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INTRODUCCIÓN
El café (Coffea arabica L.) es un cultivo estratégico para México, ya que genera más de tres millones de empleos y representa 0.66 % del PIB agrícola nacional (SAGARPA, 2017). La superficie cultivada con este grano es de aproximadamente 680,120 hectáreas, siendo Chiapas (35.5 %), Veracruz (21.2 %), Oaxaca (17.8 %) y Puebla (10.2 %) los principales estados productores (SIAP, 2020). En los últimos años, la producción de café en México ha reportado su nivel mínimo desde que se tiene registro, debido a factores como la avanzada edad de las plantaciones, afectaciones climatológicas, mala nutrición y la roya del café causada por el hongo Hemileia vastatrix Berk. y Br., que durante el ciclo productivo 2012-2013 afectó severamente las zonas cafetaleras de los estados de Chiapas, Puebla y Veracruz (Renard y Larroa, 2017; USDA, 2018).
Hasta 2013, las variedades de café no resistentes a la roya del cafeto (Typica, Bourbon y Caturra Rojo) tenían una marcada dominancia en México, situación que llevó al uso constante de fungicidas para controlar esta enfermedad, lo que no sólo tuvo un efecto negativo en el costo de producción sino también en el ambiente (Renard y Larroa, 2017), es por ello que el gobierno mexicano implementó programas para aumentar la productividad del sector cafetalero creando viveros certificados para suministrar a los productores plantas de calidad resistentes a dicha enfermedad. La meta es renovar 250 mil hectáreas, para lo cual se requerirán 750 millones de plantas (USDA, 2018).
La renovación de plantaciones con materiales resistentes a la roya como la variedad Colombia es parte de la estrategia para reducir los efectos de esta enfermedad (USDA, 2018); no obstante, la tasa de reproducción de los sistemas tradicionales de propagación mediante semillas o esquejes no permite cubrir la demanda de plantas que se tiene para llevar a cabo dicha renovación (Kumar et al., 2006).
El cultivo de tejidos mediante la embriogénesis somática ha permitido la propagación a gran escala de distintas especies vegetales (Campos et al., 2017). Diversos protocolos para la propagación de café han sido desarrollados mediante embriogénesis somática (Aga y Khillare, 2017; Etienne et al. 2013; 2018; Georget et al., 2017; Kahia et al., 2016; Montes-Cruz et al., 2017); no obstante, la baja tasa de maduración, germinación y conversión de los embriones en plantas son algunos de los factores que limitan su aplicación en los programas de producción y mejoramiento de café (Rezende et al., 2011).
Si bien existen numerosos trabajos sobre embriogénesis somática en el género Coffea, pocos se han centrado en mejorar la maduración de los embriones. Reguladores de crecimiento y osmóticos han sido utilizados para promover la maduración de los embriones somáticos de café y otras especies. Al respecto, Pereira et al. (2007) reportaron incremento en el porcentaje de maduración de embriones somáticos de C. arabica var. Acaiá cuando adicionaron ácido giberélico (AG3) al medio de cultivo, en tanto que en C. canephora var. Robusta, hubo mejora en la maduración de los embriones en presencia de ácido abscísico (ABA) o una combinación de bencilaminopurina (BAP) y sacarosa (Etienne, 2005; González et al., 2000). Altas concentraciones de sacarosa en el medio (50 a 90 g L-1) también incrementaron la tasa de maduración de embriones somáticos de Juglans regia y Picea abies (Businge et al., 2013; Hazubska-Przybyl et al., 2016; Vahdati et al., 2008); asimismo, la adición de agentes osmóticos como polietilenglicol (PEG) al medio de cultivo mejoró la maduración de embriones somáticos de Leucojum aestivum, P. abies y Carica papaya (Businge et al., 2013; Ptak et al., 2013; Vale et al., 2014). Por lo anterior, el objetivo de la presente investigación fue determinar el efecto de reguladores del crecimiento y agentes osmóticos en la maduración y germinación de embriones somáticos de café var. Colombia y evaluar en condiciones ex vitro las características fisiológicas de las plantas regeneradas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Inducción de la embriogénesis somática
La inducción y diferenciación de embriones somáticos se llevó a cabo siguiendo el protocolo reportado por Avila-Victor et al. (2018). Segmentos de 1 cm2 de hojas previamente desinfestadas se cultivaron durante dos meses en un medio que contenía las sales del medio de Murashige y Skoog (1962) (MS), 0.5 mg L-1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 1.1 mg L-1 de BAP, 100 mg L-1 de ácido cítrico, 200 mg L-1 de ácido ascórbico, 30 g L-1 de sacarosa y 5.2 g L-1 de Phytagel. Los callos generados se transfirieron a un medio elaborado con las sales del medio reportado por Yasuda et al. (1985) modificadas, 1.1 mg L-1 de BAP y 30 g L-1 de sacarosa. El pH de los medios se ajustó a 5.7 o 6.3 y fueron esterilizados durante 15 min en autoclave a 121 °C. Luego de cuatro meses, los embriones en etapa globular y torpedo temprano fueron colectados para su maduración (Figura 1 A).
