Relaciones filogenéticas de Octopus maya inferidas a partir de secuencias de ADNmt

 

Phylogenetic relationships of Octopus maya revealed by mtDNA sequences

 

OE Juárez, C Rosas, ML Arena-Ortiz*

 

Unidad Multidisciplinaria de Docencia e Investigación Sisal (UMDI-SISAL), Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México, Puerto de abrigo s/n, Sisal, Yucatán, CP 97135, México. * Corresponding author. E-mail: leticia.arena@ciencias.unam.mx

 

Received March 2011
Received in revised form February 2012
Accepted March 2012.

 

RESUMEN

Las relaciones filogenéticas entre las especies del género Octopus no han sido establecidas por completo. En este estudio se compararon las secuencias de tres genes mitocondriales (ARN ribosomal 16S, citocromo oxidasa I y citocromo oxidasa III) de Octopus maya, una especie endémica de la península de Yucatán, con las secuencias de genes homólogos de otros taxones del género Octopus, con el objetivo de elucidar el estatus filogenético de esta especie. Los árboles de máxima verosimilitud agrupan a O. maya con pulpos que habitan en el Pacífico oriental. Debido a que la distribución de O. maya se limita a la península de Yucatán en el Atlántico occidental y que las secuencias analizadas presentaron tasas evolutivas iguales en los taxones analizados, se propone que O. maya tuvo origen durante la formación del istmo de Panamá, cuando las cuencas del Pacífico y el Atlántico se separaron. Las distancias genéticas que presenta O. maya se encuentran en el intervalo de distancias que presentan las demás especies del género; por lo tanto, estas secuencias son caracteres que apoyan la inclusión de O. maya dentro del género Octopus.

Palabras clave: Octopus, filogenia, COI, COIII, ARNr 16S.

 

ABSTRACT

The phylogenic relationships among the Octopus species have not been fully established. We compared sequences for three mitochondrial genes (16S ribosomal RNA, cytochrome oxydase I, and cytochrome oxydase III) from Octopus maya, an endemic taxon of the Yucatan Peninsula, with homologous sequences from other taxa within the Octopus genus, with the aim of elucidating the phylogenetic relationships of this species. Maximum likelihood trees grouped O. maya with octopuses that inhabit the East Pacific. Considering that the distribution of O. maya is limited to the Yucatan peninsula in the West Atlantic and that the sequences analyzed show equal evolutionary rates across taxa, we propose that the divergence of O. maya possibly started during the formation of the Panama Isthmus, when the Pacific and Atlantic basins were split. The genetic distances that O. maya sequences show within the trees obtained are in the range of congeneric distances of other taxa in this genus so that these sequences are characters that support the inclusion of O. maya within the genus Octopus.

Key words: Octopus, phylogeny, COI, COIII, 16S rRNA.

 

INTRODUCCIÓN

A la fecha, aún no se han establecido completamente las relaciones filogenéticas entre las alrededor de 200 especies del género Octopus (Hochberg et al. 1992, en Barriga-Sosa et al. 1995), y menos de 50 del número total de especies identificadas se han descrito en detalle (Barriga-Sosa et al. 1995, Warnke et al. 2004). Un gran problema es que los pulpos presentan gran plasticidad fenotípica y carecen de estructuras duras, lo que dificulta su clasificación con métodos fenotípicos tradicionales (Pérez-Losada et al. 2002). Datos genéticos moleculares han contribuido a mejorar enormemente el conocimiento de las relaciones filogenéticas del género (Barriga-Sosa et al. 1995, Soller et al. 2000, Oosthuizen et al. 2004, Guzik et al. 2005).

Octopus maya, un pulpo bentónico con desarrollo directo, es endémico de la península de Yucatán (Solís et al. 1997) y objeto de mucha conjetura taxonómica. En un trabajo reciente en el que se utilizaron aloenzimas (30 loci), Pérez-Losada et al. (2002) documentaron que los genotipos de O. maya se agrupaban fuera del género Octopus. Además, sugieren que su origen es resultado de un evento de especiación que sucedió después de la formación del istmo de Panamá, que separó los océanos Atlántico y Pacífico, ya que O. mimus resultó ser su taxón más cercano. Sin embargo, el estudio de Pérez-Losada et al. (2002) sólo incluyó muestras de O. vulgaris, O. mimus y O. maya, y el papel de los efectos de selección de genotipos pudo haber potencialmente ocultado las verdaderas relaciones evolutivas. Es notable que O. maya no presenta una etapa larval, a diferencia de otras especies geográficamente cercanas como O. vulgaris y O. mimus que tienen estadios larvales y poslarvales (Warnke 1999). Esto podría apoyar la colocación de O. maya fuera del género Octopus. También surge la pregunta de si las diferencias en los rasgos de historia de vida reflejan las relaciones filogenéticas de estos pulpos. Para obtener conclusiones filogenéticas y taxonómicas robustas para O. maya se requieren comparaciones de tanto taxones adicionales como loci genéticos.

