Actividad antihelmíntica

Para evaluar la actividad antihelmíntica se utilizaron huevos de H. contortus (HC) y larvas en estadio L3. Los parásitos de la cepa INIFAP se obtuvieron del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Pecuarias y Agronómicas (INIFAP).

Prueba de eclosión de huevos

Los huevos de HC se obtuvieron siguiendo un protocolo aprobado por el Comité de Bioética del Instituto de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo. Brevemente, un cordero Hampshire (3 meses y 37 kg PV), clínicamente sano y libre de nematodos gastrointestinales, fue infestado con larvas de HC en estadio L3 (350 larvas kg-1 PV). Pasados 21 días después de la infestación, se recogieron muestras fecales y se determinó el número de huevos por gramo de heces mediante el método McMaster (^{Cordero-Miguel et al., 2000}).

Para recuperar los huevos de HC se siguió la metodología descrita por ^{Olmedo et al., (2017)}. Se lavaron 30 gramos de heces con agua destilada en tamices de 200, 100, 75 y 37 µm y se concentraron en el tamiz de 37 µm. El material retenido en el último tamiz se lavó con 6 mL de solución salina saturada y se centrifugó a 3000 rpm durante 3 min. El sobrenadante se descartó y el sedimento se lavó tres veces con agua destilada para obtener huevos libres.

Se utilizó una placa ELISA de 96 pocillos para el ensayo. En cada pocillo se añadieron entre 150 y 200 huevos en 50 µl de agua destilada y 50 µl de extracto (200, 100, 50, 25 o 12,5 mg mL^-1). Cada concentración de extracto se ensayó con cuatro réplicas, utilizando Ivermectina (5 mg mL^-1) y agua destilada como controles positivo y negativo, respectivamente. Las placas se incubaron a 30 °C durante 48 h en una cámara de humedad constante. Tras la incubación, se observaron diez alícuotas de 10-μL al microscopio para contar el número de huevos no eclosionados y de larvas (vivas o muertas) por pocillo. Por último, se calculó el porcentaje de inhibición de la eclosión de los huevos mediante la ecuación 1.

Prueba de mortalidad de larvas

Las heces de los corderos infestados se mezclaron con agua destilada y espuma de poliuretano (1,5 × 1,5 × 0,5 cm) y se incubaron durante 10 días a temperatura ambiente (15-20 °C). Tras la incubación, se recuperaron las larvas del estadio L3 de HC siguiendo la técnica de Baermann. Las larvas en estadio L3 se desenfundaron con hipoclorito de sodio (NaClO) al 3 % durante un minuto y se lavaron tres veces con agua destilada para eliminar el NaClO residual.

El ensayo se realizó en placas de 96 pocillos. En cada pocillo se añadieron 150-200 larvas suspendidas en 50 µl de agua y 50 µl de extracto de K. daigremontiana (200, 100, 50, 25 o 12,5 mg mL^-1). Cada concentración de extracto se ensayó con cuatro réplicas, utilizando Ivermectina (5 mg mL^-1) y agua destilada como controles positivo y negativo, respectivamente. Las placas se incubaron en una cámara de humedad constante a 30° C durante 72 h. Tras la incubación, se observaron al microscopio diez alícuotas de 10 µl para determinar el número de larvas vivas o muertas por pocillo. La tasa de mortalidad para cada concentración de extracto se determinó mediante la ecuación 2:

Ensayo de motilidad de las larvas

Para este ensayo, se colocaron larvas de HC en fase L3 sin envainar en placas de 96 pocillos. En cada pocillo se añadieron 150-200 larvas suspendidas en 50 µl de agua y 50 µl de extracto (200, 100, 50, 25 o 12,5 mg mL^-1). Cada concentración de extracto se ensayó con cuatro réplicas, utilizando Ivermectina (5 mg mL^-1) y agua destilada como controles positivo y negativo, respectivamente. Las placas se incubaron en una cámara de humedad constante a 30° C durante 72 h. Tras la incubación, se observaron alícuotas de 10 µl al microscopio para determinar el número de larvas vivas/muertas, móviles/inmóviles por pocillo. La tasa de inhibición de la motilidad para cada concentración de extracto se determinó mediante la ecuación 3:

Actividad antibacteriana

Los microorganismos utilizados para determinar la actividad antibacteriana del extracto hidroalcohólico de K. daigremontiana fueron Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Listeria monocytogenes (ATCC 19113) y Escherichia coli (ATCC 35218).

Se utilizó el método de microdilución en caldo descrito por Kaewpiboo et al., (2012) con algunas modificaciones para determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) del extracto hidroalcohólico de K. daigremontiana. Se prepararon diluciones seriadas dobles del extracto hidroalcohólico de K. daigremontiana (de 400 a 0,781 mg mL^-1) por duplicado (100 μL por pocillo). Se ajustó una suspensión de células bacterianas a 0,5 unidades McFarland (aproximadamente 1,5 × 106 unidades formadoras de colonias [UFC] mL^-1).

