Introducción

Los trematodos del género Notocotylus (Diesing, 1839; Digenea: Notocotylidae) son un grupo cosmopolita que incluye más de 63 especies endoparásitas (^{Boyce et al., 2012}). Difiere de otros géneros por la presencia de tres hileras de papilas ventrales de número variable (^{Barton & Blair, 2005}). Los notocotylidos presentan un sistema de organización muscular fuerte y complejo que consta de tres capas musculares principales en su pared corporal, formada por haces de fibras longitudinales, circulares y diagonales que les permiten su movimiento, adhesión y mantener su forma; además posee fibras musculares para fijación de órganos internos (^{Krupenko & Gonchar, 2017}). En su fase adulta, parasitan los ciegos intestinales y/o parte final del intestino delgado de aves incluidas Anseriformes (Anatidae) y Gruiformes (Rallidae; ^{Stunkard, 1960}; ^{Kulisic et al., 2004}; ^{Hinojosa-Sáez et al., 2009}), así como algunos mamíferos (^{Kinsella & Tkach, 2005}).

Las claves taxonómicas para trematodos se basan en medidas lineales de diversos caracteres, entre ellos el largo y ancho total, longitud y número de ovarios y testículos, número de asas uterinas, así como la presencia o ausencia de espinas u otras estructuras (^{Yamaguti, 1971}; ^{Jones et al., 2005}). En estudios del género Notocotylus, se han registrado nuevas especies y sinonimizado otras a partir de diferencias en estructuras, por ejemplo, el número de papilas ventrales, la longitud relativa del metratermo con la bolsa del cirro, el tamaño del esófago, la extensión de la vitelaria en proporción al cuerpo y la lobulación de las gónadas (^{Behari Lal, 1935}; ^{Brooks & Heard III, 1977}; ^{Boyce et al., 2012}).

^{Besprozvannykh (2010)} diferenció a Notocotylus intestinalis Tubangui, 1932 de Notocoylus attenuatus (^{Rudolphi, 1809}) Kossack, 1911, por la presencia de espinas en el cuerpo, cantidad y magnitud de lobulaciones testiculares, diferencia entre cercarias, y género del primer hospedero intermediario. Mediante microscopia electrónica, otros investigadores incluyen la posición del poro genital respecto a la bifurcación de los ciegos (^{Kinsella & Tkach, 2005}). Sin embargo, algunos trabajos consideran también el estado larvario, género del hospedero intermediario y distribución geográfica para el registro de nuevas especies (^{Flores & Brugni, 2005}). En trabajos recientes sobre el género Notocotylus, se ha utilizado la información en conjunto, tamaño, forma y distancia entre estructuras mediante morfometría tradicional (^{Khan et al., 2017}). Lo anterior sugiere la necesidad de homologar los caracteres taxonómicos y buscar herramientas para mejorar la identificación de estas especies.

La morfometría geométrica es una herramienta moderna de gran utilidad para analizar las estructuras biológicas mediante la información geométrica de la forma y la relación espacial entre sus partes o configuración geométrica (^{Bookstein, 1991}; ^{Toro et al., 2010}). A partir de estos supuestos, es una herramienta eficaz en estudios de discriminación de especies, como en triatominos (Heteroptera) con base en la configuración geométrica del borde corial y del collar de huevos (^{Páez-Colasante & Aldana, 2008}). También se ha demostrado su utilidad como resultado complementario en estudios cladistas, y ejemplo de ello es su uso en la determinación de especies de la tribu Rhodniini (Hemiptera) cuyo análisis se basó en la variación de la arquitectura alar y análisis cladísticos (^{Soto-Vivas et al., 2011}). Estos análisis también han sido eficazmente utilizados en grupos parásitos para determinar la modularidad interespecífica de órganos de adhesión de platelmintos (^{Vignon et al., 2011}) y la variación intraespecífica en las estructuras de fijación de acantocéfalos (^{Caballero-Viñas et al., 2019}), en los cuales se evidencian variaciones morfológicas que son inconsistentes con morfometría tradicional. En trematodos, se ha analizado la forma corporal de metacercarias con morfometría geométrica (^{Repkin et al., 2020}).

El objetivo del presente estudio fue analizar mediante análisis de morfometría tradicional y geométrica, las variaciones de organismos adultos del género Notocotylus, que parasitan aves acuáticas residentes y migratorias de las Ciénegas de Lerma.

