Introducción

En el reino Plantae existen diversas relaciones interespecíficas; entre ellas destacan las del tipo fitopatogénico debido a que causan enfermedades en plantas, tanto en cultivadas como en ornamentales, con consecuencias económicas importantes. Se estima que alrededor de 2500 especies vegetales pueden infectar plantas vasculares (^{Agrios, 2005}). Aunque los muérdagos son las plantas patógenas más conocidas (^{Agrios, 2005}), existen otros organismos relevantes debido al amplio rango de hospederos que pueden afectar. Este es el caso de algunas algas verdes del phylum Chlorophyta, cuyas especies parásitas se encuentran en los géneros Cephaleuros Kunze ex E.M. Fries, Phyllosiphon Kühn y Rhodochytrium Lagerheim (^{Joubert y Rijkenberg, 1971}; ^{Agrios, 2005}; ^{Aboal y Werner, 2011}). De estos grupos taxonómicos, Cephaleuros contiene 18 especies reconocidas en AlgaeBase (^{Guiry y Guiry, 2023}); todas ellas fitopatógenas: C. aucubae Suto & Ohtani, C. biolophus Thompson & Wujek, C. diffusus Thompson & Wujek, C. drouetii Thompson & Wujek, C. endophyticus (F.E. Fritsch) Printz, C. expansus Thompson & Wujek, C. henningsii Schmidle, C. japonicus Suto & Ohtani, C. karstenii Schmidle, C. lagerheimii Schmidle, C. microcellularis Suto & Ohtani, C. minimus Karsten, C. parasiticus Karsten, C. pilosa Thompson & Wujek, C. pilosus Thompson & Wujek, C. solutus Karsten, C. tumidae-setae Thompson & Wujek y C. virescens Kunze ex E.M. Fries.

Cephaleuros virescens se ha reportado como un fitopatógeno que afecta a casi 300 especies cultivadas, causando daños en las hojas de diversos cultivos tales como anacardo, arándano, baya coral, cacao, café, camelia, chirimoya, ciruela, coco, jazmín, magnolia, mamey, membrillo, palma de aceite, panapén, pimienta, vainilla, yuca y zapote (^{Malagi et al., 2011}). Estos daños se han registrado en Australia, Brasil, Colombia, Costa Rica, China, Etiopía, Estados Unidos de América, India, Japón, Korea, Pakistán, Perú y Taiwán (^{Wolf, 1930}; ^{Holcomb et al., 1998}; ^{Garrido y Pisfil Diez, 2007}; ^{Nelson, 2008}; ^{Han et al., 2011}; ^{Suto et al., 2014}; ^{Browne et al., 2020}; ^{Patrice et al., 2021}; ^{Dechassa y Merga, 2022}; ^{Shen et al., 2022}). En México, se ha reportado infectando limón en el estado de Colima (^{Orozco-Santos et al., 2014}), así como guayaba, mango (^{Quezada-Gutiérrez et al., 2009}) y aguacate en Michoacán (^{Téliz-Ortiz y Mora-Aguilera, 2007}).

Por otro lado, desde 2019 se ha observado de forma persistente una enfermedad en zarzamora en dos áreas de Michoacán, que se ha nombrado como “la mancha naranja”. Se caracteriza por presentar manchas redondeadas, de aspecto afelpado y de color naranja, que pueden observarse tanto en la parte superior de los tallos (también denominados cañas) como en la base de la planta. Debido a la presencia de síntomas con tonalidades naranjas, los productores habían sospechado de algún tipo de roya o alga que afectaba los tallos de zarzamora de tercer o cuarto año de crecimiento (Comm. pers., 2019). La mancha naranja se ha convertido en un problema significativo, pues los agroquímicos utilizados para combatir otros patógenos no han logrado reducir su incidencia en la zarzamora.

Es importante destacar que la creciente demanda internacional de frutillas o berries, entre los que se encuentra la zarzamora, ha impulsado la producción de este fruto en México (^{SADER, 2021}). El país se sitúa en el primer lugar a nivel mundial en la producción de esta frutilla, con un total de 215,923 toneladas (^{SADER, 2021}; ^{SIAP, 2022}). En México, Michoacán es el principal estado productor de zarzamora contribuyendo con 97% de la producción a nivel nacional en 2022, siendo los Estados Unidos de América el principal cliente, que acapara 93.1% del total exportado (^{SIAP, 2022}).

