Área de estudio

El estudio se realizó en los municipios Tetela de Ocampo y Zautla, Puebla, en tres sitios (Cuadro 1). El primero tiene una superficie de 328.80 km² y el segundo de 266.70 km²; ambos se localizan dentro de la zona de climas templados, con una temperatura media anual entre 12 y 18 °C; la cobertura vegetal se compone de bosques templados, entre los que destacan el bosque de pino-encino (Pinus spp.-Quercus spp.) y de táscate o junípero (Juniperus spp.). La especie más abundante de coníferas es Pinus pseudostrobus Lindl. (^{INEGI, 2014}; ^{Pichardo-Segura et al., 2017}).

Colecta y determinación de agentes causales

Durante el establecimiento de sitios y selección de árboles se realizaron recorridos en la zona afectada para efectuar observaciones de tipo retrospectivo.

Asimismo, se tomaron muestras de follaje que se colocaron en bolsas con cierre hermético para su revisión en el Laboratorio de Sanidad Forestal del Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Conservación y Mejoramiento de Ecosistemas Forestales, INIFAP. Las acículas que presentaron lesiones se cortaron en fragmentos y se desinfectaron con alcohol etílico al 10 % por un minuto, con hipoclorito de sodio al 0.5 % durante cinco minutos y se enjuagaron con agua destilada estéril. Posteriormente, se colocaron cinco fragmentos en cajas de Petri con medio de cultivo PDA (Papa Dextrosa Agar, 39 g L^-1) y se metieron a una incubadora Barnstead Lab-Line 3478 a una temperatura entre 25 y 27 ±°C en condiciones de luz/oscuridad: 12:12 h.

Después de que se desarrollaron los hongos, se aislaron con el propósito de obtener cultivos puros y registrar su forma, textura, tiempo de crecimiento y color de sus estructuras. Se hicieron preparaciones semipermanentes, con la técnica de tinción azul-algodón-lactofenol, bajo el siguiente proceso: se depositó una gota del colorante sobre un portaobjetos, se disgregó una muestra de micelio, y después se colocó un cubreobjetos.

Las muestras que presentaron ascomicetos en fase sexual o teleomorfa, se procesaron con la técnica de cámara húmeda, la cual consistió en cortar los fragmentos de las acículas con tizones o cuerpos fructíferos, de 5 a 6 cm de longitud y se colocaron sobre un triángulo de vidrio esterilizado, dentro de una caja de Petri con una base de papel filtro humedecido con agua destilada estéril.

Las fracciones de acículas con signos de daño foliar, se incubaron durante 10 a 12 días, con la finalidad de inducir la maduración de los cuerpos fructíferos, enseguida, con un microscopio estereoscópico Carl Zeiss Axiostar Plus, se efectuó una serie de cortes transversales a los cuerpos fructíferos y se realizaron preparaciones semipermanentes teñidas con azul-algodón-lactofenol a 1 %, para ser observadas al microscopio óptico Carl Zeiss Stemi 2000-C.

La identificación se hizo a nivel género con claves taxonómicas (^{Barnett y Hunter, 1972}; ^{Minter, 1981}; ^{Nag Raj, 1993}; ^{Abarca, 2000}; ^{Bensch et al., 2012}; ^{Visagie et al., 2014}).

Asimismo, se recolectaron especímenes de insectos asociados a los pinos durante los muestreos. Los ejemplares se colocaron en frascos con alcohol al 70 % con sus respectivas etiquetas de colecta. Se determinaron de acuerdo con el grupo taxonómico y los ejemplares se compararon con las referencias especializadas (^{Castro et al., 2017}; ^{Castro et al., 2019}).

Tratamiento para la caída foliar de pino

En cada sitio se establecieron parcelas en las que se seleccionaron siete árboles con signos de daño foliar, con una distancia mínima entre ellos de 10 m. Las características que presentaron los individuos fueron altura de 4 a 7 m, diámetro de copa de 9 a 21 m y diámetro normal a la altura de pecho (1.30 m aproximadamente) de 200 a 600 cm; con signos de lesiones en las acículas (manchas cloróticas anilladas).

