas europeas y africanizadas (10-31.5 %) en otras regiones12,33-35. Y esta baja frecuencia pudiera ser incrementada a partir de criar reinas de colonias con alto CH, permitiendo su libre fecundación, como lo han demostrado en la práctica, Spivak y Reuter12 y Bigio et al31. Lo anterior se basa en que parte de la variabilidad del CH es de origen genético36,37, que el CH es un comportamiento altamente heredable38-41 y que éste se hereda principalmente por vía materna28.
Las colonias seleccionadas por su alto CH tuvieron significativamente menos crías con signos clínicos de la ascosferosis en los panales que las colonias seleccionadas por su bajo CH. Esto presumiblemente se debió a que removieron mayor cantidad de cría enferma de los panales que las colonias con bajo CH, y que lo hicieron progresivamente conforme pasó el tiempo de evaluación. Estos resultados coinciden con los de estudios realizados en colonias con abejas de origen europeo42,43 y con los de un estudio realizado en colonias de abejas africanizadas cruzadas con europeas10. La detección de larvas infectadas por A. apis depende de la percepción de compuestos volátiles por parte de las abejas44-46, habiendo variación en los umbrales de detección de estos compuestos en las obreras. Abejas de estirpes seleccionadas para alto CH son más sensibles y reaccionan al olor de estos compuestos con mayor frecuencia que abejas no seleccionadas para este comportamiento47. También se ha sugerido que la eficiencia del CH contra la cría calcárea depende de la detección temprana de las larvas infectadas por el hongo previo a su momificación y esporulación, lo que limita la propagación de la infección en la colonia10. El retiro oportuno de las crías enfermas reducen el riesgo de esporulación y diseminación del hongo9. Lo anterior pudiera explicar por qué en las colonias con alto CH hubo un número significativamente menor de momias blancas y negras en los panales en comparación con las colonias con bajo CH. Esta conclusión se refuerza con los resultados del análisis de correlación que mostró que, a mayor grado de CH, disminuyó significativamente el número de crías infectadas con A. apis en los panales de las colonias de abejas estudiadas.
Se ha especulado que la resistencia de las abejas a enfermedades de la cría depende de la interacción de factores de resistencia fisiológica como la respuesta inmune ante diferentes patógenos, la actividad antimicrobiana de la microbiota y alimentos larvales, así como del CH y otros mecanismos de defensa48,49. En este estudio se analizó por primera ocasión la susceptibilidad de larvas a A. apis en un ambiente de nido común y se encontró que las larvas provenientes de colonias con alto y bajo CH fueron igualmente susceptibles a la ascosferosis. Por ello, los resultados del presente estudio permiten inferir que el nivel de expresión del CH y la susceptibilidad de las larvas a A. apis no están asociados, y apoyan la hipótesis de que aunque diversos factores y mecanismos pudieran contribuir a la resistencia de las abejas contra la ascosferosis50, el CH es el más importante de ellos. Por lo anterior, se sugiere que los esfuerzos para el desarrollo de colonias resistentes a enfermedades de la cría como la ascosferosis, sean enfocados a la selección de colonias con alto CH.
La frecuencia de colonias con alto CH provenientes de programas de mejoramiento genético es superior a la encontrada en poblaciones no seleccionadas12 y se ha reportado que esta conducta se asocia a una mayor producción de miel12,34,51 y a una mayor resistencia a enfermedades9,12-15,36; esto último es coincidente con los resultados del presente estudio. Favorablemente, la selección y reproducción de reinas de colonias con alto CH parece ser suficiente para incrementar la frecuencia de colonias con elevado CH en las poblaciones de abejas31,39,41, debido a que el CH se hereda principalmente a través de la madre28, por lo que la implementación de programas de selección y reproducción de reinas cuyas colonias expresen un alto CH, contribuiría a mejorar la salud y productividad de las colonias.
Conclusiones e implicaciones
Se concluye que el grado de CH entre colonias es variable, y que la población de abejas y crías no influyen significativamente en el grado de CH de las colonias. La frecuencia de colonias con alto CH en la población de abejas africanizadas analizada permitiría seleccionar genotipos para incrementar el grado de CH de las poblaciones de abejas en programas de mejoramiento genético. Las colonias con alto CH tuvieron mayor control de la ascosferosis que las colonias con bajo CH. La susceptibilidad de las larvas a la ascosferosis y el CH no parecen ser factores asociados. Estos resultados sugieren que el principal mecanismo de protección contra A. apis en poblaciones de abejas africanizadas es el CH. Futuras investigaciones son necesarias para estudiar la inmunidad humoral y celular de las abejas contra A. apis, así como los mecanismos para su identificación y factores asociados, a fin de que sean integrados a programas de selección y mejoramiento genético con la finalidad de mejorar la sanidad y producción de poblaciones de abejas melíferas.
