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Introducción
La dermolipectomía es un procedimiento quirúrgico con fines funcionales y estéticos que consiste en retirar excesos de piel y tejido adiposo en brazos y abdomen1,2. Este procedimiento posee una tasa de complicaciones generales de 45.8%, entre las que se encuentran los seromas (23.6%), infecciones (13.9%), hemorragias (11.1%), hematomas (6.9%), necrosis de la piel (6.9%) y necrosis umbilical (4.2%); de éstas, un total de 11.1 % requiere reoperación3. Este procedimiento estético, como cualquier práctica quirúrgica, se acompaña de lesiones persistentes o recurrentes debido al desarrollo de dehiscencias que interfieren con la cicatrización en 7.3% de los pacientes, lo que ocasiona úlceras crónicas de difícil tratamiento4. Estas lesiones suelen complicarse con diferentes alteraciones metabólicas, como diabetes, obesidad, hipertensión y desnutrición, entre otros5-7.
El tratamiento convencional de este tipo de lesiones consiste por lo general en la aplicación de parches hidrocoloides, fármacos, operaciones o injertos de piel autólogos; sin embargo, éstos no son del todo efectivos y pueden presentar efectos adversos y secundarios8-13. Como alternativa se plantea el uso de células madre mesenquimales (CMM) como tratamiento celular para regenerar y cicatrizar órganos y tejidos14, ya que tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en osteoblastos, condrocitos, adipocitos, células musculares y neurocitos15,16. Hasta ahora, el estudio de las CMM se centra en las provenientes de médula ósea como norma de referencia, aunque en fecha reciente se han propuesto novedosas fuentes que no implican métodos invasivos para su obtención con potenciales fines terapéuticos.
Una fuente accesible de CMM es la gelatina de Wharton (CMMWG) de cordón umbilical, que representa un tejido rico en células madre con alta capacidad de autorrenovación y diferenciación múltiple, y dado que se desecha después del parto su uso no representa restricciones éticas17,18. Por otra parte, las CMMGW tienen baja inmunogenicidad debido a que no activan la proliferación de células T, al no expresar el complejo principal de histocompatibilidad clase II (MHCII) ni moléculas coestimuladoras como CD40, CD80 y CD86, que son necesarias para la activación de las células T19. Estudios clínicos demuestran que al administrar CMMGW la proliferación de linfocitos se suprime y además no activa al MHC20. Por esta razón, el rechazo después del trasplante del injerto celular es mínimo o nulo, incluso entre individuos no emparentados21. Además, las CMM presentan un efecto inmunomodulador en los linfocitos T y B, células dendríticas y NK, ya que se puede inhibir la proliferación de las células inmunitarias y reducir la secreción de citocinas y la presencia de los subtipos de células infiltradas en tejido20,22-25, lo cual atenúa la inflamación y promueve la cicatrización de las lesiones.
Estas características y propiedades de las CMMGW alogénicas proporcionan una ventaja para la regeneración de tejidos y lograr así el cierre de heridas y evitar el rechazo. El presente trabajo tuvo como objetivo emplear el tratamiento de células madre mesenquimales como una alternativa para la resolución de úlceras persistentes en las que los procedimientos convencionales no han permitido la cicatrización. Las CMMGW de cordón umbilical, aisladas y trasplantadas en heridas de gran persistencia, evitarán el rechazo inmunológico y recobrarán la capacidad de recuperación e inmunorregulación, así como la remodelación del tejido dañado de úlceras secundarias a operaciones. Esto representa una novedosa alternativa terapéutica para el tratamiento de úlceras y lesiones de difícil atención.
Materiales y métodos
Caso clínico
Mujer de 41 años de edad con úlcera crónica abdominal transversal de tres meses derivada de dermolipectomía estética. La herida presentaba una extensión de 6 x 7 cm y profundidad de 1 cm con hiperqueratosis, bordes engrosados, aperlados, pobre cicatrización espontánea, y datos de infección persistente: eritema, exudado purulento, dolor y dehiscencia. La lesión respondió de forma discreta a los tratamientos como yodopovidona, peróxido de hidrógeno o soluciones hiperoxidantes. Después del tratamiento con antibióticos orales se valoró a la paciente como elegible para recibir tratamiento celular. Una vez informada de riesgos y beneficios consintió mediante su firma para participar en el protocolo de investigación del uso de CMM como tratamiento regenerativo proporcionado por el personal científico de la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional en colaboración con el Instituto de Seguridad Social del Estado de México y Municipios (ISSEMYM), con la autorización del comité de ética e investigación con registro CIS Y CEIS/0118 P.I./15.
