Introducción

México es uno de los productores de leche más importantes en el mundo. La producción de leche bovina en 2022 fue de 13 mil 105 millones de litros a nivel nacional, que lo ubican como el décimo quinto lugar entre los países con mayor producción de leche bovina; mientras que en el estado de Puebla la producción de leche fue de 456 mil 601 litros (^{SIAP 2023}). De los cuales el 23% fue utilizada por la industria quesera, pero este porcentaje corresponde a la industria formal, ya que es difícil cuantificar la participación de los negocios que fabrican queso de forma artesanal (^{González-Córdova et al. 2016}, ^{Mazorra-Manzano y Moreno-Hernández 2019}).

En México, el tipo de queso de fabricación tradicional que más se consume es el fresco, cuya demanda representa alrededor del 80% (^{González-Córdova et al. 2016}). Otras variedades de igual importancia, por el alto consumo entre la población, son el queso Panela y el queso Oaxaca también llamado Quesillo, y en menor escala el requesón (^{Torres-Llanez et al. 2006}, ^{Caro et al. 2020}). La mayoría de estos quesos artesanales son elaborados con leche cruda de vaca, aunque en el caso de queso panela también se utiliza leche de oveja, cabra o una mezcla de las tres (^{González-Córdova et al. 2016}). El uso de leche sin pasteurizar para la fabricación de estos tipos de queso hace que el lactosuero generado durante el proceso tenga una variedad de bacterias ácido lácticas no iniciadoras (BAL-Ns) llamadas así porque no fueron adicionadas deliberadamente, es decir, son de origen autóctono que cuando forman parte del queso otorgan sabores, texturas y olores característicos al producto (^{Bettera et al. 2023}, ^{Buchanan et al. 2023}). La importancia de este tipo de queserías se debe a que aproximadamente el 70% de los quesos mexicanos son producidos de forma artesanal por industrias micro, pequeñas o medianas, ubicadas en rancherías y pequeños pueblos con métodos rústicos, generalmente carentes de un control de calidad estricto y que muchas veces presentan incumplimiento de la Norma Oficial Mexicana NOM-121-SSA1-1994 que recomienda el uso de leche pasteurizada para la fabricación de queso (^{Torres-Llanez et al. 2006}, ^{González-Córdoba et al. 2016}, ^{Metz et al. 2020}) y la NOM-243-SSA1-2010 que indica las especificaciones sanitarias que deben cumplir los derivados lácteos en su elaboración (^{Rivera-de-la-Cruz et al. 2017}, ^{Rangel-Ortega et al. 2023}). El principal subproducto generado durante la fabricación de quesos es el lactosuero, que en la mayoría de los casos se vierte como efluente, considerando que el 90% de la leche que se usa para fabricar queso se convierte en lactosuero, su producción se torna relevante (^{Asas et al. 2021}). El lactosuero es un líquido translúcido, verdoso, obtenido por separación del coágulo de leche, después de la precipitación de las proteínas, principalmente caseína, durante la elaboración de queso, contiene proteína sérica, lactosa, minerales y grasa, es decir, aproximadamente el 55% de los sólidos de la leche y dependiendo del método usado para la precipitación de la caseína se clasifican en suero dulce y suero ácido (^{Rocha-Mendoza et al. 2020}). El suero dulce es generado cuando se utilizan enzimas (cuajo, quimosina o renina) para la separación del coágulo de la leche durante la elaboración tradicional de queso fresco, panela, de pasta cocida o prensada (vaca) y quesos de ovejas; se caracteriza por ser pobre en ácido láctico, en calcio, fósforo y con pH mayor a 6.0. El suero ácido es resultado de la separación de la caseína por la adición de ácidos orgánicos (ácido cítrico, acético o láctico), la fermentación de la lactosa con bacterias ácido lácticas (BAL) autóctonas de la leche utilizada o con cultivos iniciadores (Rocha-Mendoza et al. 2020). El lactosuero genera un serio problema ambiental por su alta carga orgánica, su demanda bioquímica de oxígeno (DBO) de 35 000 mg L^-1 y la demanda química de oxígeno (DQO) de 68 000 mg L^-1 por cada 100 L de suero, representa un nivel de contaminación equivalente a las aguas residuales producidas por 45 personas al día (^{Asas et al. 2021}). Pero no es el único problema, también puede ser fuente de bacterias como Enterococcus faecium y Enterococcus faecalis, que a pesar de su baja virulencia, son responsables de infecciones nosocomiales, involucradas en una gran variedad de cuadros clínicos relacionados con infecciones del tracto urinario, abdominal, pélvico y pueden presentar resistencia a antibióticos como la vancomicina (^{Terzić-Vidojević et al. 2021}, ^{Davis et al. 2022}). Las bacterias pertenecientes al género Enterococcus son parte de la microbiota secundaria de quesos de elaboración tradicional debido a su ubicuidad y capacidad para crecer en ambientes ácidos y salinos; además, los componentes de alto valor nutricional del lactosuero lo hacen un medio apropiado para el desarrollo de Enterococcus (^{Rabaioli et al. 2019}, ^{Song et al. 2022}, ^{Dosuky et al. 2022}, ^{Marasco et al. 2022}, ^{Bettera et al. 2023}). Según ^{Li C et al. (2020)} se estima que la producción anual del lactosuero en todo el mundo es de 1.15 × 10⁸ a 1.40 × 10⁸ toneladas, con un aumento cada año del 1 al 2%, por lo que se han propuesto varias alternativas para el aprovechamiento de tan grandes cantidades de este residuo lácteo (^{Asas et al. 2021}, ^{Park et al. 2021}), una de ellas es el consumo humano, como fuente de proteína y lactosa, sin embargo, es de interés monitorear la presencia de microorganismos potencialmente dañinos para evitar enfermedades en la población que consuma tales productos (^{Asunis et al. 2020}, ^{Decadt et al. 2023}). Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue determinar la presencia de especies de Enterococcus de relevancia ambiental y clínica a partir de muestras de lactosueros de quesos de producción artesanal de las localidades de Chipilo, Cholula, Nealtican, y Santa Ana Xalmimilulco en el estado de Puebla.

