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Introducción
El género Gracilaria Greville es el grupo de algas rojas con mayor número de especies reportadas y el más estudiado dentro de la familia Gracilariaceae. Su historia taxonómica ha sido sumamente complicada, debido a que la identificación morfológica de sus representantes se basa en pocos caracteres diagnósticos y estos, muchas veces, se sobreponen entre ellos (Dreckmann, 2012). Consecuentemente, han surgido diversas agrupaciones de especies crípticas que solo han podido identificarse molecularmente. Tal es el caso del complejo Gracilaria mammillaris, que involucra a todas las especies planas del género distribuidas en el Atlántico americano, cuya identificación morfológica resulta aún más difícil si se considera que la distribución geográfica de la mayoría de sus integrantes coincide en algunas regiones (Gurgel y Fredericq, 2004; Gurgel et al., 2004; Dreckmann, 2012). En las costas del Atlántico mexicano presentan esta problemática cinco especies del complejo Gracilaria mammillaris: Gracilaria mammillaris (Montagne) M. Howe, G. flabelliformis (P. Crouan & H. Crouan) Fredericq & Gurgel, G. occidentalis (Børgesen) M. Bodard, G. suzanneae L.P. Soares, C.F.D. Gurgel & M.T. Fujii y G. curtissiae J. Agardh. Todas ellas, con excepción de Gracilaria mammillaris, han sido caracterizadas molecularmente para el área; sin embargo, aún no existen trabajos morfológicos que complementen detalladamente la diferenciación (Dreckmann, 2002, 2012; Gurgel y Fredericq, 2004; Gurgel et al., 2004).
Para la resolución de problemas taxonómicos como el expuesto anteriormente, los análisis de morfometría han demostrado ser muy útiles. Estos complementan las descripciones morfológicas cuantificando la variabilidad de las formas de cualquier carácter y la evalúan estadísticamente evidenciando la existencia, o no, de diferencias entre dos o más grupos taxonómicos (Umphrey, 1996; Calle et al., 2008; Toro et al., 2010; Navia et al., 2015). Particularmente para las especies del complejo Gracilaria mammillaris no hay trabajos de esta índole. Sin embargo, dentro de la familia Gracilariaceae existen antecedentes en donde con análisis morfométricos se han encontrado eficazmente caracteres que discriminan especies de complejos crípticos aún en simpatría; en ellos se destaca la importancia de las estructuras vegetativas en tal delimitación (Vilchis et al., 2019, 2020).
En consecuencia, el objetivo del presente estudio fue determinar, mediante análisis morfométricos, la existencia de caracteres que permitan la delimitación de cinco especies del complejo Gracilaria mammillaris en el Atlántico mexicano.
Material y Métodos
Área de estudio
El Atlántico mexicano está conformado por parte del Golfo de México y el Mar Caribe (Fig. 1). El primero abarca desde Tamaulipas hasta la costa central del estado de Yucatán; mientras que el segundo baña con sus aguas la parte noreste de Yucatán y todo el estado de Quintana Roo. La temperatura superficial del agua de este cuerpo oceánico oscila entre 24-25 °C en invierno y 28-29 °C en verano (Caso et al., 2004). En cuanto al sustrato, en el Golfo de México se pueden encontrar arenas mixtas, limos, arcillas y arenas calcáreas; mientras que la parte del Caribe está formada de calizas coralíferas y sedimentos carbonatados, susceptibles a la erosión hídrica (Caso et al., 2004).
Figura 1: Mapa de la República Mexicana, indicando las localidades del Atlántico mexicano donde fueron colectados los ejemplares del complejo Gracilaria mammillaris analizados. 1. Playa Paraíso, Veracruz; 2. Playa Mocambo, Veracruz; 3. Puerto Real, Campeche; 4. Kilómetro 33, Campeche; 5. Sabancuy, Campeche; 6. Bahía Tortugas, Campeche; 7. Punta Xen, Campeche; 8. Playa Bonita, Campeche; 9. Xcalacoco, Quintana Roo; 10. Playa 88, Quintana Roo; 11. Playa del Carmen, Quintana Roo.