Obtención de células madre mesenquimales de gelatina de Wharton y su aplicación
Las CMM se aislaron a partir de gelatina de Wharton de cordones umbilicales de madres saludables que llegaron a término de gestación a las 38 a 40 semanas; estos cordones se seleccionaron de forma previa y los donó el Banco de Cordón Umbilical del Hospital la Raza del IMSS (que cuenta con certificación de seguridad biológica). Para obtener los cultivos celulares, los cordones umbilicales se lavaron y procesaron en el Laboratorio de Medicina Regenerativa y Estudios en Cáncer de la Escuela Superior de Medicina del IPN, donde se aplicaron dos digestiones enzimáticas consecutivas: colagenasa tipo 2 (Sigma-Aldrich, EE.UU.) al 1 % en PBS y tripsina (Gibco®, EE.UU.) al 0.1 %, ambas con agitación constante a 37.5 °C durante 60 y 30 min, respectivamente. La mezcla digerida se cultivó en placas de 100 mm de diámetro en medio DMEM-F12 al 10% de suero fetal bovino y 1x de Antibiotic/Antimicotic (Gibco®, EE.UU.), a 37°C, 5% de CO2 y atmósfera saturada de humedad. Al alcanzar confluencia de 80 a 90%, las células se desprendieron y resembraron sin utilizar más de un séptimo pase. Las CMM se caracterizaron y seleccionaron con base en los criterios de la International Society for Cellular Therapy26. Las CMM listas para la aplicación se suspendieron en solución salina isotónica estéril para administrarse de manera intradérmica en los bordes y el lecho de lesión a razón de 100 000 ± 10 000 células/cm2 de herida27, previos lavado y desinfección de la zona de aplicación. La lesión se revisó y cubrió con apósitos estériles cada día. La aplicación celular se repitió a los siete días.
Adherencia y morfología similar a fibroblastos
Se seleccionaron las células que presentaron en cultivo adherencia y morfología similar a fibroblastos con base en los criterios de la ISCT.
Diferenciación osteogénica y adipogénica
Se mantuvieron placas de cultivo tomadas de diferentes pases durante 21 días con Stempro® Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco®, EE.UU.). Con posterioridad, las células se fijaron con formol al 10 %, y se tiñeron con rojo de alizarina 10 min para identificar depósitos de calcio. De igual manera, otros cultivos celulares se mantuvieron con Stempro® Adipogenesis Differentiation Kit (Gibco®, EE.UU.) durante 21 días. A continuación, las células se fijaron con formol al 10% y se tiñeron con rojo oleoso en isopropanol al 60% para evidenciar vacuolas grasas.
Expresión génica de antígenos de superficie
La expresión génica para los marcadores de superficie de las CMM se evaluó con RT-PCR cuantitativa en tiempo real. El RNA total se extrajo a partir de 1 x 106 células en cultivo y también de leucocitos de 5 ml de sangre periférica, como control de expresión hematopoyética, mediante el protocolo de extracción TRIzol® reagent (Invitrogen, EE.UU.). El DNAc para la PCR se sintetizó con el First Transcriptor Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Applied Science, Alemania). El diseño específico de gen de los oligonucleótidos iniciadores o cebadores de la reacción (primers) se realizó a través de Universal ProbeLibrary System Assay Design de www.lifescience.roche.com (Tabla 1). Para la reacción de amplificación se utilizó LightCycler® 480 SYBER Green I Master kit (Roche, Alemania) en un LightCycler 1.5 Thermoclycler (Roche, Alemania). Se utilizó el método de ΔΔCt para el análisis de la expresión relativa con el gen normalizador GAPDH.
