La infección por Haemonchus contortus es uno de los mayores desafíos que enfrenta la producción de ovinos y caprinos en todo el mundo. Este parásito nematodo es altamente virulento y tiene un gran impacto económico debido a la pérdida de producción y la necesidad de controlar la infección¹.

La resistencia a los antihelmínticos utilizados comúnmente ha sido un problema creciente en la lucha contra H. contortus². Aunque las opciones para el manejo sostenible como las que contempla el control integrado de parásitos son una fuerte alternativa, aún se requieren más estudios que validen los métodos y coadyuven a la reducción de resistencia o la protección de las moléculas presentes en el mercado³.

La respuesta inmune del hospedador ante la presencia de H. contortus es un factor clave para contrarrestar la infección, de tal forma que permite clasificar a los individuos del rebaño en animales resistentes, resilientes o susceptibles. La resistencia se asocia a una nula carga parasitaria y bajo impacto sobre los parámetros productivos del rebaño⁴. Sin embargo, los individuos susceptibles, que en ocasiones son menor número, pero que se ven severamente afectados por el daño de las nematodosis requieren tratamientos frecuentes, induciendo a problemas por resistencia antihelmíntica. Por ello, es necesario la identificación de nuevas moléculas con potencial antiparasitario⁴.

La identificación de nuevas moléculas y compuestos que tienen actividad contra parásitos es un área en constante evolución. Se ha demostrado que algunas plantas tienen propiedades antihelmínticas, incluyendo efectos contra H. contortus⁵. Actualmente el control antiparasitario debe centrarse en estrategias sostenibles y sustentables que tengan el menor impacto posible para el ambiente, además de disminuir la presión a las cepas de nematodos en constante mutación y selección a genes asociados a la resistencia. Los esfuerzos deben orientarse a buscar compuestos que puedan causar daño al parásito, reduciendo sus poblaciones o incluso revirtiendo la sobreexpresión de genes responsables de la resistencia antihelmíntica⁶.

El género Artemisia contiene diferentes especies con actividad antihelmíntica comprobada, entre ellas A. cina que se ha utilizado en la medicina tradicional como antiparasitario junto con plantas de su misma especie, tienen grandes efectos sobre parásitos intracelulares, nematodos o incluso cestodo ⁷.

El género Artemisia biosintetiza diferentes metabolitos secundarios como: sesquiterpenos, diterpenos, esteroles, fenoxicromenos, fenilpropanos, flavonoides, cumarinas, isofenilcumarina, ácido cafeoilquínico, acetilenos y lignanos que son los responsables de la actividad antihelmíntica⁸. Dentro de las moléculas con actividad antiparasitaria reportada se encuentran artemisinina, santonina, norisoguaicina y 3'-demetoxi-6-O-dimetilisoguaiacina^9-11; otros autores como Sakipova et al¹⁰ han reportado la presencia de artemisinina y santonina¹⁰. Artemisia cina demuestra ser una planta con un alto potencial antihelmíntico sobre nematodos y cestodos de importancia veterinaria^8,12. El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad ovicida de Artemisia cina contra el parásito Haemonchus contortus y proponer las estructuras de las moléculas volátiles mayoritarias del extracto con mayor actividad antihelmíntica a través de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas.

Material vegetal: Las partes aéreas previamente secas y molidas de Artemisia cina en estado de prefloración (40 a 60 cm de altura) fueron proporcionadas por laboratorios Hunab®, México, quienes producen la planta de forma comercial en las siguientes condiciones: humedad de 24.6 %, pH 8.7 y salinidad de 1.6 %. La planta con número de voucher No. 11967 fue identificada como Artemisia cina por Dr. Alejandro Torres-Montúfar del herbario de FES Cuautitlán, Cuautitlán, Estado de México.

Obtención del extracto vegetal: Se utilizaron muestras de 1 kg aproximadamente de material vegetal para realizar la extracción en solvente por medio de maceración por 72 h a temperatura ambiente, utilizando metanol, acetato de etilo y n-hexano para obtener extractos de alta, mediana y baja polaridad respectivamente. Pasado el tiempo de maceración, se filtró usando gasa, algodón y papel filtro (Whatman® #4). El filtrado resultante fue concentrado a presión reducida a 40 °C y 100 rpm en un rotavapor DLAB RE-100 Pro®. El extracto resultante se secó al vacío y almacenado en un desecador a presión, reducida hasta su uso.

