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INTRODUCCIÓN
Escherichia coli O157, es un patógeno importante en salud pública, que puede llegar a producir toxina Shiga (STEC) (Kaper et al., 2004). Los productos STEC son transmitidos a través de los alimentos, especialmente el serotipo O157:H7. Las enfermedades causadas al humano por el serotipo que produce STEC, van desde diarrea leve a colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SHU), que por lo general afecta a niños, pacientes de edad avanzada e inmunocomprometidos (Rodríguez-Angeles, 2002). La patogenicidad de STEC reside en diferentes factores de virulencia, incluyendo las toxinas Shiga (Stx1 y Stx2), intimina, enterohemolisina y el autoaglutinantes STEC adhesina (AEA) (Gyles, 2007). Se ha reportado que los rumiantes domésticos como vacas, ovejas y cabras son portadores asintomáticos, que pueden portar STEC y E. coli O157:H7 en sus heces, por lo que se consideran reservorios naturales de estos patógenos (Blanco et al., 2004; Milton et al., 2018; Iweriebor et al., 2015; Bolukaoto et al., 2019). Para eliminar la colonización de bacterias patógenas en animales y prevenir la contaminación de la carne, existe una variedad de agentes químicos antimicrobianos que están disponibles para la terapéutica en ganado; sin embargo, investigadores en nutrición animal han reportado que con el aumento del uso de agentes antimicrobianos en animales y seres humanos, ha aumentado la prevalencia de cepas resistentes (Cattoir y Leclercq, 2017; Kim et al., 2019). Los genes CTX-Mβ-lactamasas han sido reportados en E. coli, a partir de ganado con fines alimenticios en todo el mundo; levantando una amenaza potencial para la salud pública (Wittum et al., 2010; Botelho et al., 2015; Vitas et al., 2018). A partir del aumento de cepas resistentes a antibióticos, se han buscado nuevas alternativas de origen natural, como los extractos de plantas; por ejemplo, el extracto de hoja de guayaba (Psidium guajava), que tiene actividad antibacteriana de amplio espectro (Martínez et al., 1997; Bermúdez-Vásquez et al., 2019). Rattanachaikunsopon y Phumkhachorn (2010), reportan que el extracto acuoso de hoja de guayaba mostró actividad antibacteriana en un 35% de los casos, el alcohólico en un 65% y el cetónico en el 100%, contra bacterias patógenas; incluyendo Bacillus stearothermophilus, Brochothrix thermosphacta, E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus y Vibrio cholerae. El extracto acuoso de las hojas de guayaba disminuye la producción de toxinas lábiles de E. coli y del cólera (Birdi et al., 2010) . Echemendía y Morón (2004) en su ensayo clínico concluyeron que la tintura al 20% de hoja de Psidium guajava tiene efecto antidiarreico y Lozoya et al. (2002) evaluaron el polvo de las hojas secas, comprobándose este efecto. Se han aislado diversos compuestos químicos, a partir del extracto de hoja de guayaba, como son: el triterpenoide pentacíclico, el ácido guajanoico; así como, ß-sitosterol, uvaol, ácido oleanólico y ácido ursólico y quercetina (Biswas et al., 2013), para comprobar el efecto antibacteriano que presentan las hojas de guayaba. Por lo que el objetivo del presente trabajo fue la caracterización y determinación del efecto inhibitorio de movilidad en E. coli O157:H7, de extractos de hojas de guayaba (Psidium guajava).
MATERIAL Y MÉTODOS
Obtención del extracto alcohólico de hojas Psidium guajava
Para cada extracto se utilizó etanol al 70% J.T. Baker, en una relación de 25 gramos de la muestra molida por cada 200 mL de solvente. La mezcla fue colocada y sellada en frascos color ámbar de un litro, se homogenizo vigorosamente por 10 min; el extracto se dejó reposar durante un mes a temperatura ambiente. El sobrenadante fue pasado a través de papel filtro (Whatman No. 2), para remover los restos del polvo de la planta (Pesewu et al., 2008). Una parte del extracto preparado se empleó para concentrarlo mediante el uso del equipo soxhlet durante una hora, recuperando la mitad del volumen inicial, llamándolo Extracto B. El extracto A se le nombró al extracto más diluido, o como se obtuvo después de la filtración.
