Ubicación

El trabajo de investigación se desarrolló en el Laboratorio de Biotecnología NOA en la ciudad de Torreón, Coahuila y en el Laboratorio Nacional de Agua, Suelo y Planta del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) de Gómez Palacio, Durango.

Material vegetal

Las semillas de la especie D. cedrosanum utilizadas en esta investigación fueron proporcionadas por la Unidad de Manejo para la Conservación de la Vida Silvestre del Museo del Desierto ubicado en la ciudad de Saltillo, Coahuila.

Elaboración del extracto de vermicompost

La elaboración del extracto de vermicompost (EV) consistió en dos etapas, primero se obtuvo el humus y después se preparó el EV. Para la obtención del humus se construyó un cajón de madera de 1 m de largo, 0.50 m de ancho y 0.50 m de profundidad, el cual se cubrió con geomembrana de polietileno, se instaló un tubo de PVC de 1 m de largo y 1 pulgada de diámetro para actuar como dren en la parte inferior del cajón. Se aplicaron 200 kg de estiércol seco de bovino en el cajón, posteriormente se agregó agua corriente hasta obtener un 70±5% de humedad, los riegos se suministraron diariamente para mantener el porcentaje de humedad, enseguida se agregaron 3.50 kg de lombriz roja californiana (Eisenia fetida) y se mezclaron con el estiércol, se dejaron durante 75 días, al final de este tiempo se obtuvo el humus de lombriz (material solido dentro del cajón). La preparación del EV fue realizada de acuerdo a indicaciones de ^{Ochoa et al. (2009)} y consistió en la utilización de 2 kg de humus, se emplearon cinco filtros de tela de manta en los cuales se introdujeron 400 g del humus; los filtros cerrados y amarrados se colocaron en un bidón con 10 L de agua destilada, se agregaron 20 g de azúcar (sacarosa) cada 72 h. Para la oxigenación se colocó una bomba de aire (Aqua Jet^®, México) la cual se conectó a los bidones para introducir aire y generar oxigenación con el fin de activar bacterias; este proceso se mantuvo durante 21 días. El líquido obtenido se pasó por papel filtro y se depositó en botellas de plástico con capacidad 1 L las cuales se mantuvieron en refrigeración dentro de laboratorio hasta el momento de su uso.

Análisis de las propiedades químicas de vermicompost (EV)

Para este análisis se usaron dos muestras de EV, una sin esterilizar y otra esterilizada. Esto se realizó para comparar si las propiedades químicas varían con la esterilización que se realiza al preparar medio basal. La muestra esterilizada se trató mediante la técnica de calor húmedo (autoclave) durante 30 min a 115 °C y 1 atm de presión según las indicaciones metodológicas de ^{Pérez-Uz, de Silóniz, Torralba y Vázquez (2010}). Después se tomó 1 mL de cada muestra y se sometieron a digestión húmeda con ácido nítrico (HNO₃) y acido perclórico (HClO₄) en una relación 2:1 hasta la desaparición total de la materia orgánica sobre un plato a una temperatura de 120 °C. Las muestras se filtraron y aforaron a 50 mL con agua destilada. El análisis de los componentes se realizó por espectroscopia de absorción atómica (Perkin Elmer Aanalyst 700^®, U.S.A.). El pH y conductividad eléctrica se determinaron por medio de un medidor tipo mesa (Ohaus^®, U.S.A.) directamente en el líquido del extracto de vermicompost.

Etapa de establecimiento

En esta etapa se utilizaron 300 semillas, las cuales primero fueron separadas de sus brácteas. Para el proceso de asepsia, la semilla se colocó en un frasco de vidrio con agua corriente, 0.25 mL de jabón líquido neutro (Fag Lab^®, México) y en agitación magnética por 5 min, posteriormente se pasaron a una solución con fungicida (Captan^®, México) 2 g L^-1 y en agitación magnética durante 5 min. Entre cada proceso se realizó un enjuague con abundante agua corriente. Dentro de una campana de flujo laminar (ESCO^®, Singapur), se sumergieron las semillas en una solución de alcohol al 70% durante 3 min y posteriormente se enjuagaron con agua destilada. Se introdujeron en una solución de ácido clorhídrico (HCl) al 10% durante 10 min y se enjuagaron con agua destilada estéril. Para la siembra se colocaron cinco semillas por frasco en un medio de cultivo MS para un total de 60 frascos, estos se trasladaron a una cámara de crecimiento con ambiente controlado y climatización artificial a una temperatura de 26±2 °C y 80% de luz solar natural durante 30 días.