Análisis cromatográfico en capa fina (TLC): Se utilizaron cromatofolios de aluminio Merck® con las siguientes condiciones sílica gel 60 F254. La fase móvil que se utilizó para realizar la elución de los extractos fue 5:5 n-hexano:acetato de etilo. Para cada carril, se aplicaron 15 µl de una solución de 16 mg/ml de cada uno los extractos y la referencia, por tanto, la mayor intensidad de las bandas corresponde a una mayor concentración. La referencia, fue el extracto de n-hexano reportado por Higuera Piedrahita et al(21), del cual se encuentra reportada la actividad antihelmíntica de A. cina sobre huevos de Haemonchus contortus. Las placas de cromatografía fueron revisadas a dos longitudes de onda (254 y 365 nm) antes de su revelado con sulfato cérico. Se calculó el factor de retención (R_F) con la siguiente ecuación:

Inhibición de la eclosión de huevos (IEH): Los huevos de Haemonchus contortus se obtuvieron de la cepa aislada y mantenida en la FES Cuautitlán. La IEH se realizó en placas ELISA de 96-pozos, el protocolo que se utilizó fue el reportado por Coles et al¹³ en donde se utilizaron 100 huevos por pozo con cuatro repeticiones, los huevos expuestos a los tratamientos se incubaron en cámara húmeda durante 48 h previo a su lectura. La lectura de IEH se realizó utilizando una solución de yodo-lugol, que se agregó a cada pozo después de la incubación. El número de huevos sin eclosionar (muertos y larvados) y las larvas 1 fueron contabilizados para determinar el porcentaje de inhibición de la eclosión de huevos utilizando un microscopio con aumento de 10 X (Olympus, modelo CK-2, Japón®). Como control positivo se usó ivermectina (5 mg/ml) y agua como control negativo. Las fotografías se tomaron en el objetivo de 40X, utilizando una cámara CMOS HK-10 y el software ISCapture V3.6.6

Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (GC-MS): Los componentes volátiles presentes en el extracto crudo de mayor actividad en la inhibición de la eclosión de huevos de H. contortus, se analizaron por GC-MS utilizando un cromatógrafo de gases HP Agilent Technologies 6890 acoplado a un detector de masas cuadrupolo MSD 5973 (HP Agilent) y una columna capilar HP-5 MS. (longitud: 30 m; diámetro interior: 0.25 mm; espesor de película: 0.25 µM). Se ajustó un flujo constante de helio como gas portador a la columna a 1 ml/min. La temperatura de entrada se fijó en 250 °C, mientras que la temperatura del horno se mantuvo inicialmente a 40 °C durante 1 min y se aumentó a 280 °C a intervalos de 10 °C/min. El espectrómetro de masas se utilizó en modo de impacto de electrones positivos con una energía de ionización de 70 eV. La detección se realizó en modo de monitorización selectiva de iones. Las señales se identificaron y cuantificaron utilizando iones objetivo. Los compuestos se identificaron comparando sus espectros de masas con la biblioteca NIST versión 1.7a. Los porcentajes relativos se determinaron integrando las señales utilizando el software GC Chem Station, versión C.00.01. La composición se informó como un porcentaje del área total de la señal.

Análisis estadístico: se realizaron tres repeticiones por duplicado de cada extracto. Se calcularon las CL₅₀ y CL₉₀ por medio de un análisis PROBIT, utilizando el software SAS 9.0. Se obtuvo el promedio y error estándar de la media para cada extracto, se realizó una comparación múltiple de medias de Tukey al 95% de confianza por medio del programa Statgraphics.

La extracción por polaridad de los extractos de Artemisia cina permitieron obtener los siguientes porcentajes de rendimiento: el extracto de metanol (EM) presentó un porcentaje de rendimiento de 4.1 %, el de acetato de etilo (EA) 3.86 % y el extracto de n-hexano (EH) 1.09 %. Siendo el EM el que presentó el mayor rendimiento, seguido del EA y EH respectivamente.

En la comparación del perfil químico de los diferentes extractos por medio de cromatografía en capa fina (TLC), se utilizó un sistema n-hexano:acetato de etilo (5:5), el cual permitió la separación de un mayor número de bandas con respecto a otros sistemas. En ese sistema se pudo observar la diferencia del perfil químico de cada uno de los extractos, donde el EH presenta la mayor concentración de compuestos entre los factores de retención (R_F) 0.5 y 1.0, el EA entre 0.4 y 0.7 y el EM en 0.0. De acuerdo al R_F e intensidad de las bandas, los compuestos presentes en el EH son principalmente de baja polaridad, los del EA son de mediana polaridad y los del EM de mayor polaridad con respecto a los demás extractos (Figura 1). Los extractos resultantes fueron obtenidos por medio de una maceración simple usando diferente material vegetal para cada solvente evitando extracciones exhaustivas.