Composición química de los extractos de hoja de guayaba por cromatografía de gases
La composición química se determinó mediante un cromatógrafo de gases (CG; Agilent Technologies serie 6890N fabricado en U.S.A), con una columna polar DB_WAXetr, a 250 °C y 12.13 psi con un flujo de He 36.5 mL min-1 después de la inyección. Las condiciones para la columna fueron: temperatura inicial 50 °C, de cero a dos min, aumentando de 10 en 10 °C hasta llegar a 250 °C, manteniendo la temperatura constante por 5 min, para luego descender a 50 °C por dos min con un flujo de He de 1.6 mL min-1 a una presión de 12.13 psi y una velocidad promedio de 25 cm s-1, utilizando un detector de flama ionizante (FID) a una temperatura de 210 °C, con un flujo de H2 de 40 mL min-1 y un flujo de aire de 450 mL min-1. Para el corrimiento de muestras en el cromatógrafo se emplearon los estándares de carvacrol y timol (Sigma-Aldrich) (Bañuelos-Valenzuela et al., 2018)
Determinación de la dosis mínima hemolítica de los extractos
Se extrajeron 10 mL de sangre en un tubo heparinizado; se centrifugó el tubo con la sangre sin coagular a 2500 rpm x 10 min a 10ºC, removieron la fracción del suero con una pipeta; posteriormente se realizaron tres lavados con un regulador de lavado [PBS al 50% (v/v) y glucosa al 2.25% (w/v)] (López et al., 2017); luego se centrifugó en cada lavado a 2500 rpm x 10 min a 10ºC. El paquete de eritrocitos se recuperó́ y se resuspendió́ hasta una concentración del 0.1% (v/v) con un regulador de suspensión, que consiste en PBS al 50% (v/v) glucosa al 2.25% (w/v) y gelatina al 0.05% (w/v). Se realizó́ por triplicado el ensayo en placas de 96 pozos de fondo U; se mezclaron 100 μL de la suspensión de eritrocitos al 1% con 100 μL de la suspensión de cada extracto y con diluciones de 1:10, 1:100 y 1:1000. El control negativo únicamente se inoculó 100 μL; este mismo procedimiento se realizó para cada principio activo en sus diferentes concentraciones (carvacrol, timol y quercetina), de la suspensión de eritrocitos al 1%. Para el control positivo se mezclaron 100 μL de la suspensión de eritrocitos al 1% con 100 μL de Tritón X al 1%; se observaron los cambios en la suspensión de eritrocitos cada hora, hasta cumplir 24 h. Con base a los controles positivo y negativo se determinó́ si había actividad hemolítica del extracto sobre los eritrocitos. Para el corrimiento de muestras en el cromatógrafo, se emplearon los estándares de carvacrol y timol, de la marca SIGMA grado reactivo. Se concentró el extracto de hoja de guayaba (40 mg/mL) mediante ebullición (Ext A).
Identificación de bacterias en medio cromogénico CHROMagarTM
Se obtuvieron hisopados rectales provenientes de rumiantes lactantes, con presencia de síndrome diarreico, menores de 21 días de edad y con la seguridad de haber ingerido calostro. La colecta de las muestras se realizó vía rectal con un hisopo estéril, se etiquetaron y transportaron en medio Stuar® elaborado en México D.F; cada muestra se sembró en la caja petri con agar MacConkey. Se tomó una colonia para proseguir con la identificación, la cual se realizó mediante una siembra por estría en placa en medio cromogénico CHROMagarTM O:157, para E. coli O:157:H7 (Moyne et al., 2011). Luego seleccionaron 78 cepas bacterianas de heces de rumiantes lactantes con síndrome diarreico menores de tres meses, identificadas como E. coli O157:H7 en CHROMagar™ las cuales presentaron coloración rosa malva, debido a sustratos cromogénicos en el medio; permitiendo así la identificación presuntiva de la placa de aislamiento primario y la diferenciación de otros organismos (Hirvonen et al., 2012; Lara et al., 2019).