Etapa de multiplicación

Las plántulas obtenidas del establecimiento de semillas se utilizaron como fuente de explantes secundarios. Dentro de la campana de flujo laminar se eliminaron las raíces y una porción de sus hojas dejando plántulas de 2.0 cm. Para esta etapa se establecieron siete tratamientos con 10 repeticiones; el tratamiento T1 fue el testigo que corresponde al medio MS, los tratamientos T2, T3, T4, T5, T6 y T7 consistieron en diferentes concentraciones de EV sin esterilizar (30, 25, 20, 15, 10 y 5 mL L^-1) respectivamente diluidos con agua destilada, en esta etapa se adicionó a los tratamientos 1 mg L^-1 de bencilaminopurina (BAP) y 0.20 mg L^-1 de ácido indolacético (AIA) para promover la formación de brotes (^{Villavicencio, Cano y Juárez, 2007}), el pH de los tratamientos fue ajustado a 5.70±0.10 utilizando hidróxido de sodio (NaOH) y ácido clorhídrico (HCl) al 2%, como agente gelificante se utilizó agar bacteriológico. En frascos de vidrio con tapa de aluminio y capacidad de 118 mL, se vertieron 30 mL de cada tratamiento para posteriormente esterilizarlos en autoclave. Se colocaron dos explantes por frasco, estos se introdujeron en la cámara de incubación descrita anteriormente y el medio de cultivo se renovó cada cuatro semanas durante 12 semanas, finalizado este tiempo se realizó la evaluación de los brotes obtenidos.

Etapa de enraizamiento

Los brotes obtenidos de la etapa de multiplicación se trasvasaron a frascos con medio de cultivo de su respectivo tratamiento para iniciar el proceso de enraizamiento. En esta etapa se utilizaron los mismos tratamientos y repeticiones que en la etapa de multiplicación, pero únicamente se agregó a cada tratamiento 0.20 mg L^-1 de AIA para promover la formación de raíz (^{Villavicencio et al., 2007}). Se colocaron en la cámara de incubación durante 45 días para posteriormente evaluar la cantidad y características morfométricas de las raíces obtenidas.

Análisis de imagen

La toma de datos y medición de las variables morfométricas se realizó por medio de imágenes obtenidas mediante una cámara digital (Olympus^®, U.S.A.) con sensor óptico CCD de 4.10 megapíxeles. Se colocó papel milimétrico sobre la base de digitalización bajo la lente del microscopio para usarlo como guía de medición y tomarla de referencia para la calibración del software. Todas las imágenes se capturaron a la misma distancia para obtener un igual número de pixeles y área del papel milimétrico con el objetivo de utilizar la misma calibración, las fotografías fueron capturadas a completa oscuridad (^{González-Cervantes, Villanueva, Orona y Sánchez, 2005}; ^{Chávez-Simental, González, Arreola, Ortiz y Loera, 2016}). El tratamiento de las imágenes se realizó con el software analizador (Image ProPlus^® versión 4.5, U.S.A.).

Análisis estadístico

El experimento se realizó bajo un diseño completamente al azar con una prueba de comparación de medias de Tukey ≤ 0.05 para detectar diferencias estadísticas entre tratamientos utilizando el paquete estadístico SAS versión 9.0.

Propiedades químicas del extracto de vermicompost (EV)

Los extractos y lixiviados de vermicompost se pueden usar como promotores orgánicos de crecimiento vegetal (^{Calero, Quintero, Pérez, González y González, 2019}), en el análisis de las muestras de EV de este trabajo se encontraron macro y micro nutrientes esenciales que estimulan el desarrollo de las plantas.

El proceso de esterilización afectó ocho propiedades químicas (Cuadro 1), presentando una ligera disminución en la concentración de compuestos, nitrógeno total, nitrógeno nítrico (N-NO₃), hierro (Fe), cobre (Cu), boro (B), azufre (S), ácidos húmicos y fúlvicos. Sin embargo, algunas propiedades presentaron un incremento con respecto a la muestra sin esterilizar entre ellas calcio (Ca), magnesio (Mg), potasio (K), fósforo (P), nitrógeno amoniacal (N‑NH₄), zinc (Zn), manganeso (Mg) y carbón orgánico. Las variables que se mantuvieron estables fueron sodio (Na), pH, conductividad eléctrica (CE) y materia orgánica (MO).