El objetivo del presente estudio fue combinar toda la información disponible sobre las secuencias de ARN ribosomal (ARNr) 16S, citocromo oxidasa I (COI) y citocromo oxidasa III (COIII) para las especies del género Octopus con datos nuevos para O. maya. Como resultado, este estudio es el primero en adoptar un enfoque global y en consecuencia proporcionar una idea potencialmente más completa de las relaciones evolutivas dentro del género Octopus, con especial atención a O. maya.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Extracción de ADN

Se capturaron especímenes de O. maya en la costa de Sisal (19°40.45'N, 90°43.00' W), Yucatán, México. El tejido se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C hasta utilizarse. Para la extracción del ADN genómico, se maceraron 20 mg del tejido muscular congelado en un amortiguador de extracción de ADN:Tris-HC1 100 mM (pH 8), EDTA 50 mM (pH 8), NaC1 500 mM, SDS 2% y β-mercaptoetanol 2%. Posteriormente, el macerado se incubó con proteinasa K (Promega) y RNAse (Promega). Para separar y precipitar el ADN se empleó una variación de la técnica de extracción con fenol:cloroformo (Lin et al. 2001).

 

Diseño de cebadores

Usando secuencias del genoma mitocondrial completo de O. vulgaris (código de acceso: AB158363; ARNr 16S, EF016336; COI, EF016328; y COIII, EF016319), se diseñaron los cebadores para las secuencias genómicas de COI, COIII y ARNr 16S con el software NetPrimer: http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html.

Los cebadores utilizados fueron los siguientes: CGAGTCTTCCGAAAGTTTCTT (hacia adelante) y TGCGATGAATATTCTCAACAAA (hacia atrás) para COI, CATCGAGGTCGCAATCTCTTTTT (hacia adelante) y AAGAGTTGGGCCTGCTCGGT (hacia atrás) para ARNr 16S, y CTACGTCTACAAAATGTCAGTATCA (hacia adelante) y ATTCAATGATGACGTGATATTATTC (hacia atrás) para COIII.

 

Secuenciación de ADN

Se realizaron reacciones en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) en un termociclador Bio-Rad iQ5, siguiendo lo propuesto por Guzik et al. (2005), modificando la temperatura de fusión hasta 55 °C y agregando una extensión final a 72 °C por 10 min. Se recuperaron y purificaron amplicones de un gel de agarosa con ayuda de columnas de purificación (Freeze 'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns) de Bio-Rad, siguiendo las especificaciones del fabricante. Los amplicones purificados se ligaron a los vectores de clonación pGEM-T Easy fabricados por Promega (No. Cat. A1360). El vector ligado se usó para transformar bacterias Escherichia coli DH5' mediante choque térmico (42 °C 50" a 4 °C 2') y se sembró en un medio selectivo. Después de seleccionar las colonias positivas para cada gen, se colocaron en tubos con medio | durante 12 h a 37 °C (250 rpm), extrayéndose los plásmidos clonados usando el método de alcalinización lento con recuperación a través de la matriz de sílice (Lakshmi et al. 1998). La presencia de insertos de ADN en los plásmidos (de cada gen en cada plásmido) se corroboró mediante digestión con enzimas de restricción EcoRI (Hedpeth et al. 1972). Los plásmidos con insertos de ADN fueron enviados al Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) en Cuernavaca, Morelos, para su secuenciación.

 

Análisis de datos

Todas las secuencias de COI, COIII y ARNr 16S disponibles para el género Octopus en GenBank, así como las obtenidas para O. maya fueron alineadas (cada gen por separado) usando el programa ClustalW en el software MEGA4 (Tamura et al. 2007). El alineamiento se usó como matriz de caracteres para construir los árboles filogenéticos. El análisis filogenético se realizó con PAUP v4.0b10 (Swofford 2003) mediante el método de máxima verosimilitud (MV). Se empleó ModelTest v3.06 (Posada y Crandall 1998) para determinar el modelo de evolución de ADN de mejor ajuste entre 56 diferentes modelos evolutivos posibles con el criterio de información de Akaike, que se usó para el análisis de MV.

