Introducción
México pierde alrededor de 47 770 hectáreas de cobertura forestal al año debido a actividades antropogénicas, por lo que se ha buscado el desarrollo de programas de reforestación que permitan su recuperación (Gómez, 2021). Para ello, se emplea planta de calidad proveniente de un vivero forestal que garantice sanidad y características morfo-fisiológicas necesarias para su establecimiento en campo (Buamscha et al., 2012; Sáenz et al., 2014). La calidad de la planta está determinada por condiciones fisicoquímicas que sean idóneas para su producción.
Una de los taxa más utilizados en los programas de reforestación es Pinus devoniana Lindl., por su adaptabilidad y beneficios económicos. Esta especie generalmente se produce en sustrato a base de musgo de turba o peat moss, vermiculita y agrolita (55:35:10) con fertilizante de lenta liberación (30-15-10); sin embargo, se ha observado que estas mezclas favorecen el desarrollo de plagas y enfermedades (Conafor, 2001; Sáenz-Romero, 2014).
Los hongos fitopatógenos son los agentes más dañinos por su acelerada reproducción, por lo que es necesario realizar muestreos constantes para evitar enfermedades (Murace y Aprea, 2011). Fusarium circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 afecta a plántulas de pino desde la etapa de semilla, ocasiona daños en el embrión e hipocótilo, causa doblamiento del tallo, pudrición de raíz, decoloración de acículas y la muerte. Su presencia puede provocar pérdidas de 40 hasta 100 % de la planta producida (González et al., 2008; García-Díaz et al., 2017).
Existen sustratos alternativos elaborados a partir de subproductos del proceso de producción de planta en los viveros forestales, lo que reduce el costo unitario de la planta (Aguilera et al., 2016). Para el control del patógeno hay opciones como el uso del hongo antagonista del género Trichoderma Pers. 1794 (Okorski et al., 2014).
Se han realizado estudios enfocados en analizar el efecto de las mezclas de sustrato sobre la patogenicidad de F. circinatum como el de García-Díaz et al. (2017), quienes evaluaron la patogenicidad del hongo en tres mezclas de sustratos y durante la etapa de germinación de Pinus greggii Engelm. ex Parl. Por su parte, Robles et al. (2016) evaluaron en etapa de vivero el ataque de Fusarium oxysporum Schltdl. 1824 y Fusarium solani (Mart.) Sacc. 1881 en plántulas de Pinus spp. Asimismo, Moraga-Suazo et al. (2011) compararon la eficacia del control ejercido sobre F. circinatum con Trichoderma spp. y Clonostachys spp. en plántulas de Pinus radiata D. Don.
Con base en lo anterior, el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la aplicación de Trichoderma harzianum Rifai 1969 como una alternativa de manejo preventivo a Fusarium circinatum, con el método de aplicación y la utilización de dos mezclas de sustrato.
Materiales y Métodos
Área de estudio
El experimento se realizó del 9 de mayo de 2021 al 26 de enero de 2022 en el invernadero de la División de Ciencias Forestales (Dicifo) de la Universidad Autónoma Chapingo (UACh), en Texcoco, Estado de México; ubicado entre los 19˚29´34” N y los 98˚53´38” O, a 2 240 msnm. El interior del invernadero se mantuvo a temperatura de 24 °C durante el estudio.
Diseño experimental y análisis estadístico
Se estableció un experimento factorial completamente al azar (2×3×2) con cuatro repeticiones; los factores evaluados fueron: (A) mezcla de sustrato, con dos niveles (S1 y S2, descritos más adelante), (B) método de aplicación de T. harzianum, con tres niveles (aplicación al sustrato, aplicación a la semilla y sin aplicar), y (C) presencia de F. circinatum, con dos niveles (presencia o ausencia del hongo). Se evaluó su efecto combinado, por lo que se tuvieron 12 tratamientos (Cuadro 1). La unidad experimental fueron 12 plantas de P. devoniana en tubetes de 220 mL. En total, se utilizaron 48 charolas. Las variables respuesta fueron incidencia, severidad y calidad de planta.