Figura 1. Embriogénesis somática indirecta en C. arabica var. Colombia. A) formación de embriones somáticos a partir de callos embriogénicos, B) embriones somáticos en etapa globular, C) embriones somáticos en etapa torpedo temprano, D) germinación de un embrión proveniente de un medio de maduración con 50 g L-1 de sacarosa, E) conversión in vitro de una plántula de café en sustrato vermiculita:perlita, F) planta de café después de 90 días de cultivo en invernadero.
Maduración de los embriones somáticos
Los embriones somáticos en etapa globular se cultivaron durante 40 días en cajas Petri de 60 × 15 mm que contenían 15 mL de medio formulado con las sales de Yasuda et al. (1985) modificadas, 0.2 mg L-1 de BAP, 0.2 mg L-1 de ácido indolacético (AIA), 30 g L-1 de sacarosa, 2.3 g L-1 de Phytagel, además de ácido abscísico (ABA) (2, 3 y 4 mg L-1), polientilenglicol 8000 (PEG 8000) (50 y 75 g L-1), 1.38 g L-1 de ácido salicílico (ASA) o sacarosa (30, 50, 60 y 80 g L-1) (Figura 1 B).
Para evaluar la maduración a partir de embriones en etapa torpedo temprano se realizaron dos experimentos; en el primero, los embriones se cultivaron durante 40 d en cajas Petri con 15 mL de los mismos medios utilizados para embriones globulares, con excepción de los que contenían 50 y 60 g L-1 de sacarosa (Figura 1C). En el segundo experimento, los embriones torpedo fueron colocados en cajas Petri con medio Yasuda más 2.3 g L-1 de Phytagel, 30 g L-1 de sacarosa y dos combinaciones de reguladores de crecimiento: 1) 0.7 mg L-1 de AG3 y 0.3 mg L-1 de AIA, y 2) 1.0 mg L-1 de AG3 y 0.5 mg L-1 de AIA; ambos experimentos fueron comparados con un testigo que contenía un medio basal Yasuda con 0.2 mg L-1 de BAP, 0.2 mg L-1 de AIA y 30 g L-1 de sacarosa.
El pH de todos los medios fue ajustado a 6.3; los cultivos fueron incubados en una cámara de crecimiento a 25 ± 2 oC y 16 h de luz (intensidad lumínica de 80 µmol m-2 s-1). Después de 40 días se evaluó el número de embriones que alcanzaron la etapa torpedo tardío o cotiledonar (embriones maduros); además, se midió el potencial osmótico de los mismos debido a que reportes previos (Márquez-Martín et al., 2011; Martínez et al., 2017) relacionaron la disminución del potencial osmótico de los embriones con su maduración. Para evaluar esta variable, embriones maduros se depositaron en tubos Eppendorf y luego en nitrógeno líquido para extraer el contenido líquido intracelular, el cual fue colocado en un osmómetro Vapro (Wescor Vapor Pressure Osmometer 5520, Champaign, Illinois, EUA). La evaluación del potencial osmótico se basó en cuatro repeticiones por tratamiento, siendo una repetición un tubo con diferente número de embriones. No fue posible determinar el potencial osmótico de los embriones globulares correspondientes a los tratamientos con 50 y 60 g L-1 de sacarosa, así como el de los embriones torpedo temprano del segundo experimento, debido a que no se disponía de un número suficiente de éstos.
Germinación de embriones somáticos
Sólo los embriones que lograron madurar en los tratamientos de maduración fueron cultivados en viales de cristal con 7 mL de medio de germinación líquido elaborado con las sales basales de Yasuda modificadas, y suplementado con 0.25 mg L-1 de AIA, 0.25 mg L-1 de BAP y 30 g L-1 de sacarosa, ajustando el pH del medio a 6.3. Durante esta fase los cultivos permanecieron en un agitador orbital a 100 rpm dentro de una cámara de crecimiento a 25 ± 2 oC y 16 h de luz (intensidad lumínica de 80 µmol m-2 s-1). Después de 60 días se determinó el número de embriones somáticos germinados (embriones con protrusión de la radícula y cotiledones extendidos) con respecto al número de embriones que alcanzaron la madurez (Germinación M) y en relación con número inicial de embriones cultivados en los medios de maduración (Germinación I). Los embriones que germinaron se colocaron en frascos con 30 mL de una mezcla de vermiculita y perlita (3:1), con tamaño de partícula de 0.25 mm esterilizada durante 40 min a 121 ºC para promover su conversión; a la mezcla se agregaron 15 mL de medio de cultivo MS líquido al 50 % y 20 g L-1 de sacarosa, sin reguladores de crecimiento.