A cada pino se le aplicó solo uno de los siguientes tratamientos (T): 1) Propiconazol; 2) Trichoderma sp.; 3) Bicarbonato de Potasio; 4) Mejorador biológico; 5) Clorotalonil; 6) Testigo (ningún producto); 7) Propiconazol (sobre follaje) + mejorador biológico (suelo). Los niveles de agresividad de los productos utilizados, de acuerdo con la escala de toxicidad y nivel de amenaza del trabajo de ^{Ramírez et al. (2007)}, fueron de 2 a 6.

Para la aplicación, se utilizaron equipos de aspersión (para follaje o suelo) y un sistema de inyección a baja presión (para tronco). La cantidad suministrada con mochilas aspersores se preparó en función de la superficie de cobertura de copa expresada en metros cuadrados; mientras que, para el inyectado fue a razón de 5 mL por cada centímetro de diámetro a la altura de pecho. La dosis exacta y sistema de aplicación para cada árbol y sitio se indican en el Cuadro 2.

La primera aplicación y muestreo se realizó en septiembre de 2016; el segundo suministro de productos en octubre (excepto para los árboles con la solución inyectada), en noviembre la tercera aplicación y, finalmente, la segunda toma de datos, en marzo de 2017.

Análisis de variables

La evaluación de la efectividad de los tratamientos se hizo a partir del nivel de daño con base en dos variables: 1) variable cualitativa: se consideró el color de las acículas con el uso de la escala porcentual propuesta por Sociedad Europea de Investigación en Maleza (EWRS) (^{Champion, 2003}); y 2) variable cuantitativa: se determinó mediante el conteo y longitud (cm) de las manchas cloróticas presentes en las acículas por ramilla; de cada una se seleccionaron 10 fascículos al azar, se contaron y se midieron todas las manchas cloróticas presentes por acícula.

Posteriormente, se generó una base en Excel (2007) para calcular la estadística descriptiva y un promedio de cada tratamiento por la longitud del daño de las manchas cloróticas en las acículas. Finalmente, se efectuó un análisis de varianza para determinar diferencias significativas entre tratamientos (Statistic JMP 4) (^{SAS, 2000}). Además, se realizó la prueba de Dunnett para la comparación de medias múltiples y para confrontar la efectividad entre tratamientos del primero y el último muestreo.

Agentes asociados a la caída foliar

De las muestras de follaje se determinaron los micromicetos hasta género, ecepto uno, debido a que el enfoque inicial de este estudio no fue taxonómico. Los taxa fueron: Alternaria, Aspergillus sp., Cladosporium cladosporoides (Fresen.), Penicillium sp., Pestalotiopsis sp. y Lophodermium sp.; los dos últimos se consideran hongos asociados a enfermedades en árboles forestales.

Pestalotiopsis sp. se asoció al daño foliar en los tres sitios experimentales (Figura 1); a pesar de la capacidad patogénica de algunas especies, su desarrollo es limitado por el estado vegetativo de la planta; al infectarla, puede afectar y lesionar directamente la superficie foliar, por lo que es un agente causal primario. Por otra parte, las salpicaduras de agua son el principal vínculo de diseminación de sus esporas, por lo que se sugiere como medida de control reducir o limitar el riego mediante aspersores, siempre que sea posible (^{Romero et al., 2009}).

Izquierda: Mancha clorótica; Derecha: Estructura de los conidios septados y flagelados sin micelio.

Figura 1 Pestalotiopsis sp. 

Pestalotiopsis se registró en Colima en el 2009 en relación a la “enfermedad del ciprés”, en una plantación de 20 ha de Cupressus lusitanica Mill. (^{Valdez et al., 2009}). En Puebla, de acuerdo con ^{Morales et al. (2017)} se ha detectado en cultivos de fresa. ^{Cibrián et al. (2007)} indican que en México Pestalotiopsis funerea (Desm.) Steyaert afecta a gran número de hospedantes, tanto latifoliadas como coníferas.