Preparación del medio SIM en tubo con extracto
Se preparó medio SIM para cada tipo de estándar y extracto. Para la preparación del medio SIM, se pesaron 30 g de agar por cada litro de agua destilada; el agar fue esterilizado en autoclave a 121 °C por 15 min. Se dejó enfriar el agar a una temperatura de 35 °C aproximadamente, para adicionar el extracto y el estándar correspondiente; posteriormente se adicionaron 4 mL de la mezcla anterior en tubos estériles de 10 mL. Para cada bacteria se realizó una serie de tubos por triplicado, como se describe a continuación: Control (sin extracto), Carvacrol (C 0.3 mM, C 1 mM y C 5 mM), Ext A (extracto guayaba diluido), Ext B (extracto guayaba concentrado), Q 205 (quercetina 205 mM), Q 102 (quercetina 102 mM), Q 51 (quercetina 51.25 mM) y OH (control alcohol).
Pruebas de movilidad bacteriana
Cada una de las bacterias identificadas por CHROMagarTM O:157, fue sembrada en agar base por estría, con el objetivo de obtener una sola colonia asilada para posteriormente realizar la siembra en tubo. La siembra en tubo se realizó mediante picadura, que consiste en tomar una colonia aislada de bacterias y hacer una picadura en el medio SIM, atravesando el agar hasta el fondo del tubo; al medio se preparó con los extractos, estándares y control. Una vez terminada la siembra por picadura, todas las muestras permanecieron a una temperatura de 37 °C, en una incubadora Thermo ® durante un periodo de 24 h. Las condiciones de siembra se hicieron con debida esterilidad para evitar contaminación; estas se realizaron en una campana de flujo laminar (Lab tech ®). La movilidad bacteriana fue medida, usando un método cualitativo; a) motilidad positiva (+): presencia de turbidez difusa o total en el medio. b) motilidad negativa (-): ausencia o presencia leve de crecimiento, solo en el sitio de la picadura.
Análisis estadístico
El análisis estadístico realizado fue el de tablas de contingencia de dimensión 2×2, entre las variables extracto A y extracto B vs carvacrol 0.3 mM, carvacrol 1 mM, carvacrol 5 mM, quercetina 205 mM, quercetina 102 mM y quercetina 51 mM. Los criterios utilizados fueron las pruebas de independencia de X2 (prueba ji cuadrada), considerando un nivel de significancia de p<0.05 y un intervalo de confianza del 95% (Good, 2000). Los datos fueron capturados en Excel y analizados en el programa Statistical Package for the Social Sciences (SPSS por sus siglas en inglés) versión 17.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la tabla 1, se muestra la presencia de los principios activos carvacrol y timol en los extractos alcohólicos de hojas de guayaba, así como su concentración por cromatografía de gases.
Tabla 1 Resultados de la cromatografía de gases expresado en unidades de concentración mg/mL
| Extracto de hoja de Guayaba | Carvacrol | Timol |
|---|---|---|
| Extracto A | 3.0869 | 1.5130 |
| Extracto B | 0 | 0.3525 |
Ambos principios activos (carvacrol y timol), estuvieron presentes en el extracto A; mientras que el extracto B, sólo se identificó el timol. El principio activo de mayor concentración en los extractos fue el carvacrol con 3.0869 mg/mL en el extracto A. Las plantas medicinales son comúnmente ricas en terpenos (carvacrol, citral, linalol y geraniol) y compuestos fenólicos, compuestos eficaces como aditivos alimentarios (Nile et al., 2017) . El modo primario de acción antibacteriana del timol no se conoce completamente, pero se cree que implica la disrupción de la membrana externa e interna y la interacción con proteínas de membrana y dianas intracelulares. Los estudios de Wang y Yam (2018) han demostrado que el timol interactúa con las membranas celulares, y estas interacciones afectan la permeabilidad de la membrana bacteriana. Para el efecto hemolítico y con base a los controles positivo y negativo, se determinó́ si había actividad hemolítica de los extractos de hojas de guayaba y los principios activos sobre los eritrocitos. En la tabla 2 se observó que para carvacrol a una concentración de 0.3 mM, no se presentó hemolisis, en los extractos A y B sólo hay hemolisis hasta la dilución 1:10. Por último, para quercetina la concentración mínima de hemolisis fue en dilución 1:10 de sus tres concentraciones. Como menciona López et al. (2017) el término hemólisis hace referencia al proceso de destrucción de los eritrocitos, que genera la liberación de los componentes intraeritrocitarios; por lo tanto, la prueba de hemólisis se utiliza para conocer el efecto provocado sobre la célula eritrocitaria al enfrentarla con los extractos a diferentes concentraciones, que es lo que se pretendió con este experimento. La inhibición de hemólisis se debe a los componentes bioactivos, tipo flavonoides y compuestos fenólicos presentes en los extractos de guayaba.