Tabla 1 Oligonucleótidos iniciadores para PCR en tiempo real
| Gen | Referencia NCBI | Secuencia de oligonucleótidos | |
|---|---|---|---|
| Forward | Reverse | ||
| GAPDH | NM_002046.3 | tcaacgaccactttgtcaag | actgtgaggaggggagattc |
| CD105 | NM_000118.2 | tgccactggacacaggataa | caagacttgtggggctgag |
| CD73 | NM_001204813.1 | cctctcaaaatggacgaggt | aaccacgttgatatcttggtca |
| CD90 | NM_006288.3 | aggacgagggcacctacac | gccctcacacttgaccagtt |
| HLA-DR | NM_019111.4 | tcttcatcatcaagggattgc | ttctctctaagaaacaccatcacct |
| CD34 | NM_001025109.1 | tggctatttcctgatgaatcg | tccaccgttttccgtgtaat |
| CD45 | NM_002838.3 | ccattgacaaccaccctca | ggcattaaggtaggcatctga |
Histología
Se tomó una biopsia de 5 x 5 mm en el interior de la zona de la herida al inicio del tratamiento y otra al séptimo día, ambas fijadas en formol al 10% en PBS y luego incluidas en parafina, y cortadas en espesores de 5 µm. Los cortes se montaron en laminillas de vidrio y después se desparafinaron, hidrataron, tiñeron con hematoxilina de Harris y contrastaron con eosina. Por último, las preparaciones se aclararon y montaron con resina de metacrilato/acrilato (Entellan Merck, Alemania).
Respuesta de la lesión
La recuperación de la lesión se determinó al plantear el índice úlcera, que se interpretó por el porcentaje del área de la herida abierta remanente con respecto al área de la herida al inicio del tratamiento. También se expresó la tasa de recuperación (Tr) de la herida como el cociente Tr = Ar/tr, en el cual Ar es el valor del área recuperada (cm2) durante el tratamiento, y tr los días que duró la recuperación del área. Las extensiones de las áreas ulceradas y recuperadas se evaluaron mediante el análisis de imágenes con el programa ImageJ.
Condición inflamatoria
Para determinar la condición inflamatoria de la paciente, se evaluó el fenotipo TH1/TH2 en muestras de sangre periférica antes y después del tratamiento, a través del kit II Th1/Th2 (CBA, EE.UU.), que identifica citocinas mediadoras de la inflamación: interferón gamma (IFN-g), interleucina 2 (IL-2), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), interleucina 4 (IL-4), interleucina 6 (IL-6) e interleucina 10 (IL-10). La evaluación de las células se realizó en un citómetro de flujo FACS DivaTM III (BD Immunocytometry Systems, EE.UU.) y para el análisis de los datos se utilizó el software BDTM Cytometric Bead Array Software, versión 1.4.
Resultados
Células madre mesenquimales
Las células de la gelatina de Wharton se expandieron, seleccionaron y aislaron (Fig. 1). El cultivo presentó morfología característica de CMM con semejanza a fibroblastos (células pequeñas, largas y estrechas con un núcleo redondo, grande y céntrico) (Fig. 1A). Por otra parte, en presencia del medio osteogénico las células respondieron con un proceso de diferenciación celular al formar depósitos de calcio extracelulares teñibles con rojo de alizarina (Fig. 1B). Asimismo, en presencia de un medio adipogénico, las células se diferenciaron y formaron vesículas intracelulares positivas a la tinción con rojo oleoso (Fig. 1C). La PCR en tiempo real mostró que las CMM manifestaron expresión génica de los marcadores de superficie CD73, CD90 y CD105 y no de los marcadores hematopoyéticos CD34, CD45 y HLA-DR (Fig. 1D), lo cual concuerda con las características señaladas por la ISCT26.
Figura 1 Obtención y caracterización de las CMM de gelatina de Wharton. A: Cultivos de CMM de gelatina de Wharton en el sexto pase; B: Células en medio de diferenciación osteogénica, , acúmulos de Ca++ y fosfato extracelular teñidos con rojo de alizarina; C: Células en medio de diferenciación adipogénico, , con vesículas lipídicas intracelulares teñidas con rojo oleoso; D: Análisis de la expresión génica relativa. Microscopio de campo claro invertido Oxion (PCE Instruments, Chile).