Lophodermium sp. (Figura 2), al igual que Pestalotiopsis, se colectó en los tres sitios. De acuerdo con ^{Cibrián et al. (2007)} se asocia con factores de estrés como la contaminación. ^{Minter (2015)} cita que se distribuye de manera abundante en diversos bosques de pinos alrededor del mundo.

Cortesía: Reséndiz-Martínez.

Izquierda = Acícula de pino con cuerpos fructíferos; Derecha = Histerotecio con ascas.

Figura 2 Lophodermium sp.  

^{Rajkovic et al. (2013)} señalaron que los primeros síntomas visibles del ataque en árboles de Navidad son manchas amarillas a cafés en los meses de septiembre y octubre, lo cual coincide con las fechas de muestreo de esta investigación.

^{Pérez et al. (2016)} definieron que los requerimientos climáticos para el desarrollo de Lophodermium existen en Puebla, por lo que el patógeno tiene un gran potencial de presentarse y extenderse a nuevos rodales de coníferas en el estado. El micromiceto en su etapa de crecimiento y desarrollo mostró un nivel alto de distribución, lo que sugiere que podría volverse más resistente a los cambios y alteraciones del medio, debido a que después de 11 años aún se le encuentra y, probablemente, aumente su densidad poblacional.

Por otra parte, durante los recorridos y muestreos se registró la presencia de Ocoaxo aff. fowleri (Lallemand) en Zautla (Figura 3) que de acuerdo con ^{Castro et al. (2017)} junto con O. assimilis (Walker) y O. varians (Stål) se presenta en los estados de Oaxaca y Puebla, y posiblemente exista una relación con la declinación de los bosques de pino.

Cortesía: Arriola-Padilla.

Figura 3 Ocoaxo aff. fowleri (Lallemand) sobre acículas de pino. 

Los agentes bióticos identificados representan lo que normalmente es la relación entre los insectos y los hongos patógenos, ya que la mayoría de las enfermedades causadas por micromicetos inician cuando la planta está previamente dañada o en condiciones de estrés fisiológico (^{Lilja et al., 2010}); es decir, que en este caso el insecto puede actuar como el agente causal primario; sin embargo, en el presente estudio, no se observaron zonas con el cercópido, pero sin afectaciones en el follaje.

^{Pichardo-Segura et al. (2017)} destacaron que las variaciones de los valores de precipitación, temperatura y humedad relativa en distintas localidades de Puebla, favorecen la existencia de los agentes causales que ocasionan la caída foliar.

Evaluación de tratamientos

El análisis de la variable cualitativa (Cuadro 3) para el primer sitio sugiere que los tratamientos de Mejorador biológico, Bicarbonato de Potasio y Trichoderma sp. son efectivos, ya que los árboles tratados presentaron signos ligeros del daño, en comparación con el testigo que mostró daño medio.

En el segundo sitio, los pinos tratados con Propiconazol + Mejorador biológico, evidenció signos muy ligeros, en comparación al testigo con daños muy elevados al igual que el resto de los pinos del área, en donde se observaron daños severos de la enfermedad de una visita a otra en todos los árboles del sitio.

En el tercer sitio, los pinos tratados con Propiconazol + Mejorador biológico, Bicarbonato de Potasio, Mejorador biológico y Clorotalonil mostraron signos muy ligeros, en comparación al testigo que registró daño medio.

El análisis con la prueba de Dunnet entre tratamientos del primer sitio (Figura 4) sugierió la existencia de diferencias significativas entre las medias del último muestreo (p≤0.02). Al comparar los resultados de la primera y la última toma de datos, el tratamiento con Propiconazol (T1) y la combinación de Propiconazol + Mejorador biológico (T7) fueron los más efectivos, pues el daño entre muestreos se mantuvo estable, a diferencia del resto de los árboles que manifestaron un leve incremento de daño para el último muestreo.