Bióticamente el Atlántico mexicano se caracteriza por su gran diversidad filogenética; principalmente el noroeste de la Península de Yucatán representa el encuentro de dos biotas de diferente origen biogeográfico. Esta diversidad podría ser consecuencia de la riqueza de ambientes costeros en la zona y su particular historia geológica y biogeográfica (Núñez-Resendiz et al., 2016; Hernández et al., 2017; Vilchis et al., 2018).
Obtención de muestras
El material biológico analizado en el presente estudio corresponde a ejemplares depositados en la Colección de Macroalgas Marinas del Herbario Metropolitano (UAMIZ, acrónimo según Thiers, 2021) de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa (Cuadro 1).
Cuadro 1: Referencias de los ejemplares de herbario depositados en la Colección de Macroalgas Marinas del Herbario Metropolitano (UAMIZ), provenientes del Atlántico mexicano y analizados en este estudio. Cada número de herbario contiene varios duplicados, los cuales se indican entre paréntesis en la segunda columna (n). *Identificados molecularmente por Vilchis et al. (2021) y Hernández (2022).
| Especie | Número de herbario (n) | Localidades en México |
|---|---|---|
| Gracilaria cf. mammillaris (Montagne) M. Howe | UAMIZ-761(2) | Playa Mocambo, Veracruz |
| UAMIZ-956(3) | Puerto Real, Campeche | |
| UAMIZ-900(1) | Playa Paraíso, Veracruz | |
| UAMIZ-1371(2) | Bahía Tortugas, Campeche | |
| UAMIZ-672(2) | Playa del Carmen, Quintana Roo | |
| UAMIZ-958(2) UAMIZ-936(2) | Sabancuy, Campeche Sabancuy, Campeche | |
| UAMIZ-990(1) | Playa Bonita, Campeche | |
| Gracilaria flabelliformis (P. Crouan & H. Crouan) Fredericq & Gurgel | UAMIZ-1405(1) | Xcalacoco, Quintana Roo |
| UAMIZ-1406(1)* UAMIZ-1369(1)* | Kilómetro 33, Campeche Kilómetro 33, Campeche | |
| UAMIZ-1407(1)* | Playa 88, Quintana Rooo | |
| UAMIZ-1408(1)* | Playa Paraíso, Veracruzo | |
| UAMIZ-1409(2)* UAMIZ-1378(1)* | Bahía Tortugas, Campeche Bahía Tortugas, Campeche | |
| Gracilaria occidentalis (Børgesen) M. Bodard | UAMIZ-1410(2)* | Kilómetro 33, Campeche |
| UAMIZ-1381(4)* | Punta Xen, Campeche | |
| Gracilaria suzanneae L.P. Soares, C.F.D. Gurgel & M.T. Fujii | UAMIZ-1377(4)* | Punta Xen, Campeche |
| Gracilaria curtissiae J. Agardh | UAMIZ-1411(4)* | Bahía Tortugas, Campeche |
En total se analizaron 37 ejemplares, de los cuales 15 corresponden a Gracilaria mammillaris, ocho a G. flabelliformis, seis a G. occidentalis, cuatro a G. suzanneae y cuatro a G. curtissiae. La mayoría de los especímenes han sido identificados molecularmente en los trabajos de Vilchis et al. (2021) y Hernández (2022), con excepción de los 15 representantes de G. mammillaris que, dada la coincidencia morfológica con el complejo de especies estudiado que gira en torno a este nombre, serán tratados como Gracilaria cf. mammillaris. Las localidades de donde provienen estos especímenes se muestran en la Figura 1; el mapa fue realizado con el programa QGis v. 3.22 (Quantum GIS Development Team, 2021), y algunos hábitos de las cinco especies que integran el complejo se muestran en la Figura 2, cuyas fotografías se tomaron con una cámara Nikon Coolpix B500 (Nikon Corporation, Tokio, Japón).