Se añadió una alícuota de 10-μL a cada pocillo. Se utilizó kanamicina (AppliChem 4K10421™) como control positivo (64-0,5 µg mL^-1) y caldo nutritivo como control negativo. Las placas se incubaron a 37 °C bajo agitación (70 rpm) durante 24 h.

Tras la incubación, se añadieron 20 μL de solución de p-iodonitrotetrazolio al 0,04% (p/v) a cada pocillo y se incubaron durante 30 min. Un cambio de color de amarillo a rosa indicó la reducción del colorante debido al crecimiento bacteriano. La CIM se determinó para cada concentración de extracto como la concentración más baja en la que no se observó crecimiento microbiano, según la ausencia de cambio de color (Figura 1).

Figura 1 Concentración letal (CL₅₀ y CL₉₀ ) del extracto hidroalcohólico de Kalanchoe daigremontiana para inhibir la eclosión de huevos de Haemonchus contortus 

Análisis estadístico

Los datos se analizaron mediante un análisis de varianza de una vía y la prueba post hoc de Tukey-Kramer (α = 0,05). Las concentraciones que inhibieron el 50% (CL₅₀) y el 90% (CL₉₀) de la eclosión y la motilidad de los huevos de HC, así como las que mataron el 50 y el 90% de las larvas, se calcularon mediante un análisis PROBIT utilizando el paquete estadístico SAS 9.0.

Actividad antihelmíntica

La eficacia media del extracto hidroalcohólico de K. daigremontiana contra la HC se muestra en la Tabla 2. Se encontró una tasa de inhibición de la eclosión de los huevos (IEH %) significativamente diferente con respecto a los controles positivos y negativos (P < 0,0001) en el rango 100-200 mg mL^-1 (99,5%). Por otro lado, la mortalidad (MOR%) también fue significativamente diferente con respecto a los controles (P < 0,0001), observándose los valores más altos de MOR% a 50 y 25 mg mL^-1 (16,4 y 14,5%, respectivamente). Finalmente, se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos en cuanto a la inhibición de la motilidad (IMOT%). El valor más alto de IMOT% se observó a 200 y 100 mg mL^-1 (85,2 y 73,1%, respectivamente).

Como se muestra en las figuras 1 y 2, los valores de CL₅₀ y CL₉₀ para la eclosión de los huevos fueron de 66,5 y 87,3, y de 1,5 y 240,9 para la inhibición de la motilidad en las larvas de la fase L3 de HC.

Figura 2 Concentración letal (CL⁵⁰ y CL⁹⁰) del extracto hidroalcohólico de Kalanchoe daigremontiana para inhibir la motilidad en larvas de Haemonchus contortus en estadio L3  

Actividad antibacteriana

Como se muestra en la Tabla 3, el extracto hidroalcohólico de K. daigremontiana mostró actividad antibacteriana contra bacterias Gram negativas (P. aeruginosa) y Gram positivas (L. monocytogenes, B. subtilis y S. aureus). La CIM fue de 100 mg mL^-1 para P. aeruginosa y L. monocytogenes y de 0,781 mg mL^-1 contra B. subtilis y S. aureus.

Nuestros resultados sugieren que el extracto hidroalcohólico de K. daigremontiana tiene una actividad significativa contra la eclosión de huevos de H. contortus in vitro (Figura 1). La actividad del extracto fue buena como la del control positivo (Ivermectina 5 mg mL^-1), lo que indica la viabilidad de utilizar esta especie vegetal como agente antihelmíntico. Dado que no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos de 100 y 200 mg mL^-1, se podría utilizar la dosis más baja para reducir el riesgo de resistencia de los nematodos al fármaco. Curiosamente, la muerte no fue el principal efecto del extracto, sino la inhibición de la motilidad.

El extracto hidroalcohólico de K. daigremontiana es capaz de inhibir la eclosión de los huevos y la motilidad de las larvas (Figura 2). También se ha informado de que otras moléculas derivadas de la planta, como los flavonoides, las flavonas, las saponinas, los alcaloides, las xantonas (^{Rivero et al., 2016}), los polifenoles (^{Akkari et al., 2016}), los taninos (Desrues et al., 2016) y los derivados de pirazol-5-carboxamida (^{Jiao et al., 2017}), reducen la motilidad de las larvas. Se ha informado de la presencia en K. daigremontiana de flavonoides y polifenoles (^{Karwatzki et al., 1993}), y es factible que estos compuestos desempeñen un papel en la inhibición de la motilidad de las larvas.

