En México, el tomate (Solanum lycopersicum) es el segundo cultivo en importancia después del chile con una producción de 3.2 millones de toneladas en 2017 y las enfermedades causadas por begomovirus constituyen una limitante para su producción. Los begomovirus se consideran patógenos emergentes de cultivos tropicales y subtropicales, pueden tener una o dos moléculas de ADN monocatenarias circulares (denominadas componentes A y B, respectivamente) de aproximadamente 2.6 kb cada una y están constituidos de dos partículas isométricas incompletas unidas. El componente B depende del A para la replicación del virus, ambos tienen una región común (CR) de aproximadamente 200 pb y son necesarios para que ocurra la infección. En África, Asia, Australasia y Europa, la mayoría de los begomovirus son de genoma monopartito y algunos tienen un genoma bipartito, mientras que los nativos del continente Americano son en su mayoría bipartitos. En la naturaleza, los begomovirus no se transmiten mecánicamente pero lo hacen de manera eficiente de forma persistente por el complejo de especies de Bemisia tabaci. La aparición de brotes de enfermedades ocasionadas por estos virus en tomate se ha atribuido a la introducción y propagación de diversos biotipos de B. tabaci que son polífagos y colonizan fácilmente al cultivo (^{Brown et al., 2015}).

La mayoría de los virus fitopatógenos que se transmiten por semilla poseen genoma de ARN. Sin embargo, recientemente se han reportado algunos begomovirus que también pueden transmitirse de este modo (^{Ortega et al., 2019}). Los invernaderos productores de tomate de alta tecnología destinan casi la totalidad de su producción al mercado de exportación. En invernaderos localizados en Atlacomulco, Estado de México, se ha detectado al Impatiens necrotic spot virus (INSV), Tobacco mosaic virus (TMV) y Pepino mosaic virus (PepMV) en plantas con mosaicos y pequeñas lesiones necróticas en el primer caso, así como al Mexican papita viroid (MPVd) en plantas con síntomas de acortamiento de entrenudos y reducción del tamaño de foliolos en la parte apical. En los últimos meses se han observado incidencias de 60 a 90% de plantas donde, además de mosaicos en ciertos casos, se observan abarquillamientos, moteados, amarillamientos y, en situaciones severas, reducción del tamaño del fruto, síntomas característicos de una infección por begomovirus, ocasionando pérdidas económicas al disminuir el número de frutos aptos para su comercialización. Considerando que las plantas con esta nueva sintomatología han sido negativas a INSV, TMV, PepMV y MPVd, el propósito de esta investigación fue identificar a los begomovirus asociados, establecer si se transmiten por semilla, determinar la especie de mosca blanca presente en los invernaderos y confirmar si ésta es portadora del virus.

Se recolectó tejido foliar del estrato superior de plantas de tomate que tenían los síntomas descritos anteriormente. En la base de las plantas con síntomas se colocaron trampas Moëricke conteniendo agua + jabón líquido (1000:1 v/v) para recolectar semanalmente insectos en tubos Falcon de 15 mL que contenían etanol 96% durante un mes. Se extrajo ADN de plantas siguiendo el protocolo de ^{Dellaporta et al. (1983}), a partir de 0.1 g del tejido recolectado, mientras que para mosca blanca fue con CTAB 2% a partir de 5 individuos adultos. En este último caso, los insectos fueron lavados cuatro veces con agua destilada y colocados en un tubo de 1.5 mL que contenía un balín estéril y 500 µL de CTAB. Los tubos se mezclaron en vórtex por 2 min, fueron incubados a 65 °C en un termoblock por 15 min, permanecieron 10 min a temperatura ambiente para agregarles 500 µL de cloroformo y mezclarlos por inversión durante 10 min. Fueron centrifugados a 13,000 rpm por 10 min y 400 µL del sobrenadante se pasaron a un nuevo tubo de 1.5 mL para agregarles 200 µL de isopropanol e incubarlos a -20 °C por 20 min. Después de ser centrifugados a 13,000 rpm por 15 min a 4 °C, se decantó el sobrenadante para agregar 1 mL de etanol absoluto y centrifugarse nuevamente a 13,000 rpm por 10 min a 4 °C; el alcohol fue decantado, la pastilla desecada a temperatura ambiente y resuspendida en 50 µL de agua de ampolleta. En ambos casos, la concentración y pureza del ADN fue cuantificada en un Nanodrop^® y su integridad corroborada mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%.