Aclimatación y crecimiento de plantas
Cuando las plantas alcanzaron 2 cm de longitud y al menos 3 pares de hojas fueron transferidas a vasos de poliestireno de 250 mL con dos mezclas de sustratos: 1) perlita-turba-tezontle (1:1:1) y 2) turba-tezontle (2:1). Los vasos se llevaron al invernadero y se cubrieron con bolsas de plástico, las cuales fueron retiradas después de 15 días. Las plantas se regaron cada tres días con solución Steiner (1984) al 25 %. Después de 90 días se evaluó la supervivencia, tamaño de plúmula y número de hojas. Para determinar el comportamiento de las plantas regeneradas en condiciones ex vitro después de 110 d de cultivo se evaluaron las siguientes variables fisiológicas: área foliar (Antunes et al., 2008), tasa instantánea de fotosíntesis (A), conductancia estomática (gs), transpiración (E) y concentración interna de CO2 (Ci) con ayuda de un analizador de gases en infrarrojo IRGA (LICOR-6400 XT Portable Photosynthesis System, Lincoln, Nebraska, EUA).
Diseño experimental y análisis estadístico
En los experimentos de maduración se utilizó un diseño experimental completamente al azar (DECA) con 10 medios de maduración (tratamientos) para los embriones globulares y 6 repeticiones (una caja con 30 embriones); 8 medios de maduración para embriones torpedo del primer experimento con 6 repeticiones (una caja con 20 embriones) y 3 medios de maduración para los torpedo del segundo experimento con 6 repeticiones (una caja con 10 embriones). Para la germinación se empleó un DECA desbalanceado con 9 medios de maduración para los embriones globulares, 2 medios de maduración para los embriones torpedo del primer experimento y 2 medios para los torpedo del segundo experimento. Todos los experimentos tuvieron diferente número de repeticiones por tratamiento, siendo una repetición un vial con diferente número de embriones maduros. En las fases de maduración y germinación el análisis de los datos se hizo con regresión logística y la comparación de medias mediante la prueba de LSMeans (0.05) mediante el paquete estadístico SAS versión 9.5 (SAS Institute, 2002). Para la variable potencial osmótico el análisis se llevó a cabo mediante ANOVA y la comparación de medias mediante la prueba de Tukey (P ≤ 0.05), mientras que para la fase de aclimatación se usó un DECA con dos sustratos y cuatro repeticiones considerando una planta como una repetición. El análisis de los datos se hizo mediante la prueba t de Student.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto de reguladores de crecimiento y osmóticos en la maduración de los embriones somáticos
Durante la maduración, los embriones somáticos sufren cambios morfológicos y bioquímicos, como el aumento en la talla y la deposición de sustancias de reserva, esenciales para su posterior desarrollo, germinación y conversión en plantas fotoautótrofas (Aslam et al., 2011; Etienne, 2005; Márquez-Martín et al., 2011).
Los resultados obtenidos en la presente investigación mostraron que el porcentaje de maduración de los embriones globulares cultivados en el medio con 2, 3 o 4 mg L-1 de ABA estuvo por debajo (6.7-11.7 %) de lo observado en el testigo (19.4 %) (Cuadro 1); asimismo, los embriones globulares expuestos a PEG no mostraron porcentajes de maduración significativamente mejores (21.7-25.6 %) que el testigo (Cuadro 1). Cuando se incluyeron 1.38 g L-1 de ASA en el medio de cultivo, sólo 1.7 % de los embriones lograron madurar; en contraste, 50, 60 u 80 g L-1 de sacarosa en el medio de cultivo incrementaron significativamente (45.9-81.7 %) la maduración de los embriones globulares con respecto al testigo y a los otros tratamientos, siendo los embriones de los tratamientos con sacarosa los que registraron los niveles más altos de maduración (Cuadro 1).