Tratamientos | Descripción |
---|---|
T1 | S1+T. harzianum Rifai 1969 al sustrato |
T2 | S1+T. harzianum Rifai 1969 al sustrato+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 |
T3 | S2+T. harzianum Rifai 1969 al sustrato |
T4 | S2+T. harzianum Rifai 1969 al sustrato+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 |
T5 | S1+T. harzianum Rifai 1969 a la semilla |
T6 | S1+T. harzianum Rifai 1969 a la semilla+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 |
T7 | S2+T. harzianum Rifai 1969 a la semilla |
T8 | S2+T. harzianum Rifai 1969 a la semilla+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 |
T9 | S1 |
T10 | S1+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 |
T11 | S2 |
T12 | S2+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 |
S1 = Sustrato 1 (turba de musgo+agrolita+vermiculita); S2 = Sustrato 2 (aserrín de pino+corteza de pino+turba de musgo).
Se realizó un Anava a través del procedimiento Glimmix de SAS, versión 13.1 (SAS Institute Inc., 2013) y comparación múltiple de medias con la prueba de Tukey a un nivel de significancia de 0.05.
El modelo fue el siguiente:
Donde:
Y ijkl = Variable por evaluar (incidencia, severidad y calidad de planta)
µ = Media general
Semilla y sustratos
Se utilizaron dos mezclas de sustrato, S1: turba de musgo, agrolita y vermiculita, y S2: aserrín de pino de 15 días de aserrado, corteza de pino compostada y turba de musgo, 60:20:20 y se agregó fertilizante Multicote ® 18-6-12, en dosis de 7 g L-1 de sustrato (Cuadro 1). Se colocaron dos semillas de P. devoniana por tubete, previamente desinfectadas con hipoclorito de sodio (NaClO) al 10 % durante 10 minutos, seguido de 24 horas de remojo con agua esterilizada y una segunda desinfección con NaClO al 5 % por 3 min. Se realizó el riego superficial por un mes y posteriormente cada tercer día.
Inoculación con Trichoderma harzianum
Se prepararon 14 L de una solución de T. harzianum (cepa comercial PHC ® T22) a 1×10-7 UFC g-1 de peso seco. La dosis de aplicación fue de 3.4 g L-1 de agua. Los tratamientos con T. harzianum al sustrato fueron: T1, T2 (S1) y T3, T4 (S2). Los que recibieron T. harzianum con remojo de la semilla por 60 min. fueron: T5, T6 (S1) y T7, T8 (S2); mientras que aquellos sin T. harzianum correspondieron a los tratamientos: T9, T10 (S1) y T11, T12 (S2) (Cuadro 1).
Inoculación con Fusarium circinatum
Se utilizó el aislamiento SF11 de F. circinatum del vivero forestal de Amealco, Querétaro, proporcionado por el Laboratorio de Patología Forestal de la Dicifo con siete días de crecimiento a temperatura ambiente, en medio de cultivo Papa Dextrosa Agar BD Bioxon TM (PDA); se preparó una solución de 1.6×106 esporas mL-1. En plántulas de dos meses y 20 días (julio de 2021), correspondientes a los tratamientos T2, T4, T6, T8, T10 y T12 (Cuadro 1), se aplicaron 20 mL directo al sustrato de cada tubete. A las 24 h de la inoculación se inició el conteo de las plantas con presencia de síntomas.
Determinación de la incidencia y severidad
La patogenicidad de F. circinatum se evaluó mediante su capacidad para causar enfermedad con los síntomas típicos de la secadera. La incidencia se determinó mediante la mortandad de plantas afectadas con síntomas durante ocho meses. La severidad se estimó mediante la escala diagramática de Towsend y Heuberger (1943) (Figura 1) y la Fórmula 2.