En el caso de las plantas se usaron los oligonucleótidos universales para begomovirus AV494 (5’-GCCYATRTAYAGRAAGCCMAG-3’)/AC1048 (5’-GGRTTDGARGCATGHGTACATG-3’) que amplifican un fragmento de ⁓550 pb de la cubierta proteica (^{Wyatt y Brown, 1996}).

Para determinar la especie de mosca blanca se realizó PCR con los oligonucleótidos LCO1490 y HCO2198 reportados por ^{Vrijenhoek (1994}) que amplifican una región de ⁓710 pb del gen mitocondrial de la subunidad I del citocromo C oxidasa (COI). Los fragmentos amplificados para begomovirus y COI fueron secuenciados y las secuencias obtenidas se compararon y registraron en la base de datos del GenBank^®. Adicionalmente, para conocer si las moscas blancas colectadas son portadoras de begomovirus, el ADN obtenido de estos insectos se analizó por PCR con los oligonucleótidos AV494/ AC1048. El producto amplificado se secuenció y comparó en la base datos del GenBank^®.

Se obtuvieron semillas de frutos maduros de plantas positivas a begomovirus así como de plantas asintomáticas que fueron negativas por PCR. Para ello se cortó el fruto por la mitad, se extrajeron las semillas y se colocaron en un colador para lavarlas bajo el chorro de agua de la llave. Posteriormente se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 10% por 3 min, se lavaron de cuatro a cinco veces con agua destilada y se secaron sobre papel absorbente estéril por 10 min.

Se extrajo ADN a partir de 10 semillas provenientes de plantas positivas y 10 negativas a begomovirus respectivamente, siguiendo el protocolo de ^{Dellaporta et al. (1983}). Posteriormente se analizaron por PCR con oligonucleótidos universales para begomovirus AV494/AC1048 (^{Wyatt y Brown, 1996}).

Por otro lado, se sembraron 50 semillas de frutos de plantas positivas a begomovirus en charolas germinadoras con suelo estéril; como testigo se sembraron 50 semillas de frutos obtenidos de plantas negativas. En ambos casos las charolas se mantuvieron en cámara de ambiente controlado a una temperatura promedio de 27 °C y un fotoperiodo de 16 h. Se colectaron hojas verdaderas a los 14, 21 y 28 días después de la siembra y se extrajo ADN (^{Dellaporta et al. , 1983}) para realizar PCR.

Los principales síntomas observados en las plantas colectadas fueron reducción del crecimiento y abarquillamiento además de mosaico y manchas cloróticas en algunos casos (Figuras 1A-1C), los cuales se han asociado a begomovirus. Previamente se detectó de manera esporádica plantas con mosaico distribuidas aleatoriamente en el invernadero, algunas fueron positivas a Impatiens necrotic spot virus, Tobacco mosaic virus o Pepino mosaic virus y negativas a Cucumber mosaic virus y Tomato spotted wilt virus así como un mayor número (~30%) de plantas con acortamiento de entrenudos y foliolos pequeños en la parte apical que resultaron positivas a Mexican papita viroid (datos no mostrados). La presencia de un alto porcentaje de plantas con una severa reducción del crecimiento y abarquillamiento sugirieron la presencia de un virus o viroide diferente de los analizados con anterioridad.

