Ubicación del experimento

El estudio se llevó a cabo durante el 2019, en un invernadero del Colegio de Postgraduados campus Montecillo, ubicado en el municipio de Texcoco de Mora, Estado de México, localizado en las coordenadas 19° 27′ 51″ N, 98° 54′ 15″ O, a una altitud de 2250 metros.

Material biológico

Se utilizó semilla certificada de Brassica oleracea variedad Royal vantage, distribuida por la empresa SAKATA^® y adquiridas en el establecimiento Agroquímicos Texcoco, ubicado en el municipio de Texcoco, Estado de México.

Las especies bacterianas Azospirillum brasiliense (UAP151), Acinetobacter calcoaceticus (BUAP-35), Raoultella terrígena (KMT10-2) y Chromobacterium violaceum (BUAP-40), pertenecen a la Colección microbiana del Laboratorio de Microbiología de Suelos del Instituto de Ciencias, de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP). Para el experimento se establecieron dos consorcios bacterianos compuestos por dos especies cada uno. El primer consorcio estuvo conformado por las especies A. brasiliense + A. calcoaceticus (AA), mientras que el segundo por las especies R. terrígena + C. violaceum (RC).

Ensayo de emergencia de plántulas

Se seleccionaron al azar 300 semillas de col. Cien de estas semillas fueron colocadas en un recipiente estéril e inoculadas con 1 mL del consorcio AA a una concentración de 1 × 10⁹ células mL^-1. Cien semillas más fueron colocadas en otro recipiente estéril e inoculadas con 1 mL del consorcio RC a una concentración de 1 × 10⁹ células mL^-1. Las restantes 100, correspondieron a las semillas testigo, las cuales fueron colocadas en un recipiente estéril y tratadas solamente con 1 mL de agua destilada estéril. Los tres recipientes se mantuvieron sellados sobre una mesa de laboratorio a temperatura ambiente durante 12 h. Para la siembra se utilizaron seis semilleros de polietileno negro con 50 cavidades cada uno, que fueron llenadas con Peat Moss, previamente tratado con vapor caliente a 120 °C durante 3 h. Pasadas las 12 h, se procedió a la siembra de las semillas empleando un semillero para cada consorcio bacteriano (AA y RC) y otro para las semillas testigo. Los semilleros se colocaron en un sitio fresco y seco. Con la finalidad de favorecer la emergencia de las plántulas, las charolas fueron cubiertas con polietileno color negro. En esta prueba de emergencia de plántulas no hubo aplicación de solución nutritiva. Tres días después de la siembra se observaron las primeras plántulas emergidas, por lo que los semilleros se trasladaron al interior del invernadero dando inicio al conteo diario de las plántulas emergidas.

Sustrato, unidad experimental y trasplante

El sustrato consistió de una mezcla de vermiculita, agrolita y suelo proveniente de la comunidad Tequexquinahuac, del Municipio de Texcoco, estado de México, en una proporción 1:1:2 v/v/v, respectivamente. Los componentes de la mezcla fueron tratados con el nematicida Fluensulfone y con bactericida sulfato de cobre pentahidratado (con un contenido de cobre metálico de 4.96%) + cuaternario de amonio. La mezcla se realizó en un área cerrada, seca y fresca, sobre un plástico negro, previamente tratado con el bactericida utilizado en la mezcla de sustratos, con la ayuda de una pala nueva, esterilizada con hipoclorito de sodio al 5%. Una vez obtenida la mezcla, se procedió al llenado de bolsas de polietileno negro con capacidad de 5 L, mismas que fueron trasladadas al interior del invernadero. Cada una de las bolsas se colocó sobre un bancal elevado un metro del suelo, a una distancia de 40 cm entre cada una.

Después de 20 días de la siembra en semilleros, se seleccionaron al azar 24 plántulas del semillero inoculado con el consorcio AA. Las plántulas fueron re-inoculadas en su cepellón con 1 mL del mismo consorcio AA conteniendo 1 × 10⁹ células mL^-1 y finalmente trasplantadas a las bolsas de polietileno negro. La unidad experimental consistió en una bolsa de polietileno negro, con 5 L del sustrato mezcla indicado arriba, conteniendo una plántula de col. Del mismo modo, se eligieron 24 plántulas del semillero inoculado con el consorcio RC y se re-inocularon en su cepellón con 1 mL del consorcio RC conteniendo 1 × 10⁹ células mL^-1 y se trasplantaron en las bolsas de polietileno negro. Del semillero testigo, igualmente se seleccionaron 24 plantas que fueron trasplantadas sin inoculación bacteriana.