Las propiedades químicas del EV esterilizado y sin esterilizar indicaron una variación sensiblemente homogénea en ambas muestras, sin embargo, se eliminaron patógenos que ocasionan contaminación en planta in vitro. Los resultados obtenidos concuerdan con los reportados por ^{González-Solano, Rodríguez, Trejo, Sánchez y García (2013)}, quienes indican que el EV a base de estiércol bovino registra alto contenido de nutrientes, pH y CE. El EV utilizado en el presente trabajo registro concentraciones de ácidos fúlvicos y húmicos los cuales son bioestimulantes orgánicos que promueven el crecimiento, mejoran la respuesta al estrés, regulan la actividad celular y tienen acción en los cambios metabólicos y hormonales en las especies vegetales (^{Veobides-Amador, Guridi y Vázquez, 2018}). La utilización de material orgánico a base de estiércol es una alternativa de bajo costo para satisfacer la demanda nutrimental de las plantas y sustituir el uso de productos inorgánicos (^{González et al., 2013}).

Etapa de multiplicación

El número de brotes por explante producidos después de 12 semanas de D. cedrosanum, presentaron diferencia significativa (P ≤ 0.05). El T1 presentó mayor número de brotes por explante con una media de 8.25 (Cuadro 2), este tratamiento a base de medio MS generó mayor número de brotes que los reportados por ^{Villavicencio et al. (2007)}, quienes indicaron que obtuvieron 7 brotes por explante en plantas de D. cedrosanum Trel utilizando medio MS y la misma concentración hormonal que el presente trabajo. La menor cantidad se presentó en el T7 con 1.50, de los tratamientos a base de EV el que mostró la producción de brotes más alta fue el T3 con 3 por explante. Nuestros resultados en medio MS y medio a base de EV resultan por debajo a los reportados por ^{Reyes-Silva, Morales, Pérez y Pérez (2013)}, quienes lograron obtener 10.30 brotes por explante en especies del género Dasylirion en medio MS. Diversos autores (^{Moya et al., 2013}; ^{Prakash, Sharumathy, Swetha, Nandagopal y Narendrakumar, 2015}) mencionan que al incorporar sustancias orgánicas que contengan ácidos húmicos como es el caso del EV, aunado a un adecuado balance hormonal dan como resultado la obtención de brotes de plantas a bajo costo.

Por otro lado, en las variables número de hojas y largo de hojas se mostraron diferencias significativas (P ≤ 0.05). El T1 y T3 presentaron el mayor número de hojas con una media de 4.75 y 4.50 respectivamente. El tratamiento T7 presentó diferencia estadística al resto de los tratamientos, registrando el menor número de hojas con 2.75 por brote (Cuadro 2). ^{Villavicencio et al. (2007)}, reportan entre 4 y 6 hojas obtenidas en los brotes, afirmando que para asegurar la supervivencia de los brotes deben contar al menos con 3 hojas, lo cual concuerda con el número de hojas por brote obtenidos en este trabajo en los tratamientos del T1 al T6. En cuanto a la longitud de las hojas, el T1 obtuvo hojas largas con 6.09 cm al igual que el T3 con 5.10 cm sin mostrar diferencia estadística, hojas con menor longitud se presentaron en los T2, T4, T5, T6 y T7 con 4.24, 3.53, 3.62, 3.67 y 3.59 cm respectivamente.

Respecto a ancho de hoja, los tratamientos mostraron diferencia significativa (P ≤ 0.05), en el T1 se observaron hojas más anchas, 1.41 mm, mientras que el T5 presento hojas más angostas 1.07 mm. El ancho de las hojas fue muy similar en el medio MS y en los medios con altas concentraciones de EV. Dependiendo de las dimensiones de las hojas se pueden afectar funciones fisiológicas en las plantas, entre mayor sea la producción y tamaño de hojas se verá beneficiada la actividad fotosintética, respiratoria y bioaclimatación (^{Barraza, Fischer y Cardona, 2004}).