Materiales y métodos

Sitio de estudio: colecta de hospederos y parásitos. Las aves se obtuvieron por donación de cazadores locales durante el periodo de marzo a diciembre de 2000 y 2013 de los humedales Chignahuapan (19° 11’ 20” N; 99° 29’ 30” O; ^{Martínez-Haro et al., 2012}) en el municipio de Almoloya del Río, y de febrero de 2015 a marzo de 2017 de Chimaliapan (19° 14’ 31.0” N; 99° 28’ 53.9” O) en San Pedro Tultepec, del municipio de Lerma, ambos en el Estado de México (Fig. 1). La identificación taxonómica de las aves se realizó con guías de campo de ^{Preston (1998)} y ^{Van Perlo (2006)}.

Figura 1 Ubicación de zona de estudio. Tomado de ^{Zepeda-Gómez y col. (2012)}. 

Las aves se trasladaron al laboratorio de Sistemas Biosustentables de la UAEMéx, donde se realizó la disección y el examen helmintológico de su aparato digestivo con ayuda de un microscopio estereoscópico modelo Olympus SZX7. Los organismos del género Notocotylus se extrajeron y limpiaron de materia orgánica con el uso de pinceles y solución salina al 0.7 %, se aplanaron ligeramente entre dos portaobjetos para su fijación por capilaridad con formol caliente al 4 %, se tiñeron con paracarmín de Meyer y se montaron con bálsamo de Canadá (^{Lamothe-Argumedo, 1997}).

La identificación de las especies parásitas se realizó mediante claves taxonómicas (^{Yamaguti, 1971}; ^{Barton & Blair, 2005}) y descripciones específicas (^{Stunkard & Dunihue, 1931}; ^{Behari Lal, 1935}; ^{Eom et al., 1984}; ^{Guillén & Morales, 2003}) (Cuadro 1).

Se analizaron 117 individuos del género Notocotylus, todos obtenidos de ciegos intestinales de sus hospederos. Se formaron nueve subgrupos para su estudio bajo los siguientes criterios: especie parásita, hospedero y localidad (Cuadro 2). Se tomaron fotografías de cada ejemplar mediante un microscopio estereoscópico Olympus SZX7® conectado a una cámara Olympus E-620 IS® para su posterior análisis por morfometría lineal y geométrica. Los ejemplares se depositaron en la Colección Nacional de Helmintos (CNHE 8598-8599, 11156-11157, 11654-11658), Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México.

Morfometría lineal. Mediante la paquetería ImageJ 1.43u® se obtuvieron las siguientes variables: longitud total (LT), ancho total (AT), longitud de ventosa oral (LVO), ancho de ventosa oral (AVO), longitud de vitelaria (LVit), longitud del área uterina (LAUt), longitud de ovario (LO), ancho de ovario (AO), longitud testicular (LTest) y ancho testicular (ATest) (Fig. 2).

Figura 2 Ubicación de estructuras anatómicas y puntos de referencia 1-9 y 15; semimarcas 10-14 y 16-20. Notocotylus attenuatus (Vo: ventosa oral; Met: metratermo; Út: Útero; Vit: vitelaria; Ov: ovario; Test: testículo. Barra= 1 mm), hospedero Aythya affinis. 

Los datos obtenidos se procesaron mediante Análisis de Componentes Principales para conocer el porcentaje de variación de los datos y reducir la dimensionalidad o número de variables. Para visualizar agrupaciones se realizó un Análisis de Funciones Discriminantes (^{McGarigal et al., 2000}). Todos los análisis se realizaron en el software Statgraphics Centurion XVI.I®.

Morfometría geométrica. Se analizó la forma para cada especie de Notocotylus con base en puntos de referencia de tipo III y semi-landmarks ubicados en estructuras anatómicas y el contorno de la forma, bajo los criterios de homología, consistencia, repetitividad y coplanaridad para cada organismo (^{Toro et al., 2010}). El análisis de la configuración de la forma se llevó a cabo mediante los diferentes módulos de la paquetería IMP8 (Integrated Morphometrics Package) y la serie TPS, la cual genera coordenadas (x,y) para cada punto de referencia (^{Zelditch et al., 2004}).