Solución nutritiva y riego

Para la preparación de la solución nutritiva y el riego, se utilizó agua potable disponible en el invernadero de experimentación, misma que fue analizada (Cuadro 1). A partir de la solución nutritiva de Steiner ^{(Steiner, 1961)}, preparada cada tres semanas en un contenedor negro de 200 L (Cuadro 2), se obtuvieron cada tercer día 18 L de solución nutritiva de cada una de las presiones osmóticas a evaluar (0.18, 0.36, y 0.54 atm). La aplicación de micronutrimentos se realizó con una mezcla comercial compuesta por hierro-EDTA (Fe) 7.5% p/p, manganeso-EDTA (Mn) 3.5% p/p, zinc-EDTA (Zn) 0.70% p/p, molibdeno (Mo) 0.30% p/p y cobre-EDTA (Cu) 0.28% p/p, con una estabilidad de pH 3 a 9. La presión osmótica se calculó obteniendo los milimoles que corresponderían al 25, 50 y 75% del contenido total de iones en la solución de Steiner. A partir de estas cantidades se utilizó la ecuación obtenida de ^{Baca-Castillo et al., 2016}, que indica cómo calcular la presión osmótica en una solución nutritiva.

Presión osmótica (atm) = 0.024 × milimoles (mM)

donde:

0.024 = factor para la determinación de la presión osmótica.

milimoles (mM) = valor del contenido de iones.

Los 18 L de cada solución nutritiva se aplicaron a las 18 plantas, según el tratamiento correspondiente, distribuyendo de manera manual 1 L por planta en dos horarios durante el día (8 a.m. y 5 p.m.). En cada solución se midió el pH y cuando fue necesario se ajustó a 5.5-6.5, añadiendo ácido sulfúrico (H₂SO₄). Las 18 plantas testigo fueron regadas en los mismos horarios con agua potable, cuya presión osmótica fue de 0.12 atm, calculada con la ecuación anteriormente descrita. En los días que no se aplicó solución nutritiva, las plantas de todos los tratamientos fueron regadas con agua potable.

Diseño experimental y tratamientos

El diseño experimental fue completamente al azar con un arreglo factorial 4 × 3 con 6 repeticiones por tratamiento. Los factores establecidos fueron cuatro niveles de presión osmótica (0.18, 0.36, 0.54 atm y sin solución nutritiva), en combinación con la inoculación con los consorcios bacterianos AA (Azospirillum brasiliense + Acinetobacter calcoaceticus) y RC (Raoultella terrígena + Chromobacterium violaceum) y un testigo sin inocular (Cuadro 3). Que resulto en 72 unidades experimentales.

Variables evaluadas

Porcentaje y tasa de emergencia

El porcentaje de emergencia se obtuvo examinando las charolas de germinación al final del estudio (15 días) (^{Murillo-Amador et al., 2000}). La emergencia de plántulas se contabilizó diariamente durante 15 días. La tasa de emergencia y el porcentaje se evaluaron mediante la observación de la emergencia de la plántula (visibilidad de la plántula fuera del sustrato). La tasa de emergencia se calculó de acuerdo con Maguire (1962) con la ecuación:

donde:

n1, n2, … n100 representan el número de semillas emergidas en el tiempo t1, t2, … t15 (en días).

Parámetros de crecimiento vegetal y estado nutrimental en extracto de peciolo

Desde el establecimiento de las unidades experimentales, cada 15 días y hasta el momento de cosecha, se midieron la longitud de las plantas y el diámetro de tallo (mm) con un calibrador vernier digital STEREN^®.