Dado el significativo valor del cultivo en Michoacán, se recolectaron muestras de tallos (cañas) de zarzamora afectados por la mancha naranja con el propósito de identificar el fitopatógeno responsable de la enfermedad mediante análisis morfológicos y moleculares.

Materiales y Métodos

Recolección de muestras

Se recolectaron en las localidades de Taretan y Chupio, Michoacán, México (Fig. 1) cañas de Rubus sp. cv. Tupy afectadas por mancha naranja. El clima en Taretan se clasifica como subtropical húmedo, caracterizado por lluvias durante la temporada de verano, con una precipitación pluvial anual de 1560 mm y temperaturas que entre 14.4 y 29.66 ºC (^{INAFED, 2020}). Por otro lado, en Chupio el clima es cálido subhúmedo, con lluvias también en verano, una precipitación pluvial entre 900 y 1300 mm y temperaturas entre 18 y 24 ºC (^{INEGI, 2010}).

Figura 1: Lugares de colección de tallos de zarzamora cv. Tupy afectados por mancha naranja en Taretan y Chupio, Michoacán, México. Realizado por Jazmín Cortés Martínez en Google Earth Pro v. 7.3.6.9345 (^{Google Earth Pro, 2022}). 

Las muestras de Taretan (19.34^o latitud, -101.92^o longitud, 1170 m s.n.m.) se recolectaron en abril y septiembre 2019, y en enero y marzo 2020. Las muestras procedentes de Chupio (19.18^o latitud, -101.44^o longitud, 1160 m s.n.m.) se obtuvieron en marzo 2021.

Las cañas afectadas se cortaron en los fragmentos que presentaban infección activa, con tijeras de poda previamente desinfectadas con alcohol al 96%. Estos fragmentos se almacenaron individualmente en bolsas de papel estraza debidamente etiquetadas. En total, se recopilaron 25 muestras (cañas afectadas), cada una de diferentes individuos. Los fragmentos de tallo se transportaron en una hielera a 4°C y se mantuvieron refrigerados a la misma temperatura en el laboratorio de Ecología del Instituto de Ecología, A.C., Centro Regional del Bajío, en Pátzcuaro, Michoacán, México.

Resultados

Presencia de la enfermedad de mancha naranja en zarzamora

Al revisar los tallos de plantas de zarzamora de las localidades de Chupio y Taretan, se observó que los síntomas de mancha naranja presentes en las muestras eran muy semejantes macroscópicamente. La enfermedad en ambas localidades se manifiesta con síntomas distintivos: inicialmente, se presentan manchas redondeadas, notorias al superar 1 cm de ancho, con aspecto compacto y finamente pubescente de color anaranjado en la superficie de la caña (Fig. 2A). Con el tiempo maduran, pueden unirse con otras manchas y cambian gradualmente a un tono verde grisáceo expandiéndose a lo largo del tallo (Fig. 2A). Además de los síntomas visibles en los tallos, es posible observar signos del patógeno, como esporangióforos, en el envés de las hojas. Sin embargo, esta infección suele ser poco profusa y dispersa, que no llega a formar una mancha completa. En el entorno natural, la infección comienza en la parte superior de la caña con manchas aisladas, pero a medida que la enfermedad se desarrolla, se extiende formando un patrón salpicado que se propaga hacia la base de la planta. Esto puede cubrir gran parte de la superficie del tallo y en muchos casos provoca la decadencia o incluso la muerte de la planta. La enfermedad puede afectar a las zarzamoras de segundo corte, siendo las plantas de tercer y cuarto corte las más vulnerables. Las plantas jóvenes no suelen ser afectadas por este patógeno. La enfermedad está presente durante todo el año, pero su desarrollo es más activo durante la temporada de lluvias, que suele ser de junio a septiembre. En la época de sequía, el patógeno depende de las condensaciones de agua para completar su ciclo de vida.