Nuestros resultados muestran que el extracto hidroalcohólico de K. daigremontiana inhibe la motilidad de las larvas en estadio L3 de HC, pero no son eficaces para matarlas. Esto podría ser relevante para el uso propuesto de los extractos de K. daigremontiana como antihelmíntico, ya que (^{Moradpour et al., 2013}) han descrito los cambios morfológicos en los tejidos del abomaso debido a la migración del parásito a diferentes partes del abomaso de las ovejas. Los resultados de la actividad antihelmíntica aquí reportados son similares a los observados por Phatak (2013), quien no encontró ninguna actividad en los extractos metanólicos y de éter de petróleo de Kalanchoe pinnata sobre la supervivencia de las larvas; sin embargo, los extractos redujeron la motilidad de las larvas. 5% de los huevos no eclosionaron cuando se expusieron a 100 y 200 mg mL-1 del extracto, con una CL50 de 66,5 mg mL-1 y una CL90 de 87,3 mg mL-1.Según ^{Lunkad et al., (2016)}, los extractos de especies del subgénero Bryophyllum, como B. pinnatum, mostraron actividad antihelmíntica en varias concentraciones (30 y 50 mg/ml) contra las lombrices de tierra indias Pheretima posthuman, contando como actividad antihelmíntica la parálisis y muerte de más del 50% de los organismos.

Un posible mecanismo de acción de los metabolitos secundarios de las plantas sobre los huevos y larvas de nematodos como H. contortus implica la inhibición o retraso del crecimiento y maduración del parásito por la afinidad de las glicoproteínas de la cutícula del parásito a los compuestos fenólicos (mediada por los residuos de prolina); los polifenoles pueden unirse a estas proteínas, inhibiendo la motilidad, alimentación y reproducción del parásito, causando finalmente su muerte; además, las saponinas tienen acciones membranolíticas (^{Hernández et al., 2018}; ^{Irshad et al., 2010}).

Con respecto a la actividad antibacteriana, el extracto hidroalcohólico de K. daigremontiana mostró una mayor actividad sobre bacterias grampositivas que sobre bacterias gramnegativas; esto podría explicarse considerando que las bacterias gramnegativas tienen una membrana externa fosfolipídica y porinas; la membrana fosfolipídica que recubre los componentes estructurales de los lipopolisacáridos hace que la pared celular sea impermeable a los solutos lipofílicos.

^{Mothana et al., (2009)} evaluaron 25 plantas con actividad antibacteriana, entre ellas Kalanchoe farinacea. El extracto metanólico de esta planta tuvo actividad inhibitoria sobre S. aureus, B. subtilis, y Staphylococcus epidermidis y S. aureus multirresistentes a una concentración de 4 mg mL-1, produciendo zonas de inhibición de 15 y 16 mm en cultivos de S. aureus y S. epidermidis y S. aureus multirresistentes, respectivamente, y zonas de inhibición de 10 mm en cultivos de B. subtilis, pero no tuvo efecto contra las bacterias gramnegativas.

Los extractos de diclorometano de las hojas de K. pinnata produjeron zonas de inhibición de 18 mm cuando se ensayaron contra E. coli, pero no tuvieron efecto sobre S. aureus ni P. aeruginosa. Estos resultados coinciden en parte con los que se han comunicado aquí. El extracto hidroalcohólico de K. daigremontiana no tuvo efecto sobre E. coli, pero fue eficaz contra P. aeruginosa, con una CIM de 100 mg mL^-1. El mismo estudio informó de que el extracto metanólico contenía saponinas, glucósidos cardíacos y esteroides como metabolitos secundarios con posible actividad antibacteriana.

^{Richwagen et al., (2019)} informaron de la actividad antibacteriana de los extractos de dos especies de Kalanchoe, K. mortagei y K. fedtschenkoi, contra los patógenos ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter cloacae). En general, se observó una inhibición del crecimiento superior al 50% (CL50) a concentraciones de 256 μg mL-1 y 128 μg mL-¹.

^{De Souza Barboza et al., (2016)}, corroboraron la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos de hojas y flavonoides presentes en Kalanchoe pinnata (Lam.), concentraciones de 100 μg mL-¹, mostraron una reducción del crecimiento superior al 50% para Pseudomonas aeruginosa y Citrobacter freundii.

^{Akinnibosun et al., (1994)} informaron de que un extracto etanólico de las hojas de K. pinnata era más eficaz contra S. aureus, E. coli y P. aeruginosa que los extractos acuosos y metanólicos de la misma planta, mostrando zonas de inhibición de 17,3 ± 1,2, 12,7 ± 0,9 y 8,3 ± 0,9 mm para S. aureus, E. coli y P. aeruginosa, respectivamente. En un análisis químico cualitativo del extracto etanólico se detectaron flavonoides, esteroides, alcaloides, taninos, glucósidos cardíacos y azúcares reductores, junto con metabolitos secundarios con actividad antimicrobiana declarada, principalmente saponinas y compuestos fenólicos como los taninos.