En el momento de la cosecha, se obtuvo el peso fresco del vástago con una balanza digital (marca OHAUS^® modelo TP4KS (Florham Park, New Jersey, Estados Unidos). El estado nutrimental se evaluó determinando la concentración de nitratos, fósforo y potasio en el extracto del peciolo en 10 hojas maduras a las cuales se les retiró el peciolo. Para su selección, se contaron tres hojas desde la base del tallo hacia arriba, y a partir de esta zona, se tomaron 10 hojas al azar cubriendo los cuatro puntos cardinales de la planta. La concentración de fósforo (P) se obtuvo con un fotómetro de análisis nutrimental marca HANNA^® Instruments modelo HI 83225 (Padua, Italia). Las concentraciones de nitratos y potasio (K) se midieron con ionómetros HORIBA^® modelo LAQUATWIN (Kyoto, Japón).

Las plantas cosechadas se depositaron en bolsas de papel y fueron colocadas en una estufa de secado Nabertherm^® TR 300 °C a una temperatura de 72 °C durante 72 h. Transcurridas las 72 h, las muestras se pesaron separando la parte del vástago y la cabeza de la col, obteniendo así el peso de biomasa seca.

Evaluación de las cabezas de la col

Se determinó el peso fresco de las cabezas de la col con una balanza digital marca OHAUS^® modelo TP4KS (Florham Park, New Jersey, Estados Unidos). Se midió el diámetro ecuatorial de las mismas con un calibrador vernier digital STEREN^®. A partir de estos datos, se construyó una escala de tamaño de cabeza, con la que se clasificaron las cabezas de las plantas obtenidas en cada uno de los tratamientos evaluados.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos a partir de las variables evaluadas fueron sometidos a un análisis de varianza y prueba de comparación de medias (Tukey ( = 0.05) empleando el programa SAS versión 9.4 (^{SAS Institute, 2013}).

Emergencia de plántulas

Las semillas de B. oleracea var. Royal vantage inoculadas con el consorcio AA, presentaron 100% de emergencia y la tasa de emergencia más alta de 20.5, en comparación al consorcio RC, cuyos valores fueron 95% y 17.6, respectivamente (Figura 1).

Figura 1: Porcentaje y tasa de emergencia de plántulas de Brassica oleracea var. Royal vantage 15 días después de la inoculación con los consorcios AA (Azospirillum brasilense+Acinetobacter calcoaceticus), RC (Raoultella terrigena+ Chromobacterium violaceum) y sin inoculación bacteriana (SB).  

Figure 1: Percentage and emergence rate of Brassica oleracea var. Royal vantage 15 days after inoculation with AA (Azospirillum brasilense + Acinetobacter calcoaceticus), RC (Raoultella terrigena + Chromobacterium violaceum) consortia and without bacterial inoculation (SB). 

Los resultados de esta investigación concuerdan con los reportados por ^{Roy Chowdhury et al. (2016)}, quienes al comparar el porcentaje de emergencia en semillas de acelga (Spinacia oleracea L.) inoculadas y no inoculadas con BPCV, encontraron que la inoculación con BPCV promovió el mayor porcentaje de emergencia. ^{Martínez-Reyes et al. (2018)}, al evaluar el porcentaje de emergencia de plántulas de maíz (Zea mays L.), inoculadas por separado con Azospirillum brasiliense y Chromobacterium violaceum y fertilizadas con N, P y K (80-23-15 y 160-46-30), no encontraron diferencia estadística significativa, sin embargo, igual que en el presente estudio, los tratamientos con Azospirillum brasiliense y Chromobacterium violaceum promovieron los mayores porcentajes de emergencia. En el mismo sentido, ^{Marquina et al. (2018)} demostraron que la inoculación con Azospirillum spp. incrementó entre 13 y 23% la germinación y emergencia en plántulas de pimiento.

La cepa Azospirillum brasiliense es conocida como “bacteria promotora de emergencia”, por ser una especie que estimula eficientemente la emergencia de las plántulas (^{Widnyana y Javandira, 2016}). Por otro lado, Raoultella terrígena, es una BPCV que promueve el crecimiento de las plantas a través de la fijación biológica del nitrógeno (^{Carcaño-Montiel et al., 2006}), la producción de 1-aminociclopropano-1-carboxilato desaminasa, y la síntesis de los reguladores del crecimiento ácido indol-3-acético y ácido giberélico (^{Singh et al., 2015}). Sin embargo, el consorcio RC, en el que participó, fue menos eficiente que el consorcio AA.