El análisis de MV se realizó mediante búsquedas heurísticas, incluyendo huecos en el alineamiento de secuencias. La evaluación de confianza estadística en nodos se basó en 100 repeticiones bootstrap no paramétrico en el análisis de MV (Felsenstein 1985). En los árboles filogenéticos sólo se muestran los valores de apoyo bootstrap de 50% o más. Se resolvieron politomías en los árboles usando TreeEdit v1.0a10 (© 2001, Andrew Rambaut y Mike Charleston) y los árboles se editaron con MrEnt v2.1 (© 2005-2010, Alessandro Zuccon y Dario Zuccon).

Se construyeron árboles independientes para cada gen, así como para las secuencias concatenadas de los tres genes (para los taxones para los cuales existían tales datos; ver apéndice). Se usaron especies del género Opisthoteuthis como grupo externo (outgroup) y también se incluyó Enteroctopus dofleini (antes Octopus dofleini) para comparar las distancias genéticas dentro del género Octopus con respecto a otro género estrechamente relacionado.

La igualdad de tasas evolutivas entre las especies analizadas en cada árbol se comprobó usando Opisthoteuthis massyae como grupo externo en la prueba de tasas relativas de Tajima (1993) implementada en MEGA4. Se estimó el tiempo de divergencia para el árbol de los genes concatenados, y los valores P para la prueba chi-cuadrada de pares de secuencias se usaron en la construcción de ramas linearizadas (Takezaki et al. 2004). Para los valores P < 0.05, se rechazó la hipótesis nula de igualdad de tasas evolutivas entre taxones. Para la calibración del reloj molecular, se usó la tasa de mutación común para el ADN mitocondrial de 2% cada millón de años (Avise 2004) para identificar posibles influencias selectivas.

 

RESULTADOS

Para O. maya, se obtuvieron secuencias para 560 bases del gen COIII (número de acceso en GenBank: GU362546.1), 803 bases del gen COI (GenBank: GU362545.1) y 372 bases del gen ARNr 16S (GenBank: FJ751763).

Para todas las secuencias, el modelo GTR+I+G resultó ser el modelo de mutación más adecuado. En la tabla 1 se resumen las características de los análisis filogenéticos realizados. Debido a la disponibilidad respectiva de los datos de secuencia, hubo diferentes números de unidades taxonómicas operativas (UTO) en los árboles construidos para las diversas regiones de un gen.

El árbol del gen ARNr 16S presentó el mayor número de UTO (fig. 1). La secuencia de O. maya se agrupó con las secuencias obtenidas de pulpos que habitan en el Pacífico oriental. Los grupos filogenéticos coincidieron con la distribución geográfica de los taxones. Los más similares fueron aquellos más cercanos geográficamente, con excepción de O. marginatus.

El árbol del gen COI (fig. 2) indica que la secuencia de O. maya se relaciona con las secuencias de los pulpos del Pacífico oriental. Este árbol muestra que los taxones se dividen en dos clados principales. La congruencia biogeográfica de las agrupaciones del árbol de COI parece estar sesgada ya que hay sólo dos taxones (O. maya y O. joubini) que no corresponden a la cuenca del Pacífico. Resulta interesante que aunque ambos pulpos se encuentran en el Caribe y el golfo de México, no se agruparon en el árbol. Ambas especies están más estrechamente relacionadas con pulpos de diferentes clados principales.

El árbol del gen COIII (fig. 3) incluye un mayor número de especies del Pacífico oriental que los árboles de los genes ARNr 16S y COI, y claramente apoya la relación evolutiva entre O. maya y los pulpos del Pacífico oriental. También apoya la separación de los taxones en dos clados principales con una agrupación similar a la del árbol de COI. El árbol de COIII muestra grupos con una clara congruencia biogeográfica, como el clado monofilético compuesto de pulpos australianos así como americanos.

La tabla 2 muestra las distancias genéticas entre los taxones incluidos en el árbol de los genes concatenados, así como en la prueba de tasas relativas (Tajima 1993) para cada par de secuencias. Las especies O. californicus y E. dofleini muestran distancias genéticas muy cortas entre ellas (0.098) pero distancias largas con respecto a los demás taxones (22.6-28.3). Estos dos pulpos del Pacífico Norte presentan tasas evolutivas similares para los genes analizados, pero ambos muestran diferencias significativas con O. vulgaris (P = 0.02259 y 0.01669), por lo que se excluyeron del árbol linearizado, donde se estimó el tiempo de divergencia entre taxones.

La figura 4a muestra el árbol de los genes concatenados con una divergencia temprana del par O. californicus y E. dofleini en relación con los demás taxones. Los valores de apoyo bootstrap de este árbol son notablemente altos debido al mayor número de sitios informativos, por lo que es el árbol mejor respaldado.