Clase 0 = Planta sana o asintomática; Clase 1 = Acículas caídas o con amarillamiento distal; Clase 2 = Marchitez parcial de la planta; Clase 3 = Marchitez media en la planta; Clase 4 = Marchitez avanzada en la planta; Clase 5 = Planta muerta.
Donde:
DS = Severidad
n = Grado de infección acorde a la escala
v = Número de plantas presentes por categoría
N = Grado máximo de infección
V = Número de plantas en total
Los grados de infección acorde a la escala de Towsend y Heuberger (1943) permitieron estimar la severidad, y con los resultados se hizo un análisis de correlación de Pearson entre incidencia y severidad.
Identificación morfológica de Fusarium circinatum
Al término de la determinación de la incidencia y la severidad, se seleccionó una planta con síntomas por cada tratamiento inoculadas con F. circinatum (un total de 24 plantas) para el aislamiento y cultivo en PDA y se almacenaron a 28 °C bajo 24 h de luz (incubadora modelo INCL-11, marca Prendo ®) para obtener los reaislamientos del patógeno y demostrar los postulados de Koch.
La identificación morfológica de F. circinatum se realizó a partir de la obtención del aislamiento, esporulación y desarrollo de macroconidios, microconidios, fiálides y coloración del micelio, en tres medios de cultivo: en medio PDA, para examinar la morfología y pigmentación de la colonia, el medio de Agua Agar con hoja de clavel para la formación de macroconidios y fiálides mediante la formación de esporodoquios, y para el desarrollo de circinas se usó el medio Agar Sintético Nutritivo (García-Díaz et al., 2017). Se hicieron 10 montajes permanentes en portaobjetos con glicerina al 100 % y azul de metileno para observar y medir las estructuras del hongo en un microscopio Leica ® modelo DM 2 500. Se utilizaron las claves de Barnett y Hunter (1998) y de Leslie y Summerell (2006).
Estándares morfológicos para evaluar la calidad de planta
A los ocho meses de la siembra, se seleccionaron cinco plantas centrales de cada charola (20 plantas por tratamiento, lo que resultó en un total de 240); se extrajeron del cepellón y se sumergieron en agua para lavar y no lastimar las raíces. Posteriormente, se efectuaron las mediciones de diámetro de tallo (D) (sección en la que se diferencia de la raíz principal) con vernier digital marca Lenfech ® modelo TXD-a33, y altura de la parte aérea (A) (sección en la que se distingue de la raíz principal al ápice de la yema terminal) con una regla de acero inoxidable marca Cline ® modelo H-6 560.
Cada planta fue seccionada a nivel del cuello, y ambas secciones, follaje y raíz, se colocaron en una bolsa de papel etiquetada con los datos del tratamiento para su secado en una estufa Felisa ® modelo Fe-143 a 70 °C durante 72 h. Se evaluó el peso seco de la raíz (PSR) y el peso seco de la parte aérea (PSA). Se determinó la relación peso seco de la parte aérea sobre el peso seco de la raíz (PSA/PSR), Índice de Esbeltez (IE), altura de planta (cm) entre diámetro (mm) e Índice de Calidad de Dickson (ICD), con la Ecuación PST/(A/D)+(PSA/PSR) (Dickson et al., 1960). Las plántulas se pesaron en una balanza analítica OHAUS ® modelo Galaxy 2000.
Resultados
Determinación de la incidencia y severidad
Los síntomas por F. circinatum en las plantas iniciaron en la semana 12 después de la inoculación; se presentaron acículas cloróticas, color café rojizo y secamiento de follaje, doblamiento apical, pudrición de la raíz y muerte (Figura 2). Dichos síntomas coinciden con los dados a conocer por Flores-Pacheco (2017) y García-Díaz et al. (2017).
A = Pudrición a nivel de cuello; B = Acículas cloróticas y retorcidas, doblamiento de punta; C = Muerte descendente de la planta.