Se ubicaron en total 20 puntos en la forma de cada organismo (Fig. 2). Diez landmarks como se describe a continuación: 1.- bifurcación de los ciegos; 2.- límite del útero e inicio de metratermo; 3.- inicio de vitelaria; 4.- final o parte posterior de la vitelaria; 5.- borde anterior del testículo; 6.- borde posterior del testículo; 7.- borde anterior del ovario; 8.- borde posterior del ovario; 9.- ventosa oral y extremo anterior del organismo; 15.- extremo posterior del organismo. Los diez semilandmarks, enumerados del 10-14 y 16-20, están distribuidos en el perímetro de los organismos y homólogos en toda la muestra (^{Toro et al., 2010}), y se trazaron con apoyo de cinco peines transversales, ocho radios entre los dos peines extremos de la parte anterior y ocho radios entre los dos peines de la parte posterior de la forma mediante el módulo MakeFan8 de la paquetería IMP8. Los landmarks y semilandmarks fueron digitalizados en TPSdig. Se realizó el Análisis de Procrustes o ajuste de datos en Coordgen8 para eliminar el efecto del tamaño y rotación, y la alineación de landmarks y semilandmarks de toda la muestra en Semiland8. Para obtener el porcentaje de varianza de cada variable, se realizó un Análisis de Componentes Principales en el módulo PCAGen8 y la obtención de morfotipos con la herramienta de función de interpolación de placas delgadas o Thin Plate Spline (^{Bookstein, 1991}). Se realizó un Análisis de Variables Canónicas para visualizar los subgrupos. Todos los análisis se efectuaron a un nivel de significancia menor o igual a 0.05.

Resultados

Morfometría lineal

Se identificaron tres especies del género Notocotylus en ciegos intestinales. Los organismos que parasitan a Fulica americana Gmelin, 1789 y Gallinula galeata Lichtenstein, 1818, se identificaron como Notocotylus pacifera (^{Noble, 1933}) ^{Harwood, 1939}, de acuerdo con su forma ovalada, sin espinas, glándulas vitelógenas laterales extracecales, útero extendido desde la zona ecuatorial hasta delante de los testículos, con número y arreglo de papilas ventrales 9-14:4:9-14 (L:C:L), y medidas lineales correspondientes al promedio de la especie (Cuadro 1). Notocotylus attenuatus, con forma ovalada alargada, arreglo de papilas 13:13:14, y medidas correspondientes a las de referencia, se obtuvo de Aythya affinis Eyton, 1838. Finalmente, los organismos parásitos de Anas clypeata Linnaeus, 1758, Anas discors Linnaeus, 1766 y Anas cyanoptera Vieillot, 1816, se identificaron como Notocotylus seineti^{Fuhrmann, 1919} de acuerdo con el arreglo de papilas ventrales 12-14:12-13:12-15 y medidas lineales promedio (Cuadro 1).

En el análisis de morfometría lineal se obtuvo 89.3 % de variación de los datos en los dos primeros componentes principales. Los organismos forman dos grupos principales de acuerdo con los siguientes caracteres: ancho total y ancho del ovario para la Función Discriminante 1 (FD1 79.75 %, Wilk´s λ= 0.008, CANCOR= 0.96, p <0.0001), mientras que la longitud total y la longitud testicular discriminan para la FD2 (8.65 %, Wilk´s λ= 0.114, CANCOR= 0.748, p <0.0001; Fig. 3). Los especímenes fueron clasificados correctamente en 70.94 % de acuerdo con las distancias de Mahalanobis.

Figura 3 Discriminación de grupos con morfometría lineal. A la derecha subagrupación de Notocotylus en hospederos de la familia Rallidae, y del lado izquierdo subagrupación de Notocotylus en hospederos de la familia Anatidae. 

Morfometría geométrica

En el análisis de la forma de las tres especies de Notocotylus se obtuvo 85 % de la variación de los datos en los dos primeros componentes. Los individuos se agruparon en dos nubes de puntos. Una nube que incluye a las especies N. seineti y N. attenuatus, y otra a N. pacifera, lo cual indica mayor variación en la forma (Fig. 4).

Figura 4 Variación de los datos de la forma de tres especies de Notocotylus de diferentes hospederos y localidades. 

El Análisis de Variables Canónicas (VC1: 24.42 y VC2: 4.33; eje1: λ= 0.0001, x ²= 878.0277, df= 288, p <2.22045e-16; eje2: λ= 0.0021, x ²= 575.4695, df= 245, p <2.22045e-16) separa los nueve subgrupos de individuos en tres grupos principales. El grupo de a, a la derecha de VC1, que incluye a N. attenuatus y N. seineti de diferentes hospederos anátidos y dos localidades. El grupo b, a la izquierda de VC1 y parte superior de VC2, donde se incluye a N. pacifera de dos especies hospederas de rálidos y dos localidades. El grupo c, a la izquierda de VC1 e inferior del eje VC2, que corresponde a N. pacifera de un hospedero rálido de San Pedro Tultepec, Lerma, notoriamente separado de N. pacifera del grupo b (Fig. 5).