Cuadro 1. Porcentaje de embriones maduros globulares y torpedo temprano de C. arabica var. Colombia cultivados en distintos tratamientos de maduración durante 40 días.
| Medio de maduración | Embriones globulares | Embriones torpedo (Primer experimento) |
Embriones torpedo (Segundo experimento) |
|---|---|---|---|
| Testigo | 19.4 ± 16.0 d | 10.0 ± 12.0 b | 5.0 ± 9.0 b |
| ABA 2 mg L-1 | 11.7 ± 13.0 e | 2.5 ± 6.0 c | -- |
| ABA 3 mg L-1 | 6.7 ± 10.0 e | 2.5 ± 6.0 c | -- |
| ABA 4 mg L-1 | 8.9 ± 12.0 e | 2.5 ± 6.0 c | -- |
| PEG 8000 50 g L-1 | 25.6 ± 18.0 d | 11.7 ± 13.0 ab | -- |
| PEG 8000 75 g L-1 | 21.7 ± 17.0 d | 15.8 ± 15.0 ab | -- |
| ASA 1.38 g L-1 | 1.7 ± 5.0 f | 0.8 ± 4.0 c | -- |
| Sacarosa 50 g L-1 | 81.7 ± 16.0 a | -- | -- |
| Sacarosa 60 g L-1 | 67.8 ± 19.0 b | -- | -- |
| Sacarosa 80 g L-1 | 45.9 ± 20.0 c | 19.2 ± 16.0 a | -- |
| 0.7 mg L-1 AG3 + 0.3 mg L-1 AIA | -- | -- | 15.0 ± 15.0 b |
| 1.0 mg L-1 AG3 + 0.5 mg L-1 AIA | -- | -- | 45.0 ± 20.0 a |
Fuente: Testigo: 30 g L-1 de sacarosa, ABA: ácido abscísico, PEG 8000: polietilenglicol 8000, ASA: ácido salicílico, AIA: ácido indolacético, AG3: ácido giberélico. Medias (+ error estándar) con letras iguales dentro de una columna no son estadísticamente diferentes (LSMeans, P ≤ 0.05).
Por otro lado, los embriones torpedo del primer experimento cultivados en las distintas dosis de ABA y ASA mostraron porcentajes de maduración inferiores (0.8-2.5 %) al testigo (10.0 %), en tanto que el observado en los embriones cultivados en PEG no fue significativamente diferente del testigo. Asimismo, en los embriones torpedo cultivados con 80 g L-1 de sacarosa (19.2 %) se registró un porcentaje de maduración significativamente mayor que en aquellos expuestos a las distintas concentraciones de ABA (2.5 %), ASA (0.8 %) y el testigo (Cuadro 1); en contraste, para los embriones torpedo del segundo experimento, el porcentaje de maduración más alto (45 %) se observó con la combinación de 1.0 mg L-1 de AG3 y 0.5 mg L-1 de AIA (Cuadro 1).
González et al. (2000) encontraron que el adicionar 1 mg L-1 de ABA al medio de cultivo logró generar el mayor porcentaje de maduración (56.1 %) de los embriones somáticos de C. canephora var. Robusta; por otro lado, en C. papaya, Kalam et al. (2012) observaron que el mayor porcentaje de maduración y acumulación de materia seca se registró cuando los embriones se cultivaron en presencia de 60 g L-1 de PEG 3350; no obstante, algunos autores han reportado que altos niveles de este compuesto (47.0 a 75.0 g L-1) pueden tener un efecto negativo en la maduración al restringir la acumulación de proteínas LEA (Late embryogenesis abundant), sacarosa y almidón (Businge et al., 2013; Tikkinen et al., 2018).
Etienne (2005) utilizó un medio líquido con 0.3 mg L-1 de BAP y 40 g L-1 de sacarosa para inducir la maduración de embriones somáticos de C. canephora var. Robusta y observó que después de ocho semanas 86 % de éstos alcanzaron la madurez. En Psidium guajava y P. dactylifera, 50 o 90 g L-1 de sacarosa en el medio de cultivo mejoró la maduración de los embriones (Rai et al., 2007; Sghaier-Hammami et al., 2010); asimismo, el incluir 50 o 60 g L-1 de sacarosa en el medio promovió la maduración (60 a 100 %) de los embriones somáticos de P. abies, Sapindus mukorossi, Agave angustifolia y Crocus vernus (Kubeš et al., 2014; Reyes-Díaz et al., 2017; Singh et al., 2015; Sivanesan et al., 2012). Se sabe que cuando se incluyen concentraciones altas de sacarosa en los medios de cultivo, ésta entra en los tejidos de los embriones y es hidrolizada por la enzima invertasa-apoplástica, promoviendo la deposición de glucosa, fructosa y almidón en el embrión (Iraqi et al., 2005). Lo anterior hace que la presión osmótica del embrión aumente induciendo la expresión de los genes que codifican a la glutamina-sintetasa y glutamato-sintasa, involucradas en el metabolismo del nitrógeno y la deposición de proteínas de almacenamiento como globulinas, prolaminas y glutelinas, requeridas para que el embrión madure y germine (Bartos et al., 2018; Cangahuala-Inocente et al., 2009; Iraqi y Tremblay, 2001; Kubeš et al., 2014; Montalbán et al., 2010; Shewry y Halford, 2002; Stasolla et al., 2003).