Tabla 2 Actividad hemolítica de los extractos de hoja de guayaba
| Dilución muestra | Solución madre | 1:10 | 1.:100 | 1:1000 |
|---|---|---|---|---|
| C 0.3Mm | + | - | - | - |
| C 1Mm | + | + | - | - |
| C 5 Mm | + | + | + | - |
| EXT A | + | + | - | - |
| EXT B | + | + | - | - |
| Q 205 mM | + | + | - | - |
| Q 102 Mm | + | + | - | - |
| Q 51mM | + | + | - | - |
Los eritrocitos pueden cambiar su forma normal a la forma de equinocitos o estomatocitos, lo cual depende de factores citoplasmáticos, entre ellos el pH (Gedde et al., 1997). Las altas concentraciones de flavonoides hallados en frutas como el mango (García Bacallao et al., 2001), hojas de guayaba (Rodríguez et al., 2013) y flavonoides obtenidos de maqui (Aristotelia chilensis) con propiedades antioxidantes, son inductores de equinocitos (Gironés-Vilaplana et al., 2012; Durán et al., 2013).
Con el uso del CHROMagar se identificó E. coli O:157 H7, diferenciándose por el color de la colonia en el medio, presenta una coloración rosa malva (Lara et al., 2019). Este medio inicialmente se utilizaba en la industria alimentaria para la liberación rápida de alimentos libres de patógenos, pero actualmente se encuentra aprobado para el análisis de muestras clínicas y ha sido empleado en diversos estudios (Bettelheim, 1998; Tang et al., 2014;Gutierrez et al., 2016; Parsons et al., 2016). Se identificaron 78 cepas de E. coli O157:H7 mediante CHROMagar™ selectivo, y estas bacterias fueron inoculadas en medio SIM. Los resultados de la movilidad in vitro de los extractos de hoja de guayaba y los estándares (principios activos de hoja de guayaba) sobre las bacterias, se observan en la tabla 3. Este efecto se evaluó cualitativamente por la presencia o ausencia de turbidez en el tubo; los resultados mostraron que los estándares de carvacrol tienen amplia actividad antibacteriana, frente a 65 microorganismos; inhibiendo en 56 bacterias el crecimiento bacteriano a una concentración de 5 mM (tabla 3); en relación con el extracto A de guayaba que presentó efecto en la inhibición de la movilidad de 62 bacterias; mientras que el extracto B inhibe 46 bacterias. Quercetina a una concentración de 51 mM, presentó la mayor inhibición de movilidad en 60 bacterias.
Tabla 3 Resultados totales de movilidad bacteriana
| C 5 mM | C 1 mM | C 0.3 mM | EXT A | EXT B | Q 205 | Q 102 | Q 51 | OH | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| + | 56 | 60 | 65 | 62 | 46 | 59 | 51 | 60 | 0 |
| - | 22 | 18 | 13 | 16 | 32 | 19 | 27 | 18 | 78 |
(+): Presencia de turbidez difusa o total en el medio. (-): Ausencia o presencia leve de crecimiento.