El análisis de varianza reveló que no existen diferencias entre los sustratos (S1 y S2) y su interacción con la aplicación de T. harzianum sobre la incidencia. Por el contrario, el método de aplicación de T. harzianum, la presencia de F. circinatum y sus interacciones mostraron diferencias significativas sobre las variables respuesta a un α=0.05 (Cuadro 2 muestra los Pr>F correspondientes al Anava de cada variable).
Efecto | F-valor | Pr>F |
---|---|---|
Aplicación de T. harzianum Rifai 1969 | 11.32 | 0.0002 |
Fusarium circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 | 805.31 | <0.0001 |
Mezcla×Fusarium circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 | 1.21 | 0.2793 |
Aplicación de T. harzianum Rifai 1969×Fusarium circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 | 12.23 | <0.0001 |
Debido a que existieron diferencias entre la forma de aplicación con T. harzianum y la presencia de F. circinatum sobre la incidencia de la enfermedad, fue necesario realizar una prueba de Tukey (Cuadro 3).
Número de tratamiento |
Descripción | % incidencia |
% severidad |
---|---|---|---|
T1 | S1+T. harzianum Rifai 1969 al sustrato | 5c | 4.16d |
T2 | S1+T. harzianum Rifai 1969 al sustrato+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 | 46b | 26.16c |
T3 | S2+T. harzianum Rifai 1969 al sustrato | 3c | 2d |
T4 | S2+T. harzianum Rifai 1969 al sustrato+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 | 42b | 25.16c |
T5 | S1+T. harzianum Rifai 1969 a la semilla | 4c | 2.83d |
T6 | S1+T. harzianum Rifai 1969 a la semilla+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 | 59a | 33b |
T7 | S2+T. harzianum Rifai 1969 a la semilla | 4c | 2.73d |
T8 | S2+T. harzianum Rifai 1969 a la semilla+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 | 58a | 24.83c |
T9 | S1 | 4c | 2.33d |
T10 | S1+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 | 66a | 33.99ab |
T11 | S2 | 3c | 2.33d |
T12 | S2+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 | 63a | 37.5a |
S1 = Sustrato 1 (turba de musgo, agrolita y vermiculita); S2 = Sustrato 2 (aserrín de pino, corteza de pino y turba de musgo). Letras iguales por columna indican que no hay diferencias significativas (p≥0.05) y letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo con la prueba de Tukey (p≤0.05). Valores expresados como la media de cada variable de respuesta.
El análisis de incidencia de la enfermedad indicó que los valores bajos (3 a 5 %), estuvieron en los tratamientos en ausencia de F. circinatum, y los tratamientos con mayor incidencia fueron en los que se inoculó F. circinatum; esto es, de 46 % (T2), 42 % (T4), 59 % (T6), 58 % (T8), 66 % (T10) y 63 % (T12). Lo anterior demuestra la importancia del patógeno sobre la pérdida de la producción de planta. Las plantas con aplicación de T. harzianum directamente al sustrato presentaron 13 a 16 % menos de incidencia, en comparación con la aplicación a la semilla. Donde no se aplicó T. harzianum fue 20 % menor, comportamiento similar al de S1 y S2. El método de aplicación de T. harzianum fue el que tuvo mayor efecto, debido a una menor incidencia de la enfermedad cuando se aplicó al sustrato (Cuadro 4).
Método de aplicación | % incidencia |
---|---|
Sin Trichoderma harzianum Rifai 1969 | 8.5a |
Trichoderma harzianum Rifai 1969 a la semilla | 7.8125a |
Trichoderma harzianum Rifai 1969 al sustrato | 6b |
Letras iguales por columna indican que no hay diferencias significativas (p≥0.05) y letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo con la prueba de Tukey (p≤0.05).
La estimación del grado de infección permitió realizar la prueba de correlación de Pearson con la finalidad de medir la relación entre incidencia y severidad, con la cual se obtuvo un valor de 0.98617; lo cual indica que a mayor incidencia, más severidad (Cuadro 5).