Por otro lado, en C. arabica cv. Acaiá, Pereira et al. (2007) observaron un incremento en la maduración de los embriones (9-38 embriones maduros) directamente proporcional al aumento en la concentración de AG3 (2.5-20 mg L-1); asimismo, la maduración de los embriones de Citrus reticulata Blanco aumentó (4-6 %) cuando se adicionaron al medio 4 mg L-1 de AG3 (Firdiana et al., 2015). Por su parte, da Silva et al. (2018) registraron 50 % de embriones maduros de Byrsonima intermedia al exponerlos a 10 mg L-1 de AG3.
La diferencia en la respuesta de maduración entre las dos etapas embrionarias evaluadas en C. arabica var. Colombia (globular y torpedo) puede ser debida a los tipos de células presentes en los embriones. Quiroz-Figueroa et al. (2002) mencionaron que los embriones globulares presentan alta actividad mitótica que permite el crecimiento y desarrollo embrionario, mientras que en embriones torpedo y cotiledonares existen células con un grado de diferenciación mayor. De la misma manera, se ha observado que los niveles de proteínas, carbohidratos y de reguladores de crecimiento endógenos de los embriones en estado globular y torpedo cultivados bajo las mismas condiciones son diferentes, lo cual puede ocasionar una respuesta diferencial a las condiciones de cultivo (Bartos et al. 2018). El hecho de que en la presente investigación mayor número de embriones globulares que de embriones torpedo temprano haya alcanzado la madurez indica que es mejor inducir la maduración, desde la etapa globular, reduciendo con ello tiempo, insumos y mano de obra necesarios.
Efecto de reguladores de crecimiento y osmóticos en el potencial osmótico de embriones somáticos
Algunos autores afirman que una disminución del potencial osmótico de los embriones somáticos induce cambios morfológicos y bioquímicos que promueven la maduración (Márquez-Martín et al., 2011; Martínez et al., 2017). En la presente investigación no se encontraron diferencias significativas entre el potencial osmótico de los embriones globulares sometidos a los distintos tratamientos con ABA, PEG, ASA, sacarosa (-2.28 a -3.10 MPa) y el testigo (-2.13 MPa) (Cuadro 2). Para los embriones torpedo (primer experimento) se registró una variación en el potencial osmótico de -1.54 a -2.37 MPa para los distintos tratamientos, sin ser significativamente diferentes del testigo (-1.83 MPa) (Cuadro 2). Aun cuando no hubo diferencias significativas en los potenciales osmóticos de los embriones globulares y torpedo (primer experimento) expuestos a los distintos tratamientos, sí se observaron diferencias en los porcentajes de maduración, encontrándose el valor más alto en los embriones globulares cultivados en presencia de 50 a 80 g L-1 de sacarosa (Cuadro 1). Al respecto, Reyes-Díaz et al. (2017) señalaron que en el medio de maduración la sacarosa en altas concentraciones funciona como fuente de energía y como regulador osmótico, pudiendo mejorar la maduración y el desarrollo de los embriones somáticos. En el mismo tenor, Elmaghrabi et al. (2017) encontraron que exponer embriones somáticos de Medicago truncatula a 100 g L-1 de PEG 6000 no causó cambios en el potencial osmótico celular, pero sí generó diferencias en su desarrollo. Otros autores señalan que los agentes osmóticos, como el PEG incluídos, en los medios de cultivo hacen más negativo el potencial osmótico de los embriones induciendo cambios en la división celular, morfología celular, adquisición de la tolerancia al estrés, así como en la expresión de genes relacionados con el desarrollo de los embriones como el SERK1 (cinasa receptora en la embriogénesis somática) (Elmaghrabi et al., 2013).