Materiales y métodos

Resultados y discusión

A partir de 36 muestras de lactosuero se purificaron 89 cepas de cocos Gram positivas, catalasa negativas, fermentadores de lactosa, todas con características generales de BAL, de estas cepas solamente 33 demostraron capacidad de soportar temperaturas de incubación de 45 °C, crecimiento en medios con azida de sodio como el agar KF, crecimiento a pH 9.6 y halotolerancia moderada (NaCl al 4%), el resto de las cepas se descartaron por no cumplir con los criterios fenotípicos de la población objetivo. Estos criterios han sido utilizados por varios autores para la identificación preliminar de Enterococcus en quesos de leche bronca (^{Murugesan et al. 2018}, ^{Margalho et al. 2020}, ^{Terzić-Vidojević et al. 2021}), en leche de camella (^{Hawaz et al. 2016}) lactosuero (^{De-Sousa et al. 2020}), muestras de agua (^{Davis et al. 2022}) y ambientales (^{Domig et al. 2003}). La Tabla 1 contiene los resultados de las pruebas fenotípicas realizadas a los 33 aislados presuntivos, todas las cepas resultaron negativas a motilidad y hemólisis, lo que indica que son bacterias no filamentosas y no secretan hemolisinas, por esta razón no causan la lisis de glóbulos rojos denotando inocuidad en las cepas aisladas. Según ^{Georges et al. (2022)} la secreción de hemolisinas en microorganismos de este género ha sido relacionada con alta toxicidad en infecciones humanas. Todos los aislados tornaron el medio ácido al degradar ribosa, fructosa y glucosa, pero ninguna de las cepas produjo CO₂ al metabolizar la glucosa, lo cual coincide con lo publicado por ^{Domig et al. (2003)} quienes indican que el metabolismo de este grupo de bacterias es homofermentativo y utilizan la vía de Embden-Meyerhof-Parnas para producir ácido láctico sin descarboxilación a partir de glucosa. Los resultados obtenidos en el perfil de fermentación de carbohidratos coinciden con ^{Dosuky et al. (2022)} quienes identificaron E. faecalis, E. faecium y E. hirae en lactosuero de queso salado. La determinación de la especie se realizó según el criterio del manual de Bacteriología Sistemática de Bergey (^{Ludwig et al. 2009}) y de acuerdo con los resultados se agruparon en 3 especies. Las bacterias positivas a hidrólisis de citrato y a la reducción de TTC se clasificaron como E. faecalis. Debido a que la capacidad de hidrolizar citrato indica la presencia de la enzima citrasa y está altamente valorada en la producción de quesos madurados debido a que mejora el olor y sabor (^{Terzić-Vidojević et al. 2021}). El resultado negativo a la producción de ácido a partir de sacarosa y manitol es propio de E. durans, sin embargo, la fermentación de maltosa para ésta misma especie tuvo resultados que no concordaron con la referencia.