El consorcio AA estimulo exitosamente la emergencia de semillas de col. El uso de consorcios bacterianos ha sido empleado en la estimulación de la emergencia de otras especies vegetales. Por ejemplo, ^{Sánchez-Mendoza et al. (2018)}, analizaron el efecto de los consorcios Enterobacter sp. + Pseudomonas sp., Bacillus sp. + Pseudomonas sp., Acinetobacter sp. + Pseudomonas sp., Pseudomonas putida y un control (agua destilada) sobre la emergencia y crecimiento de cuatro especies de agave silvestre: tobalá (Agave potatorum Zucc.), cuishe (Agave spp.), sierrudo (Agave spp.) y coyote (Agave spp.). Todos los consorcios inoculados incrementaron el porcentaje y la velocidad de emergencia, así como el crecimiento en todas las especies evaluadas, mostrando los mejores resultados el consorcio Acinetobacter sp.+ Pseudomonas sp. En el presente estudio, la especie empleada de Acinetobacter, como parte del consorcio AA, estimuló eficientemente el porcentaje y la tasa de emergencia de las plántulas de col (Figura 1).

Parámetros de crecimiento vegetal

La mayor altura de la planta se registró en los tratamientos donde se inoculó el consorcio AA a presiones osmóticas de 0.36 y 0.54 atm. En las evaluaciones a los 25, 39, 53, 68 y 81 días después del trasplante, no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos AA/0.36 y AA/0.54.

El consorcio AA a presión osmótica de 0.54 atm produjo plantas más altas (60-65%) (Figura 2) y tallos con mayor diámetro (35-46%) (Figura 3), en comparación con las plantas no inoculadas y sin aplicación de solución nutritiva. El consorcio RC, a presión osmótica de 0.54 atm, incrementó la altura de la planta en un 50-60% y el diámetro del tallo entre 25-30%, en comparación con el control absoluto. Tanto las plantas inoculadas con el consorcio RC, como las plantas sin inoculación bacteriana, no presentaron diferencias significativas, en cuanto al diámetro del tallo a presión osmótica de 0.54 atm.

Figura 2: Altura de las plantas de Brassica oleracea var. Royal vantage inoculadas con los consorcios bacterianos AA (Azospirillum brasilense + Acinetobacter calcoaceticus), RC (Raoultella terrígena + Chromobacterium violaceum) y sin inoculación bacteriana (SB), crecidas bajo diferentes niveles de presión osmótica (0.18, 0.36, 0.54 atm y testigo). La altura se determinó a los 25 (A), 39 (B), 53 (C), 67 (D) y 81 (E) días después del trasplante. Medias ± error estándar. Letras distintas en cada gráfica indican diferencias significativas (Tukey α ≤ 0.05).  

Figure 2: Height of Brassica oleracea var. Royal vantage inoculated with bacterial consortia AA (Azospirillum brasilense + Acinetobacter calcoaceticus), RC (Raoultella terrígena + Chromobacterium violaceum) and without bacterial inoculation (SB), grown under different levels of osmotic pressure (0.18, 0.36, 0.54 atm and control). Height was determined 25 (A), 39 (B), 53 (C), 67 (D) and 81 (E) days after transplantation. Means ± standard error. Different letters in each graph indicate significant differences (Tukey α ≤ 0.05 

Figura 3: Diámetro de tallo de plantas de Brassica oleracea var. Royal vantage inoculadas con los consorcios bacterianos AA (Azospirillum brasilense + Acinetobacter calcoaceticus), RC (Raoultella terrígena + Chromobacterium violaceum) y sin inoculación bacteriana (SB), crecidas bajo diferentes niveles de presión osmótica (0.18, 0.36, 0.54 atm y testigo). La altura se determinó a los 25 (A), 39 (B), 53 (C), 67 (D) y 81 (E) días después del trasplante. Medias ± error estándar. Letras distintas en cada gráfica indican diferencias significativas (Tukey α ≤ 0.05).  

Figure 3: Stem diameter of Brassica oleracea var. Royal vantage inoculated with bacterial consortia AA (Azospirillum brasilense + Acinetobacter calcoaceticus), RC (Raoultella terrígena + Chromobacterium violaceum) and without bacterial inoculation (SB), grown under different levels of osmotic pressure (0.18, 0.36, 0.54 atm and control). Height was determined 25 (A), 39 (B), 53 (C), 67 (D) and 81 (E) days after transplantation. Means ± standard error. Different letters in each graph indicate significant differences (Tukey α ≤ 0.05). 