Figura 1 Cromatografía en capa fina de referencia (R), los extractos de n-hexano (EH), acetato de etilo (EA) y metanol (EM) y Fase móvil:n-hexano:acetato de etilo 5:5, revelador: sulfato cérico 

Una vez observada la diferencia en la composición química de los tres extractos, se evaluó la inhibición de la eclosión de huevos de H. contortus. En donde se observó una relación dosis-respuesta (Figura 2) en la IEH, lo que permitió utilizar el análisis Probit para calcular la CL₅₀ y CL₉₀ de los tres extractos.

Figura 2 Concentraciones letales CL₅₀ y CL₉₀ requeridas para inhibir la eclosión de huevos de H. contortus después de 48 h de incubación con un extracto metanólico de Artemisia cina determinado por análisis PROBIT 

El EM presentó la mayor IEH (CL₅₀ 1.26 mg/ml y CL₉₀ 2.46 mg/ml), > seguida del EA (CL₅₀ 2.42 mg/ml y CL₉₀ 3.80 mg/ml) y > el EH (CL₅₀ 3.08 mg/ml y CL₉₀ 3.84 mg/ml). Es decir, que se observó un mayor efecto de EIH a medida que aumentó la polaridad de los extractos (Cuadro 1).

Se tomaron fotografías de los huevos observados en el microscopio a 40X sometidos al EM, y se observó inhibición de la eclosión en el tratamiento con ivermectina y huevos larvados en el tratamiento con extracto metanólico (Figura 3). En la figura a se muestra un huevo morulado expuesto a agua destilada sin daño, antes de las 48 h de exposición a los tratamientos. Cabe aclarar que, a las 48 h, los huevos expuestos a agua destilada se convirtieron en larvas 1.

Figura 3 Huevos de Haemonchus contortus observados a 40X en diferentes condiciones: a) control negativo con agua; b) control positivo de ivermectina (5 mg/ml); c) extracto metanólico de Artemisia cina a 2.46 mg/ml luego de 48 h post-exposición 

El EM mostró la mayor inhibición de la eclosión de huevos a concentraciones menores con respecto a los otros extractos. Por tanto, se determinaron los compuestos volátiles mayoritarios del EM a través CG-MS, y se propusieron de acuerdo con el patrón de fragmentación la estructura de los compuestos mayoritarios, los cuales se compararon con la biblioteca NIST. Teniendo en cuenta lo anterior, se proponen alrededor de 15 compuestos volátiles diferentes, de los cuales tres son ácidos grasos y 12 terpenos (Cuadro 2).

De manera general, los compuestos volátiles del EM son principalmente terpenos y algunos ácidos grasos, siendo los sesquiterpenos los de mayor diversidad química. En la Figura 4 se pueden observar siete compuestos que de acuerdo con el porcentaje del área bajo la curva del total de compuestos (≥ 8 %), podrían considerarse como mayoritarios. De acuerdo al patrón de fragmentación de los siete compuestos volátiles mayoritarios del EM de Artemisia cina, las estructuras propuestas se muestran en el Cuadro 3.

Figura 4 Cromatograma de CG-MS de los compuestos químicos presentes en el extracto metanólico de Artemisia cina 

Cuadro 3 Compuestos volátiles mayoritarios del extracto metanólico de Artemisia cina determinados a través de CG-MS 

Compuesto	TR	Estructura propuesta
(1)	9.20
(4)	14.92
(6)	17.54
(8)	18.94
(10)	20.55
(11)	20.63
(13)	23.07

TR= tiempo de retención (min).

De acuerdo al Cuadro 2, los posibles compuestos volátiles mayoritarios son terpenos y ácidos grasos. De los terpenos, están presentes: el compuesto (1) un hemiterpeno, (4) un sesquiterpeno bicíclico y (6) tricíclico, (13) un diterpeno bicíclico. De los ácidos grasos: (8) un ácido graso saturado, (10) ácido graso instaurado y (11) instaurado y esterificado. El ácido hexadecanóico (8) es el más abundante en el EM, seguido del 2-[4-metil-6-(2,6,6-trimetilciclohex-1-enil) hexa-1,3,5-trienil][ciclohex-1-en-carboxialdehido (13).