Figura 2: Especies del complejo Gracilaria mammillaris analizadas y recolectadas en el Atlántico mexicano. A1, A2. Gracilaria cf. mammillaris (Montagne) M. Howe de Playa del Carmen, Quintana Roo, escala: 2 cm; B1, B2. Gracilaria cf. mammillaris de Playa Mocambo, Veracruz, escala: 3 cm; C. Gracilaria flabelliformis (P. Crouan & H. Crouan) Fredericq & Gurgel de Xcalacoco, Quintana Roo, escala: 3 cm; D. Gracilaria flabelliformis de Bahía Tortugas, Campeche, escala: 4 cm; E. Gracilaria flabelliformis de Playa 88, Quintana Roo, escala: 4 cm; F. Gracilaria curtissiae J. Agardh de Bahía Tortugas, Campeche, escala: 4 cm; G. Gracilaria suzanneae L.P. Soares, C.F.D. Gurgel & M.T. Fujii de Punta Xen, Campeche, escala: 4 cm; H. Gracilaria occidentalis (Børgesen) M. Bodard de kilómetro 33, Campeche, escala: 3 cm; I. Gracilaria occidentalis de kilómetro 33, Campeche, escala: 3 cm.
Preparación de muestras
Del talo de cada ejemplar se extrajeron tres fragmentos de aproximadamente 4 mm de longitud: uno de la porción apical, otro de la porción media y el último de la porción basal (Fig. 3A). Los fragmentos fueron hidratados con agua durante 30 minutos y fijados en FAA (formaldehído-alcohol-acético-agua) por tres días para endurecer el tejido y evitar su deformación en los procesos siguientes. Sobre cada fragmento, en un micrótomo de ultracongelación Leica CM 1510-3 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) a -20 °C, se realizaron cortes transversales de 10 μm de ancho. Estos fueron colocados en un portaobjetos y sometidos al siguiente tren de tinción y montaje: 1) hidratación con etanol al 95, 80, 75 y 50% durante cinco minutos en cada uno, 2) tinción con verde rápido concentrado durante dos horas, 3) deshidratación con etanol al 30, 50, 75 y 100% durante cinco minutos en cada uno, y un minuto en alcohol terbutílico al 100%, 4) montaje de muestras en Entellan (López-Curto et al., 2005).
Figura 3: A. porciones a lo largo del talo de las especies del complejo Gracilaria mammillaris analizadas y recolectadas en el Atlántico mexicano, de donde se extrajeron los fragmentos empleados para su posterior análisis; B. células analizadas morfométricamente en cada fragmento. Figuras modificadas de Vilchis et al. (2019, 2020; CC BY-NC 4.0).
Análisis morfométrico
En cada uno de los cortes, empleando un microscopio Leica DM LB (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania), se realizaron las siguientes mediciones: diámetro mayor y menor del talo en las porciones apical, media y basal, y largo y ancho promedio (medición de cinco células) de las células corticales, subcorticales y medulares en cada porción (Fig. 3B). Así, se obtuvieron 24 caracteres métricos que fueron estandarizados y sometidos a un análisis de componentes principales (ACP) en el programa PAST v. 2.17 (Hammer et al., 2001). Lo anterior se realizó con la finalidad de evaluar la existencia de un patrón de variación morfológica entre las especies, y de esta manera identificar las medidas que determinan la formación de grupos dentro del espacio multivariado. Los componentes principales resultantes fueron sometidos a un Análisis Multivariante de la Varianza no Paramétrico (NP-MANOVA). Al no cumplirse los supuestos necesarios para someterlos a un análisis paramétrico, se empleó la distancia euclidiana para evaluar la diferencia intraespecífica. La significancia de la separación de los grupos se midió mediante la permutación de la pertenencia a un grupo con 9999 repeticiones utilizando la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples (Sokal y Rohlf, 1995) para el cálculo de los valores resultantes de p (significancia). Se graficaron la media aritmética y el error estándar para los caracteres que tuvieron mayor contribución en la discriminación de especies; para ellos, también se calcularon y graficaron la media aritmética y los intervalos de confianza.