Los resultados de esta investigación coinciden con lo reportado por ^{Devi et al. (2018)}, quienes reportaron que la biofertilización con BPCV combinada con fertilización química moderada en plantas de coliflor (Brassica oleracea var. botrytis) promovieron una mayor altura de tallo. De igual manera, ^{Yildirim et al. (2016)} reportaron que la inoculación con BPCV y la fertilización nitrogenada de 160 kg N ha^-1, mejoraron el crecimiento de plantas de col blanca (Brassica oleracea var. capitana L.). La aplicación de una dosis menor de N (120 kg N ha^-1) y la inoculación bacteriana, también mostraron efectos significativos en la altura y diámetro del tallo de las plantas, contrario a los resultados del control no inoculado.

El mayor peso fresco y peso seco del vástago a los 81 días después del trasplante, fue inducido por el consorcio AA, que fue significativamente diferente al peso seco y peso fresco promovidos por el consorcio RC y el Testigo (Figura 4A y 4D).

La producción de biomasa fresca y seca (Figuras 4B y 4E) fue favorecida cuando las plantas crecieron a presiones osmóticas de 0.54, 0.36 y 0.18 atm. La mayor acumulación de materia fresca se observó cuando se inoculó el consorcio AA a las presiones osmóticas de 0.18, 0.36 y 0.54 atm (Figura 4C). Por otra parte, la mayor acumulación de materia seca se observó con el consorcio AA a la presión osmótica de 0.54 atm (Figura 4F).

Figura 4: Biomasa fresca (A, B, C) y peso seco del vástago (D, E, F) de Brassica oleracea var. Royal vantage desarrolladas bajo cuatro niveles de presión osmótica (0.18, 0.36 y 0.54 atm y Testigo) y biofertilizadas con los consorcios AA (Azospirillum brasilense + Acinetobacter calcoaceticus), RC (Raoultella terrígena + Chromobacterium violaceum) y SB (sin inoculación bacteriana), evaluados a los 81 días después del trasplante. Medias ± error estándar. Letras distintas en cada gráfica indican diferencias significativas (Tukey α ≤ 0.05).  

Figure 4: Fresh biomass (A, B, C) and stem dry weight (D, E, F) of Brassica oleracea var. Royal vantage developed under four levels of osmotic pressure (0.18, 0.36 and 0.54 atm and Control) and biofertilized with consortia AA (Azospirillum brasilense + Acinetobacter calcoaceticus), RC (Raoultella terrígena + Chromobacterium violaceum) and SB (without bacterial inoculation), evaluated 81 days after transplantation. Means ± standard error. Different letters in each graph indicate significant differences (Tukey α ≤ 0.05). 

^{Sánchez-López et al. (2014)}, reportaron que la inoculación de Pseudomonas sp. en plantas de lechuga (Lactuca sativa cultivar White Boston), incrementó de manera significativa (P < 0.05) la biomasa y el desarrollo de las plantas. Igualmente, ^{Rodríguez-Palacio et al. (2019)}, determinaron que la inoculación con cepas de Enterobacter spp. y Raoultella sp. provocó un aumento de 2.7-129.7% en la producción de biomasa seca en plantas de maíz.

Reguladores del crecimiento como el ácido 3-indol acético sintetizadas por las BPCV, favorecen la división celular en la raíz, la elongación, diferenciación celular y el incremento del área de la raíz mediante la formación de raíces adventicias (^{Ortíz-Castro et al., 2009}). En este sentido, Azospirillum brasiliense y Acinetobacter calcoaceticus pudieron sintetizar reguladores del crecimiento, que promovieron el crecimiento, desarrollo y producción de la col.

Clasificación de las cabezas de la col

Los resultados del peso fresco total y diámetro ecuatorial de las cabezas de la col permitieron desarrollar una clasificación con 5 niveles (Cuadro 4). Los promedios de peso fresco total, diámetro ecuatorial, así como la clasificación de las cabezas de la col resultado de los diferentes tratamientos se muestran en el Cuadro 5.