Gallegos-Flores et al. (2019) reportaron que el carvacrol a una concentración de 0.3 mM disminuye la movilidad de la cepa determinada con la técnica de Wertern Blot, donde observaron la disminución de la síntesis de flagelina; esta proteína se encuentra en un 8% de la proteína total celular. Estos resultados difieren de los reportados en la tabla 2, debido principalmente a que la concentración de 0.3 mM, no inhibió la movilidad en el 100% de las bacterias E. coli O157:H7. Desde el punto de vista de Gallegos-Flores et al. (2019), las células de E. coli crecen en presencia de carvacrol a una concentración de 5 mM sin síntesis de flagelos, provocando que el microorganismo crezca sin movilidad; es decir, cuando la célula bacteriana está sujeta a un estrés ocasionado por sustancias tóxicas y se encuentra en riesgo su supervivencia; la cual es capaz de suprimir la producción de la proteína flagelina y conservar energía para otras funciones celulares, que pueden por lo tanto, ser una táctica de supervivencia; sin embargo, a una concentración mayor de 5 mM la bacteria cesa inmediatamente la movilidad y ocurre muerte celular; observándose que la concentración de 5 mM es la que presenta mayor número de bacterias que inhibieron el crecimiento. La interacción carvacrol-quercetina que se encuentra presente en el extracto A de hojas de guayaba, presenta una mayor inhibición en la movilidad de las bacterias, siempre y cuando las concentraciones de carvacrol y quercetina sean las antes señaladas (tabla 4). Ambos casos son significativos, pero se distinguen una magnitud de comparación mayor del extracto A con carvacrol y quercetina, debido a los compuestos químicos presentes. Menor magnitud de Chi cuadrada representa mayor semejanza al extracto; por lo tanto, el extracto B representa más semejante al estándar de quercetina, pero no tiene el efecto de inhibición.
Tabla 4 Eficiencia de los extractos
| Concentración | Extracto A | Extracto B | ||||||||
| X2 | z | p | X2 | z | p | |||||
| 0.3 | + - | 127 29 | 81.41 18.59 | 7.84 | 0.0001 | 111 45 | 71.15 28.85 | 5.28 | 0.0001 | |
| Carvacrol (mM) | 1 | + - | 122 34 | 78.21 21.79 | 7.04 | 0.0001 | 106 50 | 67.95 32.05 | 4.48 | 0.0001 |
| 5 | + - | 118 38 | 75.64 24.36 | 6.4 | 0.0001 | 102 54 | 65.38 34.62 | 3.84 | 0.0001 | |
| 205 | + - | 121 35 | 77.56 22.44 | 6.88 | 0.0001 | 105 51 | 67.31 32.69 | 4.32 | 0.0001 | |
| Quercetina (mM) | 102.5 | + - | 113 43 | 72.44 27.56 | 5.6 | 0.0001 | 97 59 | 62.18 37.82 | 3.04 | 0.0023 |
| 51.25 | + - | 122 34 | 78.21 21.79 | 7.04 | 0.0001 | 106 50 | 67.95 32.05 | 4.48 | 0.0001 | |
X2: valor de ji cuadrada calculada.
El carvacrol daña la membrana exterior de las bacterias gram negativas e incrementan la permeabilidad de la membrana citoplasmática que causa pérdidas de ATP, fuga de iones y lisis celular (Meira et al., 2017). El hecho de que las bacterias gram negativas flageladas en presencia de carvacrol no desarrollen flagelos, podría tener implicaciones para el uso de este compuesto como aditivo antibacteriano para productos alimenticios y/o para la generación de nuevos antibióticos; ya que si la célula bacteriana no presenta flagelos, esto disminuye o inhibe su mecanismo de patogenicidad, al ser menos capaz de adherirse a las células epiteliales del huésped. Finalmente, el efecto de quercetina sobre la E. coli O157:H7 a una concentración de 102 mM, resulta ser la óptima en la movilidad de las bacterias, teniendo el mismo efecto en la interacción quercetina-extracto B; esto puede ser atribuido a que el principal compuesto activo en las hojas de guayaba es el flavonoide quercetina, al cual se le atribuye un efecto antibacteriano (Echemendía y Morón, 2004) .