La inhibición de la eclosión de huevos (IEH) del EM se puede atribuir a la presencia de ácidos grasos saturados e insaturados como el ácido hexadecanoico el cual es el más abundante en el EM de Artemisia cina. Pineda-Alegría et al¹⁴, evaluaron el ácido pentadecanoico CH₃(CH₂)₁₃COOH), ácido hexadecanoico CH₃(CH₂)₁₄COOH) (8) y ácido esteárico (CH₃(CH₂)₁₆COOH), y encontraron un aumento de la IEH al aumentar el número de carbonos de los ácidos grasos insaturados, siendo los más activos el palmítico y esteárico a una dosis de 20 mg/ml, donde obtuvieron el 100 % de IEH de H. contortus. Teniendo en cuenta que el EM presentó CL₁₀₀ en la IEH de 4.25 mg/ml y que uno de sus compuestos mayoritarios es el ácido hexadecanoico, se podría pensar que existe un sinergismo con los demás compuestos químicos presentes en EM. Por la naturaleza de estos ácidos grasos podrían ser los potenciales compuestos con actividad ovicida del EM.

La presencia de metabolitos secundarios en las plantas es consecuencia de la interacción de éstas con el medio que la rodea. Estas interacciones son propias de los factores bióticos y abióticos del lugar donde se encuentre la planta. Respecto al perfil fitoquímico del EM de A. cina utilizado en este estudio y a la concentración, es respuesta a las condiciones controladas del cultivo, ya que el material vegetal fue obtenido de un invernadero¹⁵.

El EM de A. cina posee un alto contenido de terpenos los cuales se han reportado a su vez con una alta actividad ovicida de nematodos gastroentéricos de rumiantes. Estos terpenos son el óxido de cariofileno (3) y espatulenol (5), los cuales hacen parte de los compuestos mayoritarios (15.4 % y 5.1 % respectivamente) del aceite esencial de Achyrocline satureioides¹⁶, los cuales tienen una EC₅₀ de 10.42 mg/ml en la IEH sobre H. contortus. En comparación con el CE₅₀ de 1.42 mg/ml en la IEH del EM de Artemisia cina, en el cual está presente (3) y (5) en 9.60 % y 5.25 %.

Teniendo en cuenta lo anterior, se plantea como hipótesis que los ácidos grasos y terpenos tienen diferente mecanismo de acción y podrían estar trabajando en conjunto, generando así una interacción farmacodinámica¹⁵, en este caso un sinergismo. El sinergismo se presenta cuando el efecto o respuesta de la mezcla es mayor que la suma de la combinación de los fármacos por separado¹⁵. Aunque no es común encontrar interacciones farmacológicas entre compuestos químicos, es deseable encontrar sinergismos entre los mismos, ya que podrían ser la base para implementar una terapia de combinación de fármacos, lo que podría reducir los efectos secundarios que normalmente se presentan en la monoterapia de medicamentos¹⁷, lo cual podría ser una excelente alternativa al uso de antihelmínticos, debido a la resistencia que se presenta actualmente. Ya que una particularidad de los metabolitos secundarios, es que son multiblanco debido a la presencia de diferentes grupos funcionales¹⁸. Este efecto sinérgico debe ser comprobado en futuros trabajos.

Aunque los terpenos y ácidos grasos son comunes para el género Artemisia, en la planta A. cina solo se ha reportado la presencia de santonina, pectolinarigenina¹⁰, 3'-demetoxi-6-O-demetilisoguaiacina, norisoiguacina¹⁹, artemisinina y derivados²⁰. Por tanto, este trabajo reporta la presencia de tres ácidos grasos y doce terpenos diferentes a la artemisinina en A. cina de los cuales no se tiene reporte. La actividad antihelmíntica de A. cina se le ha adjudicado principalmente al extracto n-hexánico^19-21, para el caso específico de la IEH se encontró que la actividad aumenta conforme la polaridad de los extractos incrementa, por lo que abre una nueva perspectiva para diseñar un fitomedicamento con efecto antihelmíntico.

Todos los extractos evaluados de Artemisia cina presentaron actividad inhibitoria de eclosión de huevos de Haemonchus contortus, siendo el extracto metanólico (EM) el que presentó mayor actividad. El EM contiene 15 compuestos volátiles diferentes, de los cuales tres son ácidos grasos y 12 terpenos. Siendo el ácido hexadecanoico y el 2-[4-metil-6-(2,6,6-trimetilciclohex-1-enil) hexa-1,3,5-trienil][ciclohex-1-en-carboxialdehido los compuestos mayoritarios, de los cuales se presume son los responsables de la actividad ovicida.