Introducción

El kéfir es un producto de leche fermentada que tiene un ligero sabor ácido, carbonatación natural y aroma. El kéfir está constituido por una microbiota que reside de manera simbiótica en una matriz de polisacáridos y proteínas (^{Kesmen y Kacmaz 2011}, Guzel-Zeydim et al. 2015). Existen evidencias de que el kéfir posee beneficios para la salud humana como incrementar la proliferación de linfocitos, la producción de inmunoglobulinas, la capacidad de digestión de la lactosa, reducir la hipertensión y el colesterol y también puede aumentar la absorción de calcio intestinal (^{Prado et al. 2015}, ^{Bourrie et al. 2016}). También el kéfir posee actividad antimutagénica en diversos sistemas de células microbianas y de mamíferos e inhibe diferentes patógenos intestinales (Guzel-Zeydim et al. 2015, Bengoa et al. 2018). En este sentido, se sabe que el kéfir produce una diversidad de metabolitos como el ácido láctico y acético como productos principales, CO₂, etanol, acetato, acetona, además de antioxidantes y compuestos antiproliferativos. Al respecto, se ha observado que los beneficios en la salud están asociados con la diversidad microbiana y con los metabolitos que el consorcio produce (^{Chen et al. 2008}).

Por otro lado, los plásticos sintéticos son utilizados en una amplia gama de sectores como el hogar, en la industria agrícola, marina y arquitectónica entre otras. Los polímeros de mayor importancia económica producidos son el poliuretano, polietileno, poliamidas, polietileno-tereftalato, poliestireno, polivinilcloruro y polipropileno (^{Shah et al. 2008}). En muchas ocasiones estos plásticos han reemplazado el uso de vidrio y papel como materiales de empaque, debido a que se desarrollaron como materiales ligeros y duraderos (^{Bergmann et al. 2019}). Pero el uso desmedido, alta toxicidad, durabilidad y la falta de reúso y reciclado, han originado un serio problema ambiental alrededor del mundo. Actualmente la producción de plásticos sintéticos oscila entre 350 y 400 millones de toneladas por año (^{Geyer et al. 2017}) y se estima que pueden llegar a acumularse millones de toneladas tanto a nivel terrestre como marino. Por esta razón, diversos estudios se han dirigido a la búsqueda de soluciones para eliminar o reducir el problema ambiental ocasionado por la acumulación de plásticos. Una alternativa es el tratamiento con luz UV y rompimiento mecánico, cuya acción genera partículas pequeñas, que al ser tratadas mediante un proceso de fotodegradación se modifican las propiedades químicas, físicas y mecánicas de los plásticos (^{Danso et al. 2019}).

El tratamiento enzimático y/o microbiano para la degradación de plásticos representa una alternativa amigable con el medio ambiente. Se han identificado varias enzimas que degradan los polímeros plásticos como las hidrolasas de éster carboxílico (EC 3.1.1), la carboxilesterasa (EC 3.1.1.1), la triacilglicerol lipasa (EC 3.1.1.3) y las cutinasas (EC 3.1.1.74). Las enzimas más prometedoras son las polietilenotereftalato hidrolasas (PET hidrolasas), que pertenecen al grupo de las cutinasas (^{Carr et al. 2020}). Actualmente, se han descrito un número reducido de bacterias y hongos con capacidad de degradar parcialmente al PET en oligómeros y monómeros, lo cual ha sido asociado a la presencia de las enzimas PET hidrolasas. La mayoría de los aislamientos bacterianos con potencial de degradación de PET son miembros de las actinobacterias (^{Almedia et al. 2019}).

Estudios previos de dos kéfires provenientes de Campeche y Escárcega, mostraron que ambos consorcios presentan diferencias en la composición microbiana del gránulo, siendo la principal diferencia entre las especies pertenecientes a los géneros Actinobacterias, Lactobacillus, y Saccharomyces (^{Tenorio-Salgado et al. 2021}). Además, mediante análisis bioinformático se observó que ambos consorcios producen diversos compuestos con actividad antimicrobiana y una amplia variedad de enzimas hidrolíticas que han sido relacionadas con la degradación de plásticos. Lo anterior abre una ventana de oportunidades para la búsqueda de secuencias homólogas a PET hidrolasas, así como el aislamiento de microorganismos degradadores de plásticos PET. Cabe mencionar que actualmente los estudios metagenómicos del kéfir están enfocados a la identificación de la microbiota que conforma al gránulo. Existen pocos estudios sobre el metabolismo de los organismos presentes en el kéfir y su aplicación biotecnológica y aún no se han encontrado reportes de la búsqueda de PET hidrolasas. Ambos consorcios están depositados en las bases de datos de la NCBI bajo el proyecto PRJNA704313. Por tal motivo, el objetivo de este trabajo es estudiar a los consorcios de kéfir como fuente de enzimas hidrolíticas y microorganismos con potencial de ser utilizados en la degradación de plásticos tipo PET.