Figura 2: Síntomas y signos de la enfermedad de la mancha naranja en la planta de zarzamora. A. tallos con manchas redondas y aterciopeladas; B. superficie del tallo en la que se proyectan esporangióforos; C. múltiples esporangióforos maduros color naranja y esporangióforos jóvenes de color traslúcido. Escalas: A=1 cm, B=200 µm, C=500 µm. 

Características micromorfológicas del alga fitopatógena

Al revisar con el microscopio estereoscópico a los organismos que conforman las manchas naranjas en los tallos de zarzamora cv. Tupy en Chupio y Taretan, se detectó la presencia de estructuras algales multicelulares filamentosas anaranjadas que cubren toda la superficie (Fig. 2B) y que constituyen los esporangióforos del fitopatógeno (Fig. 2C), coincidiendo con elementos que tienen algunas especies del género Cephaleuros (^{Brooks et al., 2015}). Al microscopio óptico, el talo o cuerpo del alga presentó una forma redondeada y compacta, sin huecos visibles. De este talo se proyectaron esporangióforos (sp) alargados, que variaron de color naranja a amarillento. Cada uno de estos esporangióforos desarrolló una vesícula (HC) de la cual emergieron 1-3 células sulfutorias (SC). Cada una de estas células sostiene un esporangio (S) también conocido como zoosporangio (Fig. 3A,B). En los esporangios, las células sulfutorias (SC) presentaron un ángulo pronunciado (Fig. 3B) Además de los esporangióforos, en el talo también se encontraron setas (z) multicelulares con un extremo distal redondeado (Fig. 3C). El zoosporangio es redondo a subgloboso al madurar sostenido por el esporangióforo (sp) (Fig. 3D). Dentro de estos zoosporangios se desarrollan las zoosporas.

Figura 3: Estructuras del alga Cephaleuros Kunze ex E.M. Fries, observación al microscopio óptico. A. esporangióforo en formación desarrollando una vesícula (HC), célula sulfutoria (SC), esporangio (S); B. zoosporangio de forma redonda, acompañado de una célula sulfutoria (SC) alargada con un ángulo característico de Cephaleuros virescens Kunze ex E.M. Fries; C. seta (z) con terminación redondeada y esporangióforos en proceso de diferenciación; D. zoosporangios (s) redondos sostenidos por múltiples esporangióforos (sp). Escalas: fotos A, B y D=20 µm, C=50 µm. 

Tres algas fitopatógenas del género Cephaleuros presentan los elementos morfológicos observados (talo, esporangios, gametangios, células sulfutorias), aunque varían en tamaño y forma. En el Cuadro 2, se comparan los datos reportados para tres especies relacionadas: C. diffusus, C. parasiticus y C. virescens, junto con la especie en estudio.

Cuadro 2: Características de las estructuras de tres especies de algas fitopatógenas del género Cephaleuros Kunze ex E.M. Fries comparadas con la especie de estudio. Datos referidos en ^{1Thompson y Wujek, 1997}; ^{2Suto y Ohtani, 2009}; ^{3Suto et al., 2014}; ^{4Pitaloka et al., 2015}; ^{5Sunpapao y Pitaloka, 2015}; ^{6Sunpapao et al., 2016}. 