Complementariamente, en el programa PAST v. 2.17 (Hammer et al., 2001), las medidas de los 24 caracteres fueron sometidos a un análisis de agrupamiento bajo el índice de disimilitud de distancia euclidiana y el algoritmo por ligamiento promedio no ponderado (UPGMA, por sus siglas en inglés); el análisis resumió los resultados en un dendograma.
Resultados
El análisis de componentes principales (ACP) mostró que los dos primeros componentes explican 53.63% del total de la varianza. Los coeficientes de correlación entre estos y cada variable se muestran en la Cuadro 2. El primer componente explicó 27.77% de la varianza total y las variables que mejor la explicaron, según los coeficientes de correlación más altos, fueron el largo y ancho de las células corticales de la porción media (Cuadro 2; Fig. 4); ambas, en promedio, más grandes en G. curtissiae que en las demás especies del complejo (Figs. 5A, B). El segundo componente acumuló 25.86% de la varianza total y de acuerdo con los coeficientes de correlación más altos, el largo y ancho de las células medulares en la porción media fueron las medidas que mejor la explicaron (Cuadro 2; Fig. 4). En promedio fueron más pequeñas en G. curtissiae que en G. cf. mammillaris, G. flabelliformis, G. occidentalis y G. suzanneae (Figs. 5C, D).
Cuadro 2: Coeficientes de correlación de los dos primeros componentes principales y las 24 variables empleadas en el análisis del complejo Gracilaria mammillaris del Atlántico mexicano. Los coeficientes de correlación más altos se resaltan en negritas.
| Medidas | Porción | CP1 | CP2 |
|---|---|---|---|
| Diámetro mayor del talo | Apical | 0.2194 | -0.3655 |
| Diámetro menor del talo | Apical | -0.04384 | 0.5245 |
| Diámetro mayor del talo | Media | -0.155 | 0.1997 |
| Diámetro menor del talo | Media | 0.1884 | 0.6091 |
| Diámetro mayor del talo | Basal | 0.6257 | -0.1787 |
| Diámetro menor del talo | Basal | 0.4645 | -0.1289 |
| Largo células corticales | Apical | 0.5632 | 0.0901 |
| Ancho células corticales | Apical | 0.5626 | -0.02887 |
| Largo células subcorticales | Apical | 0.3486 | 0.3921 |
| Ancho células subcorticales | Apical | 0.3832 | 0.4723 |
| Largo células medulares | Apical | 0.1003 | 0.5781 |
| Ancho células medulares | Apical | 0.1529 | 0.6985 |
| Largo células corticales | Media | 0.8358 | -0.7837 |
| Ancho células corticales | Media | 0.7863 | -0.7825 |
| Largo células subcorticales | Media | 0.4965 | -0.5872 |
| Ancho células subcorticales | Media | 0.5455 | -0.466 |
| Largo células medulares | Media | -0.03871 | 0.8826 |
| Ancho células medulares | Media | 0.2464 | 0.8761 |
| Largo células corticales | Basal | 0.6751 | 0.5312 |
| Ancho células corticales | Basal | 0.6198 | 0.3416 |
| Largo células subcorticales | Basal | 0.5563 | 0.2143 |
| Ancho células subcorticales | Basal | 0.5831 | -0.4078 |
| Largo células medulares | Basal | 0.6127 | 0.2084 |
| Ancho células medulares | Basal | 0.4138 | 0.3714 |
Figura 4: Diagrama de los dos primeros componentes principales resultante del ACP basado en 24 variables morfométricas para la discriminación de las especies Gracilaria cf. mammillaris (Montagne) M. Howe (▲), G. flabelliformis (P. Crouan & H. Crouan) Fredericq & Gurgel (⬟), G. occidentalis (Børgesen) M. Bodard (□), G. suzanneae L.P. Soares, C.F.D. Gurgel & M.T. Fujii (●); G. curtissiae J. Agardh (▼)..