Cuadro 2. Potencial osmótico de embriones de C. arabica var. Colombia después de 40 días de cultivo en los medios de maduración.
| Medio de maduración | Embriones globulares | Embriones torpedo temprano (Primer experimento) |
|---|---|---|
| Potencial osmótico (MPa) |
Potencial osmótico (MPa) |
|
| Testigo | -2.13 ± 0.63 a | -1.83 ± 0.39 a |
| ABA 2 mg L-1 | -2.78 ± 0.19 a | -2.37 ± 0.39 a |
| ABA 3 mg L-1 | -2.91 ± 0.33 a | -1.71 ± 0.27 a |
| ABA 4 mg L-1 | -2.28 ± 0.82 a | -1.54 ± 0.10 a |
| PEG 8000 50 g L-1 | -2.57 ± 0.61a | -2.01 ± 0.76 a |
| PEG 8000 75 g L-1 | -2.93 ± 2.35 a | -2.01 ± 0.36 a |
| ASA 1.38 g L-1 | -3.10 ± 0.29 a | -2.27 ± 0.59 a |
| Sacarosa 50 g L-1 | -- | -- |
| Sacarosa 60 g L-1 | -- | -- |
| acarosa 80 g L-1 | -2.31 ± 0.52 a | -2.23 ± 0.56 a |
Fuente: Testigo: 30 g L-1 de sacarosa, ABA: ácido abscísico, PEG 8000: polietilenglicol 8000, ASA: ácido salicílico. Medias (± error estándar) con letras iguales dentro de una columna no son estadísticamente diferentes (LSMeans, P ≤ 0.05).
Efecto de reguladores de crecimiento y osmóticos en la germinación de embriones somáticos
En esta fase no se consideraron los tratamientos con bajo número de embriones que alcanzaron la madurez. La germinación de los embriones globulares que lograron madurar (Germinación M) provenientes de los medios con distintas dosis de ABA (14.3-25.0 %) fue inferior al testigo (60.0 %); la misma respuesta se observó con los embriones globulares que se expusieron a PEG (6.5-7.7 %) (Cuadro 3). Los bajos porcentajes de germinación de los embriones de la variedad Colombia expuestos a PEG 8000 concuerdan con los resultados de Rudiyanto et al. (2014), quienes observaron que al utilizar concentraciones de PEG superiores a 50 g L-1 la maduración de los embriones somáticos de Jatropha curcas se inhibió; posiblemente, el PEG a las concentraciones probadas generó un estrés osmótico por arriba de lo que los embriones soportaban, lo cual evitó que éstos pudieran continuar con su desarrollo y acumularan sustancias de reserva necesarias para la germinación (Carlsson et al., 2019).
Cuadro 3. Germinación de embriones somáticos de C. arabica var. Colombia después de 60 días de cultivo en el medio de germinación.
| Medio de maduración | Embriones globulares | Embriones torpedo temprano (Primer experimento) |
Embriones torpedo temprano (Segundo experimento) |
|||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Germinación M† (%) |
Germinación I†† (%) |
Germinación M (%) |
Germinación I (%) |
Germinación M (%) |
Germinación I (%) |
|
| Testigo | 60.0 ± 22.0 ab | 11.7 ± 13.0 c | 100 ± 0.00 a | 10.0 + 12.0 a | 66.7 + 33.0 a | 3.3 ± 7.0 a |
| ABA 2 mg L-1 | 14.3 ± 16.0 d | 1.7 ± 5.0 d | -- | -- | -- | -- |
| ABA 3 mg L-1 | 25.0 ± 19.0 cd | 1.7 ± 5.0 d | -- | -- | -- | -- |
| ABA 4 mg L-1 | 18.3 ± 16.0 cd | 1.7 ± 5.0 d | -- | -- | -- | -- |
| PEG 8000 50 g L-1 | 6.5 ± 14.0 d | 1.7 ± 5.0 d | -- | -- | -- | -- |
| PEG 8000 75 g L-1 | 7.7 ± 15.0 d | 1.7 ± 5.0 d | -- | -- | -- | -- |
| Sacarosa 50 g L-1 | 66.0 ± 19.0 a | 53.9 ± 20.0 a | -- | -- | -- | -- |
| Sacarosa 60 g L-1 | 43.4 ± 20.0 bc | 29.4 ± 19.0 b | -- | -- | -- | -- |
| Sacarosa 80 g L-1 | 38.3 ± 20.0 bc | 17.2 ± 15.0 c | 73.9 ± 20.0 b | 14.2 ± 14.0 a | -- | -- |
| 1.0 mg L-1 AG3 + 0.5 mg L-1 AIA | -- | -- | -- | -- | 44.4 ± 20.0 a | 20.0 ± 28.0 a |
Fuente: †Germinación M: con respecto a los embriones que maduraron, ††Germinación I: con respecto al número inicial de embriones que se colocaron en los medios de maduración. Testigo: 30 g L-1 de sacarosa, ABA: ácido abscísico, PEG 8000: polietilenglicol 8000, ASA: ácido salicílico, AIA: ácido indolacético, AG3: ácido giberélico. Medias (± error estándar) con letras iguales dentro de una columna no son estadísticamente diferentes (LSMeans, P ≤ 0.05).