Elemento	Mancha naranja en este estudio	Cephaleuros diffusus Thompson & Wujek 1,5	Cephaleuros parasiticus Karsten 3,6	Cephaleuros virescens Kunze ex E.M. Fries 2,4
Forma de talo	Redonda, sin espacios	Disco circular con expansión radial	No se reporta	Disco irregular sin huecos, o redonda
Setas	Filamento delgado, cilíndrico, con extremo distal redondeado	Filamento cilíndrico	Sin setas	Filamento delgado con punta globular a elíptica, compuesto de cinco células
Esporangióforo (largo × ancho μm)	De la base hasta la vesícula, 98-168(129.7) de largo	250-440(350.5) × 10-12.5(10.5)	232.5- 490(335.6) × 10-22.5(12.7)	Medida de la base hasta las células de la vesícula 252-430 (320.4) × 10-20 (17)
Vesícula (largo × ancho μm)	33.3-28 (33.3) × 25.2-30.8 (28.4)	No se reporta	No se reporta	No se reporta
Célula filamentosa o sulfutoria	Larga y cilíndrica	Corta, cilíndrica e irregular	Irregular, difícil de medir, Se desarrollan debajo de la célula epidérmica	Corta o larga cilíndrica
Esporangio (largo × ancho μm)	17-26(20) × 15-21(18)	12.5-27.5(15.5) × 10-20 (15)	20-30(25.08) × 15-25(18.8)	17-27 × 15-21
Gametangio (largo × ancho μm)	29- 58 × 20-42	12.5-32.5 × 12.5-22.5	No se reporta	29-58 × 18-43
Número de esporangios	2 a 3	No se reporta	4 a 6	2 a 3

Trabajo molecular y análisis filogenético

Se obtuvieron seis secuencias de Cephaleuros. De estas, cuatro son del marcador 18S ADNr (dos de Taretan y dos de Chupio) y dos secuencias de la región ITS de Chupio; las muestras de Taretan no amplificaron con este último marcador. Las secuencias obtenidas se han registrado en GenBank bajo los números de acceso OR583174 - OR583177 para la región 18S y OR587854 - OR587855 para el marcador ITS.

En el análisis filogenético, se incluyeron 58 secuencias de Cephaleuros, incorporando las seis secuencias generadas en esta investigación. La matriz de datos correspondiente al marcador 18S consistió en 31 secuencias, cada una con la longitud de 953 pb. Por otro lado, en la base de datos del marcador ITS1+5.8S+ITS2 se integraron 27 secuencias, con un alineamiento total de 691pb. Para los datos del 18S, el modelo evolutivo que mejor se ajusta a los datos fue TIM2+I+G, mientras que, para las secuencias de ITS, TIM3+G.

Los árboles filogenéticos basados en la secuencia de ITS y 18S mostraron una mejor resolución utilizando el método de máxima verosimilitud (MV), ya que generaron pocas politomías, aunque los clados recuperados con la misma topología tuvieron mejor soporte con probabilidad bayesiana (Fig. 4). Tanto en el enfoque de MV como en el análisis Bayesiano, las secuencias de Cephaleuros que afectan a las zarzamoras en Michoacán se agruparon de manera consistente en la misma topología. El análisis reveló que las muestras de Cephaleuros de Michoacán (Fig. 4) formaron un clado, junto con muestras de los Estados Unidos de América que también afectan a Rubus sp., con una alta probabilidad bayesiana (1). Es importante destacar que varias secuencias identificadas en GenBank como C. virescens y C. parasiticus se distribuyeron a lo largo de la filogenia, mientras que las secuencias de Michoacán y los Estados Unidos de América se agruparon fuera de los nueve clados identificados por ^{Fang et al. (2021)}. Estos autores, al analizar secuencias de ITS ADNr de varias especies de Cephaleuros provenientes de Asia y África, observaron que se agrupaban en nueve clados distintos.

Figura 4: Filogenia de especies de Cephaleuros Kunze ex E.M. Fries inferida con secuencias de 18S, analizadas con máxima verosimilitud y 1000 repeticiones de Bootstrap. En los nodos se indican los valores de soporte de las probabilidades posteriores bayesianas (PP) y las de Bootstrap (BP). Las secuencias de Trentepohlia C. Martius se usaron como grupo externo. Las nuevas secuencias generadas en este estudio se indican en negritas. 

Discusión

Nuestro estudio mostró que las características del organismo causal de las manchas naranjas en las muestras tomadas en las localidades de estudio (Chupio y Taretan) corresponden al género de algas Cephaleuros. La presencia de esporangióforos pedicelados que sostienen esporangios laterales, a través de células sulfutorias, concuerda con las descripciones realizadas por ^{Brooks et al. (2015)}. Es importante destacar que estas características difieren de las de otros dos géneros de algas fitopatógenas descritos por ^{Procházková et al. (2016)} para Phyllosiphon y por ^{Atkinson (1908)} para Rhodochytrium.