Identificación morfológica de Fusarium circinatum
Se obtuvieron colonias de color blanco con tonalidades fucsia, tornándose violeta fuerte, con pigmentación violeta (Figura 3A y 3B), escasa formación de esporodoquios de color anaranjado pálido (Figura 3C), macroconidios delgados, curvos, con 2-4 septos, con predominio de 3 (Figura 3E), de 28-44×3.3-3.9 nm-2, de 39×3.8 nm-2 en promedio y con una célula apical curvada y basal poco desarrollada; finalmente, microconidios de forma ovoide a alantoide, unicelulares, que se desarrollan sobre mono y polifiálides (Figura 3D y 3F), con hifas estériles en forma de espiral conocidas como circinas. Estas características y mediciones coinciden con las registradas para F. circinatum por Flores-Pacheco (2017), García-Díaz et al. (2019) y O’Donnell et al. (2022).
Estándares morfológicos para evaluar la calidad de planta
La evaluación de calidad de planta con las variables individuales no mostró diferencias significativas entre los tratamientos, pero, por otro lado, en el análisis del ICD, existen diferencias en los tratamientos del S2 con valores >1 con respecto al S1, que son inferiores. Sáenz et al. (2014) consideran los valores ≥0.5 como de alta calidad para especies cespitosas; las cifras en este estudio fueron superiores, por lo que se clasifican como de alta calidad. En el ICD no se observaron diferencias significativas en el método de aplicación de T. harzianum (Cuadro 6).
Núm. | Tratamiento | Alt (cm) | Diam (mm) | PSA (gr) | PSR (gr) | IR | PSA/PSR | ICD |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
T1 | S1+T. harzianum Rifai 1969 al sustrato |
16.105ab | 7.3abc | 3.875abcd | 1.09f | 2.245ab | 3.554a | 0.859e |
T2 | S1+T. harzianum Rifai 1969 al sustrato+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 |
13.47ab | 6.775c | 3.08d | 0.995f | 2.125ab | 3.054abcd | 0.843e |
T3 | S2+T. harzianum Rifai 1969 al sustrato |
15.555ab | 7.375abc | 4.43ab | 2.12a | 2.145ab | 2.096fg | 1.538ab |
T4 | S2+T. harzianum Rifai 1969 al sustrato+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 |
14.215ab | 7.79abc | 4.425ab | 1.765abcd | 2.073ab | 2.522cdefg | 1.448abc |
T5 | S1+T. harzianum Rifai 1969 a la semilla |
13.745ab | 7.92ab | 4.1abc | 1.28ef | 1.765ab | 3.20ab | 1.095cde |
T6 | S1+T. harzianum Rifai 1969 a la semilla+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 |
15.645ab | 7.24bc | 3.415cd | 1.11f | 2.245ab | 3.137abc | 0.864e |
T7 | S2+T. harzianum Rifai 1969 a la semilla |
16.585ab | 8.145ab | 4.54a | 1.9abc | 2.14ab | 2.44defg | 1.439abc |
T8 | S2+T. harzianum Rifai 1969 a la semilla+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 |
12.56b | 8.225ab | 4.07abc | 1.85abc | 1.615b | 2.231efg | 1.628a |
T9 | S1 | 16.805ab | 8.485a | 4.255abc | 1.54cde | 2.043ab | 2.849bdce | 1.223bcde |
T10 | S1+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 |
17.015a | 7.2bc | 3.525bcd | 1.38ef | 2.413a | 2.598bcdef | 1.005de |
T11 | S2 | 16.475ab | 7.445abc | 3.855abcd | 2.04ab | 2.315a | 1.897g | 1.478abc |
T12 | S2+F. circinatum Nirenberg & O´Donnell 1998 |
12.505b | 7.205bc | 3.345cd | 1.635bcde | 1.898ab | 2.074fg | 1.349abcd |
S1 = Sustrato 1 (turba de musgo+agrolita+vermiculita); S2 = Sustrato 2 (aserrín de pino+corteza de pino+turba de musgo); Alt = Altura; Diam = Diámetro; PSA = Peso seco aéreo; PSR = Peso seco radical; IR = Índice de robustez; ICD = Índice de Calidad de Dickson. Letras iguales por columna indican que no hay diferencias significativas (p≥0.05) y letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo con la prueba de Tukey (p≤0.05).