Materiales y métodos

Resultados

El análisis de los metagenomas de los consorcios de kéfires de Escárcega y Campeche permitió la identificación de dos secuencias homólogas a las hidrolasas DLH-1 y DLH-2. La secuencia de la DLH-1 contiene un marco de lectura abierto de 831 pb que corresponde a 276 aminoácidos, con una masa predicha de 29.13 kDa y pI de 5.45. Por otro lado, la DLH-2 tiene un marco de lectura de 687 pb que corresponde a un péptido de 228 aminoácidos, con una masa molecular predicha de 24.38 kDa y pI 5.88. Las secuencias de aminoácidos deducidos de la DLH-1 y DLH-2 mostraron un 57% de posiciones similares y un 15% de identidad entre ellas (Figura 1).

Figura 1 Comparación de las secuencias de aminoácidos deducidos a partir de DLH-1 y DLH-2 obtenidas de kéfir de leche de Escárcega y Campeche. Las marcas señalan posiciones similares e idénticas. 

La comparación de las secuencias de aminoácidos deducidos de la DLH-1 y DLH-2 con las secuencias depositadas en el GenBank y UniProt utilizando el programa BLAST, mostró un 82 y 64% de identidad respectivamente con la enzima dienolactona hidrolasa (DLH; EC: 3.1.1.45), que se ha relacionado con la degradación de compuestos aromáticos tales como clorociclohexano, clorobenceno, fluorobenzoato y tolueno.

En particular, la DLH-1 presentó 154 aminoácidos conservados con el motivo DLH del género Gordonia sp., una bacteria grampositiva de la clase Actinobacteria (Figura 2A), mientras que en la DLH-2 se observó un dominio de 193 aminoácidos presente en diferentes especies, principalmente en las bacterias grampositivas del género Micromonospora sp. (Figura 2B). Cabe mencionar que estos géneros fueron detectados en el metagenoma de los dos kéfires. El análisis de las porciones centrales del dominio de la DLH-1 y DLH-2, incluyen los aminoácidos 29 - 153 y 30 - 223, respectivamente (Figura 3). De igual forma, en ambas secuencias se observó un dominio compartido con la superfamilia alfa/beta hidrolasas (8 - 267 y 11 - 223 para la DLH-1 y DLH-2, respectivamente) el cual puede actuar como un catalizador bioquímico. Este tipo de motivo es común a varias enzimas que catalizan la hidrólisis de una variedad de polímeros plásticos.

Figura 2 Comparación de las secuencias de aminoácidos deducidos de la DLH-1 y DHL-2 con secuencias reportadas para las hidrolasas de dieno-lactona (DLH) en diferentes especies. A: DHL-1 El recuadro amarillo indica la secuencia consenso del motivo DLH. Accesión UniProt: M3UWJ3; A0A3G8JII0; A0A6L7GT85; H6MV81; K6W3W2. B: DHL-2 El recuadro amarillo indica la secuencia consenso del motivo DLH. Accesión UniProt: A0A4Q7ZXM9; A0A1C5J1V7; A0A0M2RXQ6; A0A6V8L2N5; A0A543J1J3. 

Figura 3 Comparación de los motivos asociados a la secuencia de aminoácidos deducidos DLH-1 y DLH-2 de kéfir de leche. La barra gris representa los aminoácidos de cada secuencia completa. Las barras de colores indican los motivos identificados, posiciones y accesión UniProt. 

El análisis filogenético (Figura 4) mostró una relación de cada una de las DLH con diferentes grupos de especies bacterianas. La agrupación de dichas secuencias en dos clados, sugiere que la DLH-1 se encuentra más cercana al género Gordonia y la DLH-2 a los géneros Phytohabitans y Micromonospora y también sugiere que se encuentran entre las familias estructurales más grandes de proteínas (alfa/beta-hidrolasas) conocidas en la naturaleza, aunque varían en su secuencia y posible función. Se sabe que estas enzimas utilizan un mecanismo catalítico de nucleófilo ácido-base similar para catalizar reacciones en diferentes sustratos.