Figura 5 Análisis de Variación Canónica. a) es el conjunto de Notocotylus de hospederos Anátidos; b) y c) muestran la separación de grupos de N. pacifera de diferenteshospederos y localidades. 

El morfotipo a, de tipo elíptico, presenta la mayor variación en el contorno lateral, de manera uniforme y con una ligera ampliación en la zona del metratermo; el morfotipo b tiene una reducción anteroposterior en la zona del útero y a la vez un desplazamiento lateral hacia el exterior de la misma zona, proporcionándole forma ovoide al organismo, además del desplazamiento del ovario hacia la parte anterior; mientras que el morfotipo c presenta desplazamiento hacia la parte posterior de la ventosa oral, así como un ligero desplazamiento de los testículos y el ovario hacia la parte anterior del cuerpo, mayor desplazamiento del contorno lateral medio; asimismo, la última asa uterina (antes del metratermo) presentó menor desplazamiento en la forma en comparación con los morfos a y b (Fig. 6).

Figura 6 Gradillas de deformación de 3 morfotipos. a) Notocotylus en hospederos de Anátidos; b) N. pacifera de hospederos Rálidos; c) morfotipo de N. pacifera, hospedero F. americana, San Pedro Tultepec, Lerma. Los puntos indican el promedio y las flechas la dirección del desplazamiento de la forma. 

Discusión

El presente estudio sugiere que las variaciones morfológicas en el género Notocotylus están determinadas por el grupo de hospedero y la localidad donde éste se distribuye. Notocotylus seineti y N. attenuatus que parasitan anátidos, presentan el mismo morfotipo aún en diferentes localidades, mientras que N. pacifera varía su forma intraespecífica de acuerdo con el hospedero específico y la localidad. Los anátidos corresponden al grupo de aves migratorias, mientras que los hospederos rálidos incluyen aves residentes.

Tradicionalmente se utilizan las medidas lineales para la identificación de especies, así como la presencia y ausencia de estructuras. Estudios recientes han incluido forma y tamaño de estructuras con morfometría tradicional para descripción de nuevas especies del género como es el caso de Notocotylus sindhensis^{Khan et al., 2017}; en otros análisis se ha confirmado la identificación con datos moleculares (^{Repkin et al., 2020}).

El ancho total del cuerpo y el ancho del ovario son los caracteres que aportan la mayor variación en los datos lineales para discriminar especies, lo que corresponde con lo propuesto por ^{Falconer (1981}; tomado de ^{Soto-Vivas et al., 2011)}, quién indica que los caracteres métricos son los primeros que cambian en el transcurso de la evolución como respuesta a la demanda del entorno y al genoma.

El análisis con morfometría geométrica es utilizado por primera vez en estos organismos. A partir de la variación de la forma de las tres especies de Notocotylus, se obtuvieron nubes de puntos de acuerdo con el hospedero que parasitan, lo que sugiere una similitud con los resultados obtenidos en el trematodo Fasciola hepatica (^{Valero et al., 2012}), que sugiere que el hospedero definitivo influye en el tamaño de la forma adulta y de los huevos. Las especies de Notocotylus que parasitan aves migratorias no presentaron variación morfológica interespecífica, mientras que N. pacifera presentó variaciones intraespecíficas con las variables hospedero y localidad, lo cual puede relacionarse al efecto que tiene la migración sobre la adaptación local (^{Morgan et al., 2005}).

La obtención de tres grupos y sus morfotipos involucra desplazamientos de landmarks relacionados con estructuras reproductivas. Las variaciones en el contorno lateral se extienden hacia los costados del organismo al nivel del área uterina y no hacia la parte anterior o posterior del mismo, lo cual podría ser explicado por la plasticidad fenotípica inducida por el microhábitat del parásito (^{Neves et al., 2004}), las condiciones de desarrollo y crecimiento de los organismos (^{Mackinnon, 1982}), así como las adaptaciones interespecíficas de acuerdo con el arreglo muscular del género (^{Krupenko & Gonchar, 2017}).

Lo anterior sugiere revisar las características histológicas, fisiológicas y nutricionales del microhábitat para obtener una visión más clara de la influencia que podría tener el hospedero definitivo y su hábitat sobre las variaciones morfométricas de los Notocotylus en fase adulta.

En conclusión, se propone incluir la metodología de morfometría geométrica en el estudio del género Notocotylus en otras poblaciones de aves residentes y migratorias para definir los morfotipos que presentan y estandarizar su uso para posteriores investigaciones.