Se lograron obtener brotes en todos los tratamientos a base de EV, sin embargo, sus características y cantidad resultó menor que los obtenidos en el medio MS, de los brotes producidos en tratamientos a base de EV el T3 fue donde se obtuvo la mayor cantidad y mejores características (Figura 1).

Figura 1: a) Efecto del T1 en una plántula de D. cedrosanum en etapa de multiplicación. b) brotes generados en el T1. c) efecto del T3 en una plántula de D. cedrosanum en etapa de multiplicación. d) brotes generados en el T3. Barra = 1 cm. 

Figure 1: a) Effect of T1 on a seedling of D. cedrosanum in the multiplication stage. b) shoots generated in T1. c) effect of T3 on a seedling of D. cedrosanum in the multiplication stage. d) shoots generated in T3. Bar = 1 cm. 

Etapa de enraizamiento

El número de raíces formadas en los brotes de D. cedrosanum después de 45 días en la cámara de incubación no mostró diferencia significativa entre tratamientos (P ≥ 0.05). Según ^{Villavicencio et al. (2007)}, obtuvieron entre 1 y 3.50 raíces por brote en plantas producidas en medio MS, los resultados en este trabajo de investigación se encuentran dentro de este parámetro ya que oscilaron entre 1 y 1.50 raíces por brote.

En cuanto a las variables longitud y ancho de raíz se registraron diferencias significativas (P ≤ 0.05), en longitud de raíz en los T1 y T6, con 6.53 y 5.99 cm respectivamente, se presentaron las raíces más largas sin diferencia estadística entre tratamientos, las raíces con menor longitud se presentaron en el resto de los tratamientos oscilando valores entre 1.21 y 1.65 cm. Por otro lado, en el ancho de raíz el T4 y T6 fueron los superiores con 1.13 y 1.16 mm respectivamente. El menor ancho de raíz se presentó en el T7 con 0.86 mm, mientras que el tratamiento testigo a base de medio MS obtuvo 0.95 mm (Cuadro 3).

De acuerdo a las variables fisiológicas evaluados en el presente trabajo, revelan que el T6 tiene una acción favorable en el desarrollo de raíces de plantas in vitro de D. cedrosanum, obtuvo resultados estadísticamente similares al tratamiento testigo incluso en la variable ancho de raíz logro superarlo, el T2 no mostró respuesta en la producción de raíces en ningún brote (Figura 2).

Figura 2: Plántulas de D. cedrosanum en etapa de enraizamiento. a) T1; b) T3; c) T4; d) T5; e) T6; f) T7. Barra = 1 cm.  

Figure 2: Seedlings of D. cedrosanum in the rooting stage. a) T1; b) T3; c) T4; d) T5; e) T6; f) T7. Bar = 1 cm. 

El largo y ancho de raíz producida a base de EV T6 (concentración de 10 mL L^-1) se vio favorecida, esto se debe a que el EV resulta apropiado para cualquier tipo de cultivo ya que estimula el crecimiento vegetal, rendimiento y calidad de las plantas (^{Pérez y Lamadrid, 2014}; ^{Calero et al., 2019}; ^{Torres et al., 2019}). Así mismo, el EV contiene ácidos húmicos y fúlvicos los cuales regulan vías metabólicas, como el crecimiento y desarrollo radicular de la planta (^{Sénes-Guerrero, Guardiola y Pacheco, 2019}). Los ácidos húmicos proporcionan radicales libres a las células vegetales que ayudan a ejercer un efecto positivo en el inicio del enraizamiento (^{Dhanapal y Sathish, 2014}). Los efectos reportados de los ácidos húmicos en las plantas están relacionados con un mayor crecimiento del sistema radicular, ya que estimulan la formación de raíces laterales, raíces adventicias y formación de pelos radiculares (^{Teixeira et al., 2021}), esto se debe principalmente a que estas sustancias regulan las hormonas de crecimiento de las plantas e impiden la destrucción del AIA.

El aprovechamiento de los desechos orgánicos hoy en día representa una alternativa de importancia ambiental, ecológica y económica (^{Vázquez, García, Navarro y García, 2015}), por lo tanto, se sugiere seguir realizando trabajos de investigación en el sentido de mejorar las propiedades del EV y así lograr resultados similares a los obtenidos con el medio MS, de esta manera se podrán reducir significativamente los costos de producción para la obtención masiva de plantas en micropropagación.