Figura 4 Árbol filogenético obtenido mediante la aplicación del método neighbor-joining (método del vecino más próximo) utilizando la secuencia de nucleótidos codificantes de la DLH-1 y DLH-2, y proteínas relacionadas. Accesión UniProt: A0A4Q7ZXM9; A0A1C5J1V7; A0A0M2RXQ6; A0A6V8L2N5; A0A543J1J3; M3UWJ3; A0A3G8JII0; A0A6L7GT85; H6MV81; K6W3W2. 

A partir los gránulos de kéfir de Escárcega y Campeche se obtuvieron 50 aislados bacterianos, los cuales fueron inoculados en placas con medio mínimo y PCL como única fuente de carbono. Se seleccionaron 6 colonias que formaron un halo translúcido en el medio de cultivo y fueron nombradas JS1 a JS6 (Figura 5). Las bacterias mostraron algunas diferencias morfológicas y bioquímicas como la forma de la colonia, la movilidad, la velocidad de crecimiento y su capacidad para hidrolizar PLC (Tabla 1).

Figura 5 Imagen representativa de la colonias aisladas del kéfir con actividad para degradar PCL al 15%. A: colonia JS 4; B: colonia JS6. Las placas fueron incubadas a 37 °C por 7 días, las flechas indican el halo de hidrólisis. 

Discusión

Los polímeros termoplásticos son materiales ampliamente utilizados debido a sus propiedades fisicoquímicas (^{Andrady y Neal 2009}). De estos polímeros, los derivados del petróleo como polietileno (PE), poliuretano (PU), poliestireno (PS), polipropileno (PP), policloruro de vinilo (PVC), polietilen tereftalato (PET) se han usado extensivamente en la industria y en aplicaciones domésticas. Es importante señalar que estos polímeros son extremadamente difíciles de biodegradar (^{Mohanan et al. 2020}). Los procesos de reciclado químico de PET incluyen la metanólisis, glicólisis, hidrólisis, amonólisis, y aminólisis (^{Al-Sabag et al. 2016}). También se han aislado microorganismos con la capacidad de degradar este tipo de materiales en condiciones in vitro, siendo una alternativa para la hidrólisis del PET mediante las reacciones biológicas mediadas por enzimas bajo condiciones controladas. Las enzimas involucradas en este proceso son las cutinasas, lipasas, esterasas y carboxilesterasas aisladas, principalmente, de hongos y bacterias (^{Koshty et al. 2018}, ^{Wei et al. 2014}).

Anteriormente se pensó que la degradación de PET estaba limitada a unos pocos grupos bacterianos, sin embargo, la mayoría de los aislados bacterianos con potencial de degradación de PET, son miembros del phylum Actinobacteria; siendo Thermobifida y Thermomonospora los géneros mejor caracterizados para este proceso (^{Gamerith et al. 2017}). Después se aisló la bacteria gram negativa Ideonella sakaiensis cepa 201-F6 que puede utilizar el PET como fuente de energía y carbono. Esta bacteria actúa mediante la enzima PET hidrolasa produciendo monómeros no tóxicos como el ácido tereftálico y el etilenglicol. Las enzimas tipo PET hidrolasa contienen un dominio denominado dienolactona hidrolasa (DLH), que es un dominio genérico 102 α/β hidrolasa, presente en algunas hidrolasas (Danso et al. 2018).

En el presente trabajo se identificaron secuencias con el dominio DHL y se ha demostrado que estas secuencias son homólogas a genes que codifican enzimas involucradas en la degradación de PET (^{Intikhab et al. 2020}). Además, los análisis filogenéticos demostraron que las secuencias detectadas en los metagenomas de kéfires están agrupadas en los clados con los géneros de Gordonia y Micromonosporas que fueron detectados previamente en los metagenomas de los kéfires de Escárcega y Campeche (^{Salgado-Tenorio et al. 2021}). Asimismo, se ha demostrado que tanto el género Gordonia como Micromonospora pueden asimilar y consumir hidrocarburos alifáticos (^{Silva et al. 2019}).