La germinación de los embriones globulares que maduraron (Germinación M), los cuales permanecieron en presencia de 50 a 80 g L-1 de sacarosa (38.3-66.0 %), no fue significativamente diferente de la observada en el testigo (60.0 %); no obstante, cuando se calculó la germinación considerando el número de embriones iniciales en el medio de maduración (Germinación I), tanto el tratamiento con 50 g L-1 (53.9 %) como con 60 g L-1 (29.4 %) de sacarosa fueron significativamente superiores al testigo (11.7 %) y a los demás tratamientos (Cuadro 3; Figura 1D).
Martínez et al. (2015) señalaron que la sacarosa (60 g L-1) fue un factor importante en el desarrollo de los embriones de Quercus rubra, al promover el incremento en tamaño y la acumulación de almidón en sus cotiledones; asimismo, Montalbán et al. (2010) encontraron que 80 % de los embriones somáticos de Pinus radiata lograrón germinar cuando se adicionaron 60 g L-1 de sacarosa al medio de maduración; en contraste, Jalali et al. (2017) registraron sólo 14.9 % de germinación en Schisandra chinensis cuando los embriones se expusieron a 60 g L-1 de sacarosa, en tanto que en Tagetes erecta la germinación máxima (67.5 %) se observó en medios con 45 g L-1 de sacarosa (Vanegas et al., 2017).
La germinación de los embriones torpedo del primer experimento, que provenían del tratamiento con 80 g L-1 de sacarosa y que alcanzaron la madurez (73.9 %), estuvo por debajo de la observada en el testigo (100.0 %) (Germinación M) (Cuadro 3), en tanto que la observada en los embriones torpedo del segundo experimento (1 mg L-1 de AG3 + 0.5 mg L-1 de AIA) (44.4 %) no fue significativamente distinta del testigo (66.7 %) cuando sólo se consideraron los embriones maduros (Germinación M), ni cuando se calculó con respecto al número inicial de embriones (Germinación I) (Cuadro 3). Carlsson et al. (2019) afirmaron que sólo los embriones que hayan acumulado suficientes sustancias de reserva en la maduración tendrán la capacidad de germinar y convertirse en plantas. De lo anterior, se puede inferir que la capacidad de germinación de los embriones de café está en función de su grado de madurez.
Efecto de los sustratos en la aclimatación y crecimiento de las plantas
Supervivencia, tamaño de plúmula y número de hojas
Después de 90 días en condiciones de invernadero todas las plantas sobrevivieron en ambos sustratos (Figura 1F). Los resultados encontrados en este estudio son similares a los de Kahia et al. (2016), quienes registraron 98 % de supervivencia en vitroplantas de C. arabica cultivadas en suelo y estiércol (3:1) durante 30 días. Por otro lado, no se observaron diferencias significativas en el tamaño de la plúmula de las plantas cultivadas en perlita:turba:tezontle (4.9 cm) con respecto a las que fueron cultivadas en turba:tezontle (4.5 cm). El tamaño alcanzado por las plantas de C. arabica var. Colombia fue similar al de las plantas de C. arabica var. Catuaí cultivadas en turba o en suelo (4.8 y 5.4 cm, respectivamente) (Gawad et al., 2012; Isaac et al. 2014). Las diferencias observadas pueden deberse, por un lado, a que la variedad Colombia es de porte bajo y crecimiento lento (López-García et al., 2016), y por otro, a las condiciones climáticas del sitio del experimento (Texcoco, Estado de México), las cuales no son óptimas para cultivar café. Asimismo, el número de hojas de las plantas cultivadas en perlita:turba:tezontle (15.5) no fue significativamente distinto del de aquellas crecidas en turba:tezontle (14.5), pero sí mayor al reportado por Gawad et al. (2012) (3.3-3.67) en plantas de la var. Catuaí.
Intercambio de gases y área foliar
Debido a que las condiciones heterotróficas durante el cultivo in vitro pueden causar alteraciones fisiológicas en las plantas y afectar su comportamiento en condiciones ex vitro (Chandra et al., 2010; Kumar y Rao, 2012) y a que el tipo de sustrato también influye en dicho comportamiento (Afreen et al., 2002; Aga y Khillare, 2017; Maciel et al., 2016), se midió el intercambio de gases durante la fotosíntesis, así como el área foliar de las plantas regeneradas cultivadas en las dos mezclas de sustratos.