Respuesta de la lesión al tratamiento
La aplicación cutánea de las CMM sobre la lesión recuperó tejido al inducir desbridamiento y cicatrización (Fig. 2). Al séptimo día de tratamiento, la lesión mostró reducción de su extensión, profundidad y grosor al presentar bordes mejor definidos, con una mayor extensión de piel en los márgenes y una capa celular superficial, típica señal de cicatrización (Figs. 2A y B); además, los sitios de toma de biopsia se rellenaron rápidamente con tejido. Por otra parte, el área abierta se redujo en 70% (Fig. 2C) y con una tasa de cierre más rápida (Fig. 2D) en los primeros siete días del tratamiento, mientras que en la segunda aplicación el índice de úlcera se redujo hasta un 80% (Fig. 2C).
Figura 2 Respuesta de la lesión. A: Aspecto de la herida antes del tratamiento; B: Aspecto de la herida siete días después del primer tratamiento, : sitios de biopsias; C: Índice de úlcera con respecto al tiempo del tratamiento; D: Tasa recuperación. Microscopio de campo claro invertido Oxion (PCE Instruments, Chile).
Histopatología
En los cortes histológicos de la herida sin tratar se mostró un estado leve de inflamación (Fig. 3), pero sin presentar signos de infección. Se identificó un notorio infiltrado leucocitario perivascular y edema en la evaluación inicial; sin embargo, después de la primera aplicación y ya en la segunda dichos infiltrados decrecieron y pudo identificarse la formación de nuevos vasos sanguíneos y fibras de colágena revelados por la tinción de hematoxilina (Figs. 3A y B). La cuenta de leucocitos en el tejido mostró una disminución significativa mayor de 20% después del tratamiento con CMM (Fig. 3C).
Figura 3 Recuperación de la lesión. A: Cortes histológicos antes del tratamiento; B: despúes de siete días del primer tratamiento, : infiltrado linfocitario perivascular, #: edema, ▲: formación de vasos, *: fibras de colágena; C: Conteo leucocitario en tejido prueba t de Student para muestras relacionadas, p < 0.05. Microscopio de campo claro invertido Oxion (PCE Instruments, Chile).
Atenuación del estado proinflamatorio con células madre mesenquimales
En muestras sanguíneas se analizó la presencia de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias antes y después del tratamiento celular (Fig. 4) y se observó que el tratamiento con CMM propició una disminución de las citocinas proinflamatorias TNFa, IL-6, IFNg y la citocina antiinflamatoria IL-4. Pese a ello, el tratamiento incrementó el número de las citocinas antiinflamatorias IL-2 e IL-10.
Discusión
La herida con tratamiento convencional de tres meses no sanó, ya que se encontraba en condiciones no aptas para repararse debido a un proceso de cicatrización deficiente. Esto pudo deberse a un estado general desfavorable (estrés, hábitos de vida, entre otros)28 en relación con su inmunología, metabolismo, estado nutricional y emocional ocasionado por el sobrepeso que lleva a los pacientes a someterse a una cirugía de dermolipectomía29. Debido a la persistencia de la abertura de la lesión, la paciente fue elegible para recibir tratamiento con CMMGW de cordón umbilical, que se ha señalado como una opción terapéutica27.
Las células que recibió la paciente fueron CMM y cumplieron con los criterios mínimos establecidos por la ISCT para el tratamiento celular, como la adherencia y forma del fibroblasto, lo que hizo posible su selección en cultivo como se indica para las CMM26. En cuanto a las proteínas marcadoras de superficie CD73, CD90 y CD105, su expresión se reveló por la presencia del RNAm correspondiente, mientras que la expresión de CD34, CD45 y HLA-DR fue reducida o nula (como se esperaba), por lo que se satisficieron todas las características de CMM propuestas por la ISCT26.
En otro aspecto, las células mostraron capacidad de diferenciación osteogénica y produjeron acúmulos que se tiñeron con rojo de alizarina, que es afín a los depósitos de calcio y fosfato, lo que indicó que las células se diferenciaron en osteoblastos. Asimismo, las células en medio adipogénico se diferenciaron en células que mostraron acumulación de vesículas citoplásmicas positivas a la tinción con rojo oleoso, que reveló los lípidos característicos de adipocitos. Ambas pruebas confirmaron la plasticidad de las CMM como el tercer criterio de la ISCT20,26,30.