Por otro lado, el kéfir es un producto lácteo con características probióticas, está conformado por una microbiota embebida en una matriz de polisacárido y proteínas. En el gránulo conviven en actividad simbiótica bacterias ácido-lácticas, bacterias ácido-acéticas y levaduras, empleando como cementante al kefiran. Este polisacárido extracelular secretado por la microbiota del kéfir contiene muchos grupos hidroxilo y es soluble en agua (^{Bengoa et al. 2019}). Debido a la estructura conformacional del kéfir es necesaria la secreción de enzimas hidrolíticas por parte de los consorcios para la degradación de las matrices de polisacáridos. El kéfir ha sido fuente para el aislamiento de microorganismos para diversas aplicaciones, en especial, el aislamiento de bacterias ácido-lácticas (^{Zanirati et al. 2015}, ^{Hurtado et al. 2021}), sin embargo, aún no ha sido utilizado para el aislamiento de microorganismos degradadores de polímeros. La degradación de plásticos PET ha sido reportada en microorganismos de los géneros Pseudomonas, Bacillus, Aspergillus, Idonella, Acanthopleurobacter, Phanerochacte, Thermonospora, Thermobifida entre otros (^{Mohanan et al. 2020}) y algunos de estos géneros fueron detectados en los metagenomas de los kéfires empleados en este trabajo (^{Tenorio-Salgado et al. 2021}).

Para el aislamiento de microorganismos a partir del kéfir, se empleó la policaprolactona (PCL) que es un plástico biosintético biodegradable sintetizado a partir de ε-caprolactona (^{Oda et al. 2006}). Debido a que la PCL contiene enlaces tipo éster similares a los encontrados en el PET, se utilizó como indicador en la búsqueda de microorganismos degradadores de PCL. Por otra parte, los microorganismos capaces de degradar PCL también pueden tener la capacidad de degradar PET como ha sido demostrado en Streptomyces sp. SM14 (^{Almeida et al. 2019}). De las 50 cepas aisladas solo 6 lograron degradar la PCL y fueron nombradas JS1-JS6. La variación en la eficiencia de las cepas para degradar el polímero, aunado a las diferencias en sus características morfológicas y bioquímicas sugieren que las cepas son diferentes, sin embargo, será necesario realizar análisis moleculares para la identificación de los microorganismos aislados.

Se ha reportado que la degradación del PCL puede ocurrir por vía enzimática, mediante la acción de enzimas lipasas, cutinasas y carboxilesterasas (^{Bartnikowski et al. 2019}). Estas enzimas se caracterizan por tener un dominio de α/β hidrolasa y una tríada catalítica que consiste en un residuo de aspartato (Asp) o glutamato (Glu), una histidina (His) y un residuo nucleofílico de serina (Ser) (De ^{Simone et al. 2001}). Por otra parte, se ha demostrado que la digestión mediada por enzimas PET hidrolasas convierten al PET en mono(2-hidroxietil) ácido tereftálico (MHET), con mínimas cantidades de ácido tereftálico (TPA) y bis(2-hidroxietil)-TPA como productos secundarios. Otra enzima, la MHETase (MHET-enzima digestora), hidroliza al MHET produciendo dos monómeros el TPA y EG (etilenglicol) (^{Yoshida et al. 2016}) y posteriormente durante el metabolismo del EG y derivados, se producen el glioxal, glicolato y glioxilato, los cuales tienen diversas aplicaciones. Lo anterior resalta la importancia de los microorganismos provenientes del kéfir que producen enzimas involucradas en la degradación de plásticos y que contribuirían no sólo a la reducción del problema ambiental, sino también representan una fuente de compuestos de interés biotecnológico.

Conclusiones

El análisis bioinformáticos de los metagenomas de kéfires, permitieron identificar dos secuencias homólogas a hidrolasas que han demostrado estar involucradas en la degradación de compuestos aromáticos como el PET. Estas secuencias denominadas DLH-1 y DLH-2 presentan homología del 82 y 65% con la enzima PET dienolactona hidrolasa, respectivamente. También se aislaron 6 bacterias denominadas JS1-JS6 que hidrolizaron el PCL in vitro, por lo que este trabajo es el primero en demostrar que los kéfires de Escárcega y Campeche pueden ser una fuente microorganismos productores de enzimas relacionadas con la degradación de plásticos como los tipo PET. Adicionalmente a los beneficios atribuidos al kéfir, los consorcios del kéfir muestran un gran potencial biotecnológico, lo que abre una ventana para explorar kéfires de diferentes puntos del país.