Las bacterias incapaces de reducir el TTC en agar KF, y con capacidad de producir ácido por la fermentación de sacarosa y manitol se clasificaron como E. faecium (Tabla 1). El desarrollo de Enterococcus a temperaturas de 10 °C es típico de este grupo, aunque varias cepas de E. faecalis y E. Durans aisladas en este trabajo no presentaron esa característica. Al respecto, ^{Hawaz et al. (2016)} también reportaron cepas de E. faecalis y E. casseliflavus en leche de camella sensibles a temperaturas frías, incapaces de crecer a 10 °C. Las especies identificadas aquí, coinciden con las reportadas por ^{Quillama et al. (2020)}, quienes caracterizaron cepas de Enterococcus únicamente por métodos fenotípicos a partir de quesos artesanales de Perú, encontrando principalmente E. faecium (38 cepas), E. durans (dos cepas), y E. faecalis (una cepa), pero no lograron discernir la especie de 27 cepas de Enterococcus aisladas; por ello es importante la caracterización molecular. En el presente trabajo, los resultados de algunas pruebas fenotípicas generaron ambigüedad, como la reducción de TTC y la producción de ácido con manitol, por lo que no fueron útiles para asignar la especie por lo que se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para confirmar la identidad de las cepas. En la Tabla 2 se muestran los iniciadores utilizados en la PCR de punto final para determinar el género (16S rRNA) y la especie (Ecium, VanC1, E1 y E2, DuHi y Du). Los resultados de la PCR 16SrRNA confirmaron el género Enterococcus para los 33 microorganismos aislados. Los oligonucleótidos 16S rRNA fueron diseñados y utilizados por ^{Yean et al. (2007)} para identificar al género Enterococcus en muestras clínicas con una especificidad del 100%.

Diversos autores han resuelto la especie secuenciando una fracción del gen ARNr 16S (^{Olvera-García et al. 2017}, ^{Dosuky et al. 2022}, ^{Marasco et al. 2022}), sin embargo, para algunas especies de este género no es suficiente esta comparación debido a que la identidad podría ser mayor o igual a 99.8% entre ellas para esta región de ADN (^{Ludwig et al. 2009}). Por ello, también se utilizó PCR específica de especie y se amplificaron los genes que codifican ligasas D-alanina:D-alanina (ddl) para E. faecium, E. faecalis y E. durans, además la secuencia VanC1 específica para E. gallinarum debido a que han sido útiles para la especiación de Enterococcus en muestras clínicas (^{Dutka-Malen et al. 1995}, ^{Knijff et al. 2001}, ^{Yean et al. 2007}, ^{Alves et al. 2009}) y alimentarias como la leche pasteurizada (^{Nasiri et al. 2022}). Mediante el ensayo de PCR específica se caracterizó a 19 cepas como E. faecium (Figura 1A, 1B y 1C), 6 como E. faecalis (Figura 1E, 1F) y 4 como E. durans (Figura 1D). Estos resultados coinciden con los trabajos de varios autores que han caracterizado la microbiota de quesos fabricados con leche cruda de vaca encontrando a E. faecium como especie dominante, seguida de E. faecalis y E. durans en productos lácteos (^{Torres-Llañez et al. 2006}, ^{Quillama et al. 2020}), por ello se estima que la misma población microbiana estaría presente en el lactosuero de quesos elaborados con leche sin pasteurizar.

Figura 1 PCR específica para determinar la especie de Enterococcus. M: marcador de peso molecular 100 pb. (Promega) A), B y C) Amplificación del gen ddl de E. faecium (557 pb). Cepas C2, C4, C5, C7, C9, C10, C13, C14, B1, B3, B6, B7, B8, B9, B13, B15, B16, C15, C16 resultaron positivas para E. faecium. D) Amplificación del gen ddl de E. durans (187 pb). Cepas B2, B4, B5 resultaron positivas para E. durans. E) y F) Amplificación del gen ddl de E. faecalis (941 pb). Cepas B10, B11, B12, C3, C3, C17 resultaron positivas para E. faecalis. 