El análisis de varianza mostró que existen diferencias significativas entre S1 y S2. El sustrato 2 a base de aserrín fue significativo para el ICD, con un α=0.05. En el Cuadro 7 se muestran los Pr>F correspondientes al Anava de cada variable.
De acuerdo con la comparación múltiple de medias de Tukey, el sustrato 2 (S2) a base de aserrín tuvo diferencias significativas para el ICD como se observa en el Cuadro 8.
Discusión
Los resultados de este estudio indican que Fusarium circinatum causó síntomas de doblamiento apical, pudrición de tallo a nivel de cuello y acículas amarillentas tornándose a color rojizo y posteriormente la muerte, lo cual coincide con los resultados de Flores-Pacheco (2017) y García-Díaz et al. (2017).
Gordon et al. (2015) señalan que el uso de turba de musgo se asocia con una mayor susceptibilidad para F. circinatum, pues obtuvieron una incidencia de 97 % al inocular un aislado de pino en planta de maíz, y en esta investigación, dicho sustrato (S1) inoculado en plantas de P. devoniana registró 66 %. Por su parte, Aguilera et al. (2016) mencionan que los sustratos con aserrín y corteza de pino son usados con gran éxito en viveros del centro de México, ya que el aserrín es un subproducto abundante, económico y que permite el desarrollo de plantas con buenas características morfológicas. A esto puede sumarse que el surgimiento de la enfermedad es ligeramente menor; en este estudio se obtuvo una presencia de 63 % con el S2, respecto a 66 % con el S1, aunque estadísticamente no hubo diferencias. Sin embargo, García-Díaz et al. (2017) concluyeron que la incidencia de la enfermedad es menor en los sustratos a base de aserrín.
El análisis de varianza demostró que el factor significativo es la aplicación de T. harzianum al sustrato al presentar baja incidencia y severidad; dichos resultados coinciden con los de García-Díaz et al. (2017), en los cuales el daño provocado por F. circinatum fue menor en aquellos tratamientos en los que se aplicó T. harzianum a las plantas de Pinus greggii. Igualmente, lo estipulado concuerda con lo consignado por Moraga-Suazo et al. (2011), quienes señalan que al aplicar Trichoderma a plantas de Pinus radiata, la incidencia se reduce más de 20 %. Okorski et al. (2014) concluyen que Trichoderma se utiliza como agente de biocontrol para enfermedades forestales.
El análisis del ICD señala que existen diferencias en los tratamientos del S2 al obtener valores mayores a 1 con respecto al S1, que son inferiores. Esto se considera dentro de la clasificación de “alta calidad” de acuerdo con los parámetros establecidos para especies cespitosas, como citan Rueda et al. (2012) y Sáenz et al. (2014). Los resultados concuerdan con los de Vicente-Arbona et al. (2019), quienes al evaluar el ICD en plantas de P. greggii en diferentes mezclas de sustrato obtuvieron mejores respuestas en la mezcla con formulación similar al S2 (aserrín de pino, corteza de pino y turba de musgo) (Aguilera et al., 2016).
Conclusiones
Fusarium circinatum es patogénico en plántulas de Pinus devoniana, se pudo observar que el método de aplicación con Trichoderma harzianum al sustrato disminuye la incidencia y severidad de la enfermedad para utilizarse de manera preventiva. Se observa que la calidad de planta basada en el Índice de Calidad de Dickson para especies cespitosas tiene valores más altos en aquellos individuos que se desarrollan en el sustrato a base de aserrín y la aplicación de Trichoderma harzianum al sustrato.