Los resultados mostraron que la administración de CMM mejoró la recuperación de la úlcera en un tiempo menor al que toma el tratamiento convencional, probablemente porque se favoreció la cicatrización, que se relaciona con las fases bien coordinadas entre la inflamación, la proliferación celular y la remodelación de la lesión31,32.
En cuanto a la evaluación médica de la lesión, se pudo observar que el tratamiento celular indujo un proceso de desbridamiento natural que facilita la fase proliferativa del proceso de cicatrización debido a la liberación in situ de factores como TNFa, IFNg y IL-633, lo cual favorece el desplazamiento, atracción e infiltración de plaquetas y queratinocitos nativos que remodelan la zona de la lesión. Los macrófagos también tienen una función muy importante, dado que éstos desbridan y remodelan la zona afectada28,32-34 en conjunto con otros leucocitos. En la fase proliferativa también se desarrollan fenómenos de angiogénesis, los cuales fueron evidentes en los cortes histológicos. La vascularización favorecida en la lesión pudo promover la irrigación sanguínea y el paso de oxígeno y nutrientes, lo que contribuye a la formación de fibras de colágena en la disposición adecuada para formar una matriz extracelular de soporte que llevó a la fase de maduración y remodelación del tejido28,34.
En los cortes histológicos se reconoció la presencia de fibras de colágena formadas de novo por el tratamiento (característico de la fase proliferativa de la cicatrización), lo que precede a la fibroplastia y formación de tejido granular; esta nueva matriz extracelular proporciona el soporte celular para estimular la epitelización y contracción de la herida31,32. Lo anterior llevó a la reducción tanto del área como de la profundidad de la herida, en especial de los sitios donde se tomó la biopsia, lo que indicó regeneración28,34.
Tal y como se ha descrito en muchos tratamientos en los que se administran células mesenquimales, no se produjo rechazo inmunológico debido a que las CMM son de baja inmunogenicidad, y con propiedades inmunomoduladoras que no inducen la expresión del MHC clase II19,31. Dichas propiedades se vieron reflejadas al detectar una disminución de las citocinas proinflamatorias TNFa, IFNg e IL-6 en sangre, mientras que las cantidades de las moléculas antiinflamatorias IL-2 e IL-10 se mantuvieron; no obstante, se detectaron valores bajos de IL-4. Esto coincide con lo observado en la inhibición de la proliferación de esplenocitos de ratón y linfocitos humanos, en la cual se suprime además la secreción de otras citocinas inflamatorias como el IFN-g16,20,22-25.
Los autores proponen que el cambio en el estado de inflamación es efecto del tratamiento con CMMGW, como se ha demostrado en otras lesiones crónicas34; no obstante, con estos resultados sería importante realizar un análisis estadístico para asegurar una relación causa-efecto.
El nuevo equilibrio del estado de inflamación creado por el tratamiento celular, como se ha documentado en otros trabajos, posibilitó la proliferación celular, la angiogénesis y el desarrollo de una matriz extracelular de soporte y diferenciación para las mismas CMM, así como para otras células. Del mismo modo, favoreció el ingreso de elementos y factores procicatrizantes y activó la nutrición, oxigenación y eliminación de desechos que promovieron la reparación del tejido, de tal modo que mejoró la apariencia de la herida al igual que las condiciones que mantenían el estado persistente de la úlcera16,28,31-35.
Conclusiones
El tratamiento con células madre mesenquimales de gelatina de Wharton es factible para tratar una úlcera crónica persistente derivada de una dermolipectomía de mal pronóstico y difícil manejo, lo que representa una interesante alternativa médica con potencial para muchos otros tipos de lesiones, en los cuales se permita la regulación de los procesos inmunológicos, quimiotácticos y modeladores del tejido y una baja inmunogenicidad. Esta modalidad permite que el paciente controle sus procesos de cicatrización con menos asistencia a consultas, lo que implica en términos de costo y beneficio un menor gasto en servicios de salud a largo plazo y una reducción del tiempo de convalecencia.