La tasa fotosintética de las plantas crecidas en perlita:turba:tezontle no fue significativamente mayor que la encontrada en las plantas cultivadas en turba:tezontle (Cuadro 4). Es importante mencionar que en el presente trabajo la radiación al momento de las mediciones fue muy baja (143.84 μmol m2 s-1) y pudo haber afectado la tasa fotosintética. Li et al. (2015) mencionaron que la actividad fotosintética depende de factores ambientales como la radiación interceptada por el dosel y que cuando ésta es baja, la tasa fotosintética se reduce. En cuanto a la conductancia estomática, ésta fue de 0.11 μmol H2O m-2 s-1 en las plantas cultivadas en perlita:turba:tezontle, valor significativamente superior al encontrado en aquellas crecidas en turba:tezontle (Cuadro 4); lo anterior indica que en estas últimas hubo un menor intercambio gaseoso. Por su parte, la concentración interna de CO2 de las plantas cultivadas en perlita:turba:tezontle fue significativamente superior (369.72 mmol CO2 mol-1) a la registrada en las plantas crecidas en turba:tezontle (Cuadro 4); lo anterior pudo deberse a que en estas últimas hubo menor conductancia estomática y menor entrada de CO2, agotándose el CO2 interno.
Cuadro 4. Comparación de medias de componentes del intercambio gaseoso entre sustratos de aclimatación.
| Sustrato | A | gs | E | Ci | Cociente largo/ancho | Área foliar (cm2) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| PTT | 1.51 ns | 0.11* | 2.45* | 369.72* | 2.0 ns | 24.07 |
| TT | 1.88 | 0.06 | 1.48 | 330.14 | 2.0 | 24.99 ns |
Fuente: PTT: perlita-turba-tezontle, TT: turba-tezontle, A: tasa fotosintética (μmol CO2 m-2 s-1), gs: conductancia estomática (μmol H2O m-2 s-1), E: transpiración (mmol H2O m-2 s-1), Ci: concentración interna de CO2 (mmol CO2 mol-1). Datos tomados a los 110 días después de cultivo; ns: diferencias no significativas, *: diferencias significativas (t-Student, P ≤ 0.05).
En café, se han realizado estudios para la estimación del área foliar en plantas adultas obtenidas por semilla; por ello, fue necesario estimar el cociente largo/ancho relacionado con el área foliar. En el Cuadro 4 se muestra que no hubo diferencias significativas en el valor del cociente entre el promedio del largo y el promedio del ancho de las hojas de ambos tratamientos; de igual manera, se observa que el área foliar de las plantas crecidas en turba:tezontle (24.99 cm2) no fue significativamente superior al de las plantas crecidas en perlita:turba:tezontle (24.07 cm2). Al respecto, el área foliar de plantas de C. arabica var. Castillo provenientes de semilla, cultivadas en campo, fue similar (26.7 cm) al observado en las plantas de la var. Colombia (24.99 cm) (Unigarro-Muñoz et al., 2015). Lo anterior indica que las condiciones de cultivo probadas en la presente investigación permitieron regenerar plantas fisiológicamente funcionales con características similares a las plantas obtenidas a partir de semilla, lo cual es deseable en un programa de propagación a escala comercial.
Diversos protocolos sobre embriogénesis somática de café han sido desarrollados (Aga y Khillare, 2017; Etienne et al. 2013; 2018; Gatica-Arias et al., 2008; Georget et al., 2017; Kahia et al., 2016; Montes-Cruz et al., 2017); no obstante, para la variedad Colombia sólo se conoce un reporte (Avila-Victor et al., 2018), en el cual los aspectos relacionados con la maduración y germinación de los embriones somáticos se abordaron someramente; asimismo, existe evidencia de que la respuesta al cultivo in vitro depende del genotipo, por lo que las condiciones de cultivo deberán establecerse para cada variedad (López-Gómez et al., 2010; Santana-Buzzy et al., 2007).
La baja tasa de maduración, geminación y conversión limita la aplicación de los protocolos de embriogénesis en los programas de producción de plantas a escala comercial, tanto en la var. Colombia como en otras especies y cultivares de café, por lo que se requieren más estudios al respecto (Carlsson et al., 2019). Los resultados obtenidos en el presente estudio proveen información para la optimización de protocolos de multiplicación de C. arabica var. Colombia mediante embriogénesis somática.
CONCLUSIONES
Altas concentraciones de sacarosa (50-80 g L-1) en el medio de cultivo aumentan significativamente la tasa de maduración de embriones somáticos globulares y torpedo temprano de C. arabica var. Colombia. El inducir la maduración de los embriones desde la etapa globular puede reducir el tiempo, insumos y mano de obra requeridos. El potencial osmótico de los embriones no tiene relación directa con su maduración. El grado de madurez de los embriones somáticos influye en su capacidad para germinar y convertirse en plantas. Las plantas regeneradas son morfológica y fisiológicamente normales bajo condiciones ex vitro y tienen alta capacidad para adaptarse a dichas condiciones.