En el continente americano se han reportado dos especies de Cephaleuros como patogénicas: C. virescens que afecta los cultivos de aguacate, guayaba, limón, mango y zarzamora (^{Téliz-Ortiz y Mora-Aguilera, 2007}; ^{Nelson, 2008}; ^{Quezada-Gutiérrez et al., 2009}; ^{Orozco-Santos et al., 2014}; ^{Browne et al., 2020}) y C. parasiticus que induce enfermedades en bromelias (^{Sanahuja et al., 2018}) y guayabas (^{Nelson, 2008}). Los síntomas observados en la zarzamora de Michoacán coinciden con los causados por C. virescens: inicialmente aparecen manchas amarillas redondas que con el tiempo se tornan anaranjadas, a menudo con una apariencia aterciopelada; luego, estas manchas cambian a un tono verde grisáceo a medida que maduran (^{Marlatt y Alfieri, 1981}). Esto contrasta con los síntomas producidos por C. parasiticus, que genera manchas anaranjadas en las hojas, que son amarillas en el centro y afelpadas (^{Suto et al., 2014}). En bromelias estas manchas son de color verde grisáceo y pueden evolucionar a manchas oxidadas (^{Ramya et al., 2013}).

La sintomatología en los tallos de zarzamora en Michoacán podría asemejarse a la inducida por C. diffusus, que también genera manchas anaranjadas y se oxidan con el tiempo (^{Sunpapao y Pitaloka, 2015}). Sin embargo, al considerar la evidencia microscópica, se descarta Cephaleuros diffusus debido al tamaño de los esporangios, que en C. diffusus son más pequeños (12.5-27.5(15.5) × 10-20(15) µm) (^{Sunpapao et al., 2016}), en comparación con los de C. parasiticus, que son más grandes (20-30(25.08) × 15-25(18.8) µm). Por otro lado, los esporangios de C. virescens (17-27 × 15-21 µm) en muestras de Magnolia grandiflora L. y Persea thunbergii (Siebold & Zucc.) Kosterm. reportados por ^{Suto y Ohtani (2009)} en Japón son similares en tamaño a los observados en los tallos de zarzamora en Michoacán (17-26(20) × 15-21(18) µm). El tamaño del gametangio de C. diffusus (12.5-32.5 × 12.5-22.5 µm) es menor al de las muestras de zarzamora en Michoacán (29-58 × 20-42 µm), que se asemeja al de C. virescens (29-58 × 18-43 µm) (Suto y Ohtani, 2009; Pitaloka et al., 2015). Además, las muestras en Michoacán se diferencian de C. parasiticus en que este último tiene de 4 a 6 esporangios (^{Suto et al., 2014}), mientras que la especie en Michoacán tiene de 2 a 3. La célula sulfutoria del alga estudiada es inclinada hacia el centro y acodada, en concordancia con los informes de C. virescens (^{Browne et al., 2020}), mientras que en C. diffusus esta célula es más corta e irregular (^{Sunpapao y Pitaloka, 2015}). También difiere de la célula de C. parasiticus, que es irregular y difícil de medir (^{Suto et al., 2014}).

En los análisis filogenéticos se integraron datos de los genes 18S e ITS de las tres especies relacionadas: C. diffusus, C. parasiticus y C. virescens de Asia, África y América. En este estudio no se encontraron secuencias del género Cephaleuros provenientes de México en la base de datos GenBank del National Center for Biotechnology Information (^{GenBank, 2023b}), pero sí de los Estados Unidos de América, incluso de zarzamora. Las secuencias de 18S del ADNr del alga fitopatógena de zarzamora en Michoacán se agrupan con las WH-P y WH-OCB3 de C. virescens de los Estados Unidos de América, cuyo hospedero es Rubus fruticosus L. (Fig. 4). Al compararlas, se encontró un alto porcentaje de similitud que oscila entre 96.7 y 100%. Estos especímenes de Michoacán y de los Estados Unidos de América se encuentran fuera de los agrupamientos considerados por ^{Fang et al. (2021)}, en los que se integraron secuencias de Asia y África. Los representantes de los nueve clados recuperados por ellos fueron incluidos en el análisis de este artículo, y las muestras de Cephaleuros virescens de zarzamora de México y Estados Unidos de América se separan claramente de ellos. Por lo tanto, las secuencias de C. virescens en el continente americano son distintas de las encontradas en Asia y África.