Figura 5: Diagrama comparativo de la media aritmética (cuadros negros y valor numérico) y el error estándar (bigotes) de los caracteres con mayor peso en el análisis de componentes principales para la discriminación de las especies Gracilaria cf. mammillaris (Montagne) M. Howe (1), G. flabelliformis (P. Crouan & H. Crouan) Fredericq & Gurgel (2), G. occidentalis (Børgesen) M. Bodard (3), G. suzanneae L.P. Soares, C.F.D. Gurgel & M.T. Fujii (4) y G. curtissiae J. Agardh (5).
La dispersión de los ejemplares en el plano factorial, formado por los dos primeros componentes principales (Fig. 4), muestra la sobreposición espacial de G. cf. mammillaris, G. flabelliformis, G. occidentalis y G. suzanneae, así como la segregación de G. curtissiae. Los estadísticos descriptivos calculados robustecen estos resultados al mostrar que las medidas de mayor peso en el ACP segregan del complejo únicamente a G. curtissiae (Fig. 5).
El NP-MANOVA mostró que existen diferencias significativas entre algunas de las especies bajo estudio (p<0.005, F=5.21). Las comparaciones pareadas evidencian que no hay diferencias significativas entre G. cf. mammillaris, G. flabelliformis, G. occidentalis y G. suzanneae, pero sí entre cada una de ellas con G. curtissiae (Cuadro 3).
Cuadro 3: Valores de p resultado de las comparaciones pareadas entre especies del complejo Gracilaria mammillaris del Atlántico mexicano, producto del NP-MANOVA.
| Gracilaria cf. mammillaris (Montagne) M. Howe | Gracilaria flabelliformis (P. Crouan & H. Crouan) Fredericq & Gurgel | Gracilaria occidentalis (Børgesen) M. Bodard | Gracilaria suzanneae L.P. Soares, C.F.D. Gurgel & M.T. Fujii | |
|---|---|---|---|---|
| Gracilaria cf. mammillaris (Montagne) M. Howe | - | - | - | - |
| Gracilaria flabelliformis (P. Crouan & H. Crouan) Fredericq & Gurgel | 0.8435 | - | - | - |
| Gracilaria occidentalis (Børgesen) M. Bodard | 0.0922 | 0.1439 | - | - |
| Gracilaria suzanneae L.P. Soares, C.F.D. Gurgel & M.T. Fujii | 0.2587 | 0.2872 | 0.9176 | - |
| Gracilaria curtissiae J. Agardh | 0.0024 | 0.0488 | 0.0116 | 0.0295 |
El análisis de agrupamiento, basado en las medidas de los 24 caracteres, arrojó un dendograma que confirma la independencia de G. curtissiae, así como la similitud morfométrica entre G. cf. mammillaris, G. flabelliformis, G. occidentalis y G. suzanneae (Fig. 6).
Figura 6: Dendograma resultante del análisis de agrupamiento, basado en 24 caracteres métricos tomados de los ejemplares de Gracilaria cf. mammillaris (Montagne) M. Howe (M), G. flabelliformis (P. Crouan & H. Crouan) Fredericq & Gurgel (F), G. occidentalis (Børgesen) M. Bodard (O), G. suzanneae L.P. Soares, C.F.D. Gurgel & M.T. Fujii (Z), G. curtissiae J. Agardh (C).