En estudios donde se caracterizaron bacterias ácido lácticas no iniciadoras (BAL-Ns) en quesos mediterráneos y quesos brasileños, se ha encontrado que una tercera parte de ésta población está formada por Enterococcus (^{Margalho et al. 2020}, ^{Terzic-Vidojevic et al. 2021}) los ensayos moleculares del presente trabajo, confirman lo anterior, ya que partiendo de 89 BAL aisladas, 37% de ellas son Enterococcus, se asignó la especie a 29 de estas cepas utilizando la PCR pero no fue posible distinguir la especie de las cepas B14, C1, C8 y C12; sin embargo, de acuerdo al perfil fenotípico, se infiere que podrían ser E. casseliflavus, ya que los resultados de pruebas fenotípicas son similares a los publicados por ^{Hawaz et al. (2016)}. Las muestras con la mayor cantidad de cepas aisladas fueron las del lactosuero mixto, probablemente a que proceden de establecimientos donde elaboraban productos como quesillo, queso fresco, queso panela y requesón, principalmente, y es una mezcla de lactosueros ácidos y dulces (Tabla 3). La alta incidencia de cepas de Enterococcus en subproductos lácteos y alimentos fermentados sugieren que este género tiene un papel importante como BAL-Ns en el proceso de desarrollo del sabor y aroma durante la elaboración de quesos, debido a ciertas características metabólicas como la producción de enzimas proteolíticas y lipolíticas, así como la producción de diacetilo a partir de citrato (^{Centeno et al. 2022}).

Los resultados, indican que en 3 de las 4 localidades analizadas se detectó la presencia de E. faecalis, hallazgo que comúnmente se considera como contaminación fecal, principalmente por que Enterococcus se encuentran entre los patógenos nosocomiales más comunes que pueden causar infecciones y enfermedades importantes (^{Almeida-Santos et al. 2021}, ^{Rangel-Ortega et al. 2023}), pero muchos estudios han informado que esta ocurrencia no siempre está relacionada con la contaminación, y que las cepas nosocomiales son diferentes a las cepas de Enterococcus presentes en alimentos y lactosuero. Un ejemplo, de estas diferencias es que algunas cepas como E. faecium M74, E. faecium SF-68, E. faecalis Symbioflor se incluyen en productos medicinales o alimenticios como probióticos siendo eficaces y seguros (^{Braïek et al. 2019}). Las enterocinas son en gran parte las moléculas responsables del efecto probiótico de Enterococcus, el microorganismo completo se aplica en el tratamiento y/o prevención de enfermedades humanas y animales, como el alivio de los síntomas del síndrome del intestino irritable, la diarrea provocada por antibióticos y la prevención de diferentes afecciones intestinales en humanos, animales de granja y mascotas. Las enterocinas son bacteriocinas, péptidos con actividad antimicrobiana que han tomado interés como alternativa a los antibióticos, por ello, el negocio de las bacteriocinas es importante y tiene altas expectativas de crecimiento (^{Kasimin et al. 2022}). Con respecto a la nisina, primera bacteriocina en ser comercializada, se espera que abarque un mercado de 553 millones de dólares para 2025. El queso mexicano también se estudia como fuente de probióticos, se han reportado bacteriocinas como la Pediocina PA-1 que se aisló del queso Cotija, del estado de Michoacán, además E. durans 41D que produce Duracin GL que se aisló de muestras de queso mexicano (^{Trejo-González et al. 2022}). En las muestras de lactosuero de las 4 localidades analizadas en Puebla se aislaron 89 bacterias ácido lácticas de las cuales 33 fueron caracterizadas como del género Enterococcus, la especie mayoritaria fue E. faecium, seguida de E. faecalis y en tercer lugar E. durans. Para cuatro cepas no se determinó la especie. Hace falta una legislación apropiada para diferenciar entre cepas de Enterococcus patógenas y cepas seguras, con la finalidad de promover en productores y consumidores la aceptación de cepas seguras como candidatas potenciales para aplicaciones útiles y benéficas como probióticos. Lo anterior, contribuye a revalorizar el lactosuero como una fuente de beneficios para la salud y evitar desecharlo al ambiente