La figura 4b muestra que la diversificación de los pulpos que presentan tasas evolutivas iguales para los tres genes sucedió hace 5 a 2.5 milliones de años.

 

DISCUSIÓN

Apoyo biogeográfico de los árboles y el origen de O. maya

Todos los árboles construidos muestran una amplia congruencia entre las agrupaciones y la distribución geográfica de los taxones, y la relación evolutiva entre O. maya y los pulpos del Pacífico oriental fue consistente durante todo el análisis.

El árbol del gen COI sugiere que procesos de especiación alopátrica han sucedido independientemente pero de la misma manera en las cuencas del Pacífico y Atlántico, como lo muestran las secuencias de O. maya y O. joubini. Ambas especies tienen una distribución geográfica y un desarrollo similar y sus secuencias también se relacionan con los pulpos del Pacífico, pero se agruparon en diferentes clados. Según el árbol de COI, las especies que tienen el mismo desarrollo no necesariamente están estrechamente relacionadas. La relación evolutiva entre las secuencias del Pacífico y el Atlántico, aun para distintos clados, sugiere que un solo incidente oceanográfico (posiblemente el levantamiento del istmo de Panamá) originó varios eventos de especiación dentro del género. El tiempo de divergencia estimado para las secuencias en el árbol de los genes concatenados (fig. 4b) fue hace entre 5 y 2.5 millones de años. Ese tiempo coincide con la formación del istmo de Panamá (Stanley 2005) y apoya la posibilidad de que este evento geológico inició un proceso de especiación de pulpos no sólo en el continente americano sino también en todo el mundo. El tiempo de divergencia obtenido también corresponde al estimado por Pérez-Losada et al. (2002). El árbol de COIII sugiere que O. maya comparte ascendencia con los pulpos californianos O. bimaculoides y O. bimaculatus, así como con los pulpos sudamericanos O. mimus, que se distribuye de Perú a Chile (Pérez-Losada et al. 2002), y O. oculifer, que es endémico de las islas Galápagos. El ancestro común de estas especies posiblemente tuvo un ciclo de vida con una fase larvaria, aunque tanto O. maya como O. bimaculoides presentan desarrollo directo. Se ha determinado que la presencia de etapas larvarias durante el ciclo de vida es el estado ancestral y no se presentan regresiones en las ramas de otras filogenias de pulpo (Guzik 2004). Nosotros proponemos que todos estos pulpos (O. maya, O. vulgaris, O. tetricus, O. bimaculoides, O. bimaculatus, O. mimus y O. oculifer) forman un grupo monofilético que se diversificó durante la formación del istmo de Panamá.

La topología obtenida del árbol filogenético del gen COIII es idéntica a la obtenido por Barriga-Sosa et al. (1995) en cuanto a los taxones comunes a ambos estudios. Los clados monofiléticos en la figura 3 que corresponden a los pulpos de Australia y el Pacífico occidental son muy similares e incluyen las mismas especies analizadas por Guzik et al. (2005), aunque en este último estudio se analizaron el gen citocromo b y un gen nuclear (factor de elongación-1a) junto con COIII.

 

Posibles implicaciones de los resultados en la sistemática y evolución de Octopus

La tabla 2 muestra que las distancias genéticas que presenta O. maya (11-19.9%) se encuentran en el intervalo de distancias que presentan las otras especies de Octopus analizadas, con excepción de O. californicus que presenta mayores distancias (24.1-27.6%). Estos resultados apoyan la inclusión de O. maya en el género Octopus. Esta conclusión difiere de la obtenida por Pérez-Losada et al. (2002), quienes sugirieron que las distancias genéticas de O. maya podrían colocarlo fuera del género Octopus. Por otro lado, proponemos que se debería de revisar el estatus actual de O. californicus ya que muestra distancias genéticas más cortas así como tasas evolutivas similares a E. dofleini.

Es necesario poner límites a la interpretación de la historia evolutiva real. Aunque los árboles basados en secuencias de ADN son herramientas muy útiles para comprender la evolución de un grupo dada la gran variabilidad fenotípica y un registro fósil limitado (Strugnell et al. 2005), primero es necesario secuenciar una gran cantidad de genes y genomas y generar la mayor cantidad de caracteres posible para resolver la filogenia.

 

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT, México, proyecto 24743) y UC MEXUS-CONACYT (CN 09-348). Agradecemos a G Lizama su apoyo técnico, así como a N McKeown su ayuda con el inglés y sus atinadas sugerencias durante el proceso de escritura.

Traducido al español por Christine Harris.

 

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