Figura 1 Síntomas en plantas de tomate asociados a begomovirus. A. Reducción severa del crecimiento y reducción de tamaño de hojas terminales. B. Abarquillamiento. C. Manchas cloróticas. D. Adulto de mosca blanca colectado en trampas Moëricke. E) Productos de PCR obtenidos con oligonucleótidos universales para begomovirus AV494/ AC1048 (~550 pb) en plantas de tomate recolectadas en invernadero. Carril 1: Control positivo (planta infecta da con Okra yellow mosaic Mexico virus); Carril 2: Control negativo (agua); Carril 3-4: Plantas con síntomas; Carriles 5-6: Plantas asintomáticas; Carril M: marcador de peso molecular 100 pb (Promega®). F) Productos de PCR obtenidos con oligonucleótidos LCO1490 y HCO2198 (~710 pb) a partir de ADN de mosca blanca. Carril 1: Control positivo (adulto de Bemisia tabaci); Carril 2: Control negativo (agua); Carriles 3-6: Adultos en trampas próximas a plantas con mosaico y abarquillamiento; Carril M: marcador de peso molecular 100 pb (Promega®). 

Los adultos colectados de mosca blanca en las trampas Moëricke fueron morfológicamente similares y se recuperaron prácticamente intactos (Figura 1D). Se tuvo amplificación del producto esperado para begomovirus en las plantas de tomate con los síntomas indicados (Figura 1E). Las secuencias de los productos obtenidos (No. acceso MK325267 y MK325268) tuvieron una identidad de 99% con el Tomato severe leaf curl virus (ToSLCV). En México, el ToSLCV fue reportado por vez primera en cultivos de tomate en Baja California Sur (^{Holguín et al., 2003}), posteriormente en los municipios de Rioverde, San Luis Potosí, y Xochitepec, Morelos. En tomate cultivado en invernadero sólo se ha reportado a los begomovirus Chino del tomate virus y Pepper Huasteco virus (actualmente Pepper huasteco yellow vein virus).

En el ADN de las moscas blancas analizadas se obtuvo con los oligonucleótidos del gen COI el fragmento esperado de ~710 pb (Figura 1F) y su secuencia tuvo una identidad de 99% con Bemisia tabaci (Números de acceso MK290856, MK290857, MK290858 y MK290859). B. tabaci es la principal especie vectora de begomovirus a nivel mundial y, por lo general, los síntomas de amarillamiento, enchinamiento y reducción del crecimiento aunados a la presencia de este insecto vector en cultivos de tomate se consideran como un indicativo de la infección por estos fitopatógenos.

En diferentes estudios se menciona que altas poblaciones de B. tabaci están asociadas con infecciones de distintas especies de begomovirus en cultivos de tomate en México, lo cual contrasta con lo observado en el presente estudio donde el número de moscas blancas fue bajo.

Así mismo, los individuos de mosca blanca amplificaron el fragmento esperado para begomovirus (~550 pb) (datos no mostrados) y su secuencia tuvo una identidad de 99% con ToSLCV (Números de acceso MK325269, MK325270 y MK325271). Esta correspondencia del virus detectado en tomate y mosca blanca se ha encontrado con el Tomato golden mottle virus.

En el análisis de PCR no se detectó al begomovirus en semilla de frutos de tomate obtenidos de plantas con síntomas, ni en plántula en las fechas de evaluación. Se sabe de begomovirus que no se transmiten por semilla del hospedante de interés agrícola pero sí lo hacen en maleza, como en el caso del Okra yellow mosaic Mexico virus que no se transmite por semilla de jamaica (Hibiscus sabdariffa L.) pero sí en semilla de Sida collina, S. acuta, S. haenkeana y Malacra fasciata (^{Ortega et al., 2019}). Estos resultados aunados a la detección del ToSLCV en mosca blanca y la alta incidencia de plantas con síntomas sugieren que la población de B. tabaci encontrada es eficiente en la transmisión del begomovirus.

Con base en los resultados obtenidos, se reporta por vez primera al Tomato severe leaf curl virus asociado a tomate en invernadero así como su presencia en Atlacomulco, Estado de México y su presencia en adultos de B. tabaci.