El diámetro ecuatorial y peso fresco de las cabezas exhibieron diferencias estadísticas significativas (Cuadro 4). La inoculación con los consorcios AA y RC, a presión osmótica de 0.54 atm, indujo el mayor desarrollo de las cabezas de la col (clasificadas como 5 y 4, respectivamente).

Efectos en el estado nutrimental en extracto de peciolo

La evaluación nutrimental en peciolo indicó que a pesar de que en K no hubo diferencia estadística significativa (Tukey α ≤ 0.05), entre la inoculación con la AA y la inoculación con la cepa RC, si se muestran diferencias significativas al comparar la inoculación bacteriana con el control sin inoculación (SB). Las plantas de B. oleracea var. Royal vantage inoculadas con el consorcio AA mostraron entre 20‑35% más contenido de K con respecto a las plantas no inoculadas. El consorcio RC, generó un aumento en el contenido de K entre 25-45%, con relación al control sin inocular (SB). El análisis de nitratos mostró diferencias significativas entre la inoculación con la cepa AA y la cepa RC y a su vez, estas presentaron diferencias significativas en comparación con el control sin inocular (SB).

Las plantas inoculadas con el consorcio AA presentaron una concentración de nitratos 200-350% mayor, con respecto a las plantas no inoculadas. Por su parte, la aplicación del consorcio RC mostró un incremento de 60-230% en la concentración de nitratos, con relación al testigo absoluto. En la evaluación de la concentración de fósforo se encontraron diferencias significativas entre las plantas inoculadas con los consorcios bacterianos (AA y RC) y el control sin inoculación bacteriana (SB). Con el consorcio AA el contenido de P en las plantas de col se incrementó entre un 200 y un 500%, mientras que el consorcio RC alcanzó un aumento de 100-400% de P, ambos con respecto al contenido de P de las plantas no inoculadas (Figura 4).

^{Angulo et al. (2014)}, concluyeron que los principales efectos de las BPCV de los géneros Azospirillum, Azotobacter, Klebsiella, Beijerinckia, Pseudomonas y Bacillus, sobre gramíneas están asociados con mayor emergencia y mejor desarrollo de la raíz; debido a la absorción de NO₃ ^-, NH₄ ⁺, PO₄ ^-3, K⁺ y Fe⁺², así como otros nutrientes, lo cual incrementa la acumulación de minerales en hojas y tallos. Los datos obtenidos por ^{Yildirim et al. (2016)} señalan que la inoculación de plántulas de col blanca con la cepa Paenibacillus polymyxa RC14 promovió el contenido de todos los elementos macro y micronutrientes, con relación con el control. ^{Kuan et al. (2016)} estudiaron el efecto de las cepas Klebsiella sp., Klebsiella pneumoniae, Bacillus pumilus, Acinetobacter sp. y Bacillus subtilis en la fijación de N en plantas de maíz. Los resultados indican un incremento en el contenido total de N con la inoculación bacteriana, en comparación con las plantas no inoculadas (Figura 5).

Figura 5: Concentración de nitratos (A, B, C), fósforo (D, E, F) y potasio (G, H, I), en el extracto de savia peciolar de plantas de Brassica oleracea var. Royal vantage, desarrolladas bajo cuatro niveles de presión osmótica (0, 0.18, 0.36 y 0.54 atm) y biofertilizadas con los consorcios AA (Azospirillum brasilense + Acinetobacter calcoaceticus) y RC (Raoultella terrígena + Chromobacterium violaceum), SB (sin inoculación bacteriana), evaluado a los 81 días después del trasplante. Medias ± error estándar. Letras distintas en cada gráfica indican diferencias significativas (Tukey α ≤ 0.05).  

Figure 5: Concentration of nitrates (A, B, C), phosphorus (D, E, F) and potassium (G, H, I), in the petiolar sap extract of Brassica oleracea var. Royal vantage, developed under four levels of osmotic pressure (0, 0.18, 0.36 and 0.54 atm) and biofertilized with the AA (Azospirillum brasilense + Acinetobacter calcoaceticus) and RC (Raoultella terrígena + Chromobacterium violaceum) consortia, SB (without bacterial inoculation), evaluated 81 days after transplantation. Means ± standard error. Different letters in each graph indicate significant differences (Tukey α ≤ 0.05).