La filogenia de ITS y 18S del ADNr revela una falta de resolución que dificulta la distinción entre C. virescens, C. parasiticus e incluso C. diffusus. Esto se debe a la presencia de varias secuencias identificadas como estas especies en diferentes clados. Por lo tanto, la delimitación de las especies de Cephaleuros requiere un enfoque taxonómico integral que involucre la inclusión de ejemplares tipo de estas especies y la recolección de más muestras de las áreas donde se recolectaron los tipos (^{Fang et al., 2021}). Con base en esta información y en la concordancia de nuestras muestras con las características morfológicas y dimensiones descritas previamente para C. virescens por ^{Suto y Ohtani (2009)} y ^{Pitaloka et al. (2015)}, así como en la afinidad filogenética con las secuencias de Cephaleuros que infectan zarzamora de los Estados Unidos de América, hemos decidido designar a los organismos que causan la mancha naranja de zarzamora en las zonas colectadas de Michoacán como C. virescens sensu lato.

Las afectaciones en las zarzamoras causadas por Cephaleuros virescens se habían registrado exclusivamente en los Estados Unidos de América. El primer informe de esta enfermedad afectando los tallos se remonta a 1997 en Arkansas y Luisiana (^{Holcomb et al., 1998}). Con el tiempo, la enfermedad se ha extendido a otras regiones de ese país, incluyendo Georgia y Florida, y en 2020 se encuentra en el sureste de ese país a lo largo de la costa del Golfo (^{Browne et al., 2020}). En los Estados Unidos de América la enfermedad suele aparecer a principios de otoño y se expande durante el invierno y la primavera, con una mayor presencia en junio (^{Browne et al., 2020}).

Para México, en el caso de Chupio y Taretan, los productores refieren que la enfermedad de la mancha naranja está presente durante todo el año y afecta principalmente a las plantas de tercer o cuarto año de crecimiento. Su incidencia es más alta durante la temporada de lluvias (junio a septiembre), ya que las películas de agua en la planta, así como las escorrentías, sirven como medio para la movilidad de las zoosporas y su reproducción (^{Nelson, 2008}). El aire también actúa como medio de propagación, ya que las zoosporas de las plantas afectadas se desplazan hacia las nuevas primocañas al entrar en contacto unas con otras (^{Suto y Ohtani, 2011}).

En Taretan la producción de zarzamora ha disminuido y los costos de prevención de la enfermedad han aumentado (Comm. pers., 2019). Esto se debe a que se requiere incrementar la frecuencia de las fumigaciones: en lugar de cada cuatro a cinco días, cuando la enfermedad está en alta incidencia, se aumenta a una aplicación preventiva cada ocho días. Además, las plantas deben ser reemplazadas con mayor frecuencia (Comm. pers., 2019). Es de suma importancia llevar a cabo estudios sobre el proceso de infección y los mecanismos de control de esta alga, ya que provoca afectaciones secundarias en las plantas por el ataque de fitopatógenos oportunistas que han tomado relevancia, especialmente durante la temporada de lluvias y debido a su potencial asociación con la muerte de tallos y plantas (^{Joubert y Rijkenberg, 1971}; ^{Aboal y Werner, 2011}).

En conclusión, después de examinar las manchas naranjas en los tallos de zarzamora cv. Tupy en dos localidades ubicadas en la zona central de Michoacán, pudimos confirmar la presencia de estructuras algales multicelulares filamentosas. Estas estructuras presentaban esporangióforos pedicelados que sostenían varios esporangios laterales, los cuales a su vez eran sostenidos por una célula sulfutoria. Tras analizar las características, concluimos que el organismo causal de estas manchas corresponde al género de algas Cephaleuros. Los resultados encontrados son de importancia para el diagnóstico, así como para prever el desarrollo de métodos de control de esta enfermedad.