Discusión
Los resultados demuestran que los caracteres morfométricos empleados en este estudio no permiten delimitar a Gracilaria cf. mammillaris, G. flabelliformis, G. occidentalis y G. suzanneae, pero sí evidenciaron consistentemente que existen diferencias entre G. curtissiae y las especies antes mencionadas. Los caracteres morfométricos de la porción media del talo fueron los que aportaron información suficiente para distinguirla, mientras que las mediciones de las porciones apical y basal no aportaron información relevante para ello. Lo anterior puede deberse, por un lado, a que las partes basales suelen presentar deformaciones al ser las de mayor edad a lo largo del talo y las que soportan los fuertes movimientos del agua; por otro lado, en las zonas apicales las células son más alargadas que las de las porciones media y basal, lo que provoca una variabilidad considerable en sus formas y las hace ineficaces en la discriminación morfométrica. Este alargamiento tiende a disminuir drásticamente hacia la porción media donde la forma de las células es más estable u homogénea, contribuyendo así a diferenciar, al menos, una de las cinco especies analizadas.
Gurgel et al. (2004, 2018), Gurgel y Fredericq (2004) y Soares et al. (2018) han evidenciado la dificultad que representa la identificación de las especies comprendidas en el complejo Gracilaria mammillaris, debido a la sobreposición de muchos caracteres diagnósticos y a sus rangos de distribución coincidentes, la mayoría de las veces. Molecularmente, los mismos autores han propuesto que especies como G. mammillaris, G. flabelliformis, G. occidentalis y G. suzanneae son entidades genéticas diferentes a pesar de su similitud morfológica. Sin embargo, en un trabajo recientemente publicado en el que Vilchis et al. (2021) realizaron la caracterización molecular de las especies de la familia Gracilariaceae en el Atlántico mexicano, tres análisis diferentes de delimitación de especies indican que no existe independencia molecular clara, al menos entre G. suzanneae y G. occidentalis. Además, resaltaron que los ejemplares de ambas especies partieron de su identificación previa como G. mammillaris dada su similitud morfológica. Esto último coincide con los resultados obtenidos mediante las comparaciones morfométricas pareadas y el análisis de agrupamiento presentados aquí, donde no hay una segregación significativa entre estas entidades taxonómicas (Cuadro 3).
Por otra parte, estudios filogenéticos han demostrado consistentemente la independencia molecular de G. curtissiae colocándola incluso en un clado diferente al resto de las especies del complejo (Gurgel et al., 2004, 2018; Gurgel y Fredericq, 2004); lo anterior también coincide con los resultados morfométricos de este trabajo.
El desafío que ha representado para los ficólogos la identificación de muchas de las especies de Gracilaria ha llevado al uso de estrategias múltiples que permitan encontrar caracteres para delimitarlas. Un ejemplo de esto es el del complejo de especies Gracilaria domingensis, cuyo estudio bajo diferentes análisis moleculares y una revisión morfológica detallada permitieron reconocer siete taxones dentro de él (Lyra et al., 2016). En el caso particular del complejo Gracilaria mammillaris, siguen sin encontrarse caracteres diagnósticos claros que permitan diferenciar a la mayoría de sus integrantes, aunque ya han sido delimitados molecularmente. Cabe destacar que, para las especies de este grupo taxonómico distribuidas en México, en ningún estudio filogenético se ha confirmado la presencia de G. mammillaris, a pesar de que ha sido ampliamente reportada como morfoespecie (Dreckmann, 2012). Esto, junto con los análisis morfométricos del presente estudio podría evidenciar que probablemente G. mammillaris no sea parte de la ficoflora mexicana y los ejemplares sin identificación molecular en realidad correspondan a cualquiera de los otros taxones con los que se sobrepone morfométricamente.
Lo expuesto anteriormente abre un panorama interesante para el estudio de este complejo de especies crípticas, debido a que la evidencia molecular y la morfométrica podrían estar indicando un proceso de especiación reciente y a que, de acuerdo con las reflexiones realizadas por De Queiroz (2007) sobre la delimitación de especies, el complejo G. mamillaris se encontraría en una etapa donde las características morfológicas de cada entidad taxonómica aún no son distinguibles, pero sí las características filogenéticas. Los análisis de reloj molecular y la reconstrucción filogeográfica de las poblaciones de estas especies podrían ayudar a entender y describir de mejor manera el estado en el que se encuentra este proceso de divergencia.