En color rojo los tratamientos por abajo de la media, y en negro por arriba (Prueba de Dunnett).

LONGITUD= Longitud del daño (cm); TRAT = Tratamientos.

Arriba = Primer muestreo; Abajo = Último muestreo.

Figura 4 Afectación de las acículas en el Sitio 1 (Buenavista, Zautla-parte media). 

El segundo sitio (Figura 5) también evidenció diferencias significativas entre los pinos tratados del último muestreo (p≤0.05). A pesar del drástico incremento de daño en todos los individuos de un muestreo a otro, destaca que la afectación en los pinos tratados con la combinación de Propiconazol + Mejorador biológico (T7) en el último muestreo, fue el más bajo con respecto a los demás.

Los tratamientos en color rojo se encuentran por arriba de la media, y en negro por debajo (Prueba de Dunnett).

LONGITUD = Longitud del daño (cm); TRAT = Tratamientos.

Arriba = Primer muestreo; Abajo = Último muestreo.

Figura 5 Afectación de las acículas en el Sitio 2 (Zautla-parte alta). 

Para el tercer sitio (Figura 6), la diferencia entre los tratamientos del último muestreo refleja una diferencia poco significativa (p≥0.05). No obstante, la menor longitud de daño se presentó con la combinación de Propiconazol + Mejorador biológico (T7)

En color rojo los tratamientos por abajo de la media, y en negro por arriba (Prueba de Dunnett).

LONGITUD = Longitud del daño (cm), TRAT = Tratamientos.

Arriba = Primer muestro; Abajo = Último muestreo.

Figura 6 Afectación de las acículas en el Sitio 3 (Rancho Alegre, Tetela de Ocampo). 

En cada uno de los sitios, los pinos tratados con el T7 reflejaron menor longitud de daño a comparación del resto de los pinos y entre muestreos; por lo tanto, se consideró el tratamiento más efectivo del estudio.

En la Figura 7, se muestra el pino tratado con Propiconazol + Mejorador biológico del segundo sitio (con mayor perturbación), durante el primer y último muestreo. En la imagen de la derecha se observa que los árboles de alrededor presentan follaje con daño considerable en comparación con el tratado (T7).

Figura 7 Pino tratado con Propiconazol + Mejorador biológico del sitio 2, durante el primer muestreo (izquierda) y el último (derecha). 

El tratamiento combinado (Propiconazol + Mejorador biológico) fue el más efectivo según el análisis de las dos variables; lo cual, se explica por las propiedades de protección de cada producto. Propiconazol es un fungicida sistémico de amplio espectro que tiene un efecto protector y curativo sobre el follaje, además es adiciona nutrientes al suelo, lo que no solo propició la recuperación del árbol enfermo, sino que también lo dotó de protección (follaje-suelo) contra los agentes patógenos presentes en el sitio. Por lo tanto, al suministrar el Mejorador Biológico al suelo, probablemente, funcionó como un doble refuerzo, ya que es un producto orgánico con microorganismos benéficos que cataliza, detona y nutre tanto al suelo como al follaje, por lo que la combinación de los productos en un tratamiento resultó ser el más efectivo entre los que fueron evaluados. Asimismo, aunque en menor medida, los pinos tratados con Bicarbonato de Potasio reflejaron efectividad en dos de tres sitios, por el mismo efecto de protección que reduce la susceptibilidad en las hojas, y brinda estabilidad a todo el árbol (^{Zavaleta, 2000}).

De acuerdo con las categorías de toxicidad y de amenaza para el medio ambiente propuestas por ^{Ramírez et al. (2007)}, el nivel del Mejorador biológico es de 2; el de Propiconazol 6 y el del Bicarbonato de Potasio de 4, por lo que es indispensable considerar dicho factor para su aplicación a largo plazo.