Monitoreo de roya de la hoja y toma de muestras

Se monitorearon inicialmente 171 campos piloto georreferenciados en el Bajo Río Mayo (Huatabampo Sonora, México); adicionalmente, se incluyeron otros lotes sembrados con Cirno C2008 que cada semana fueron monitoreados desde la identificación inicial de la enfermedad (semana 5), con el fin de determinar el progreso de la epidemia hasta que la mayoría de los lotes sembrados con Cirno C2008 fueron inspeccionados por presencia o ausencia de la roya de la hoja. Se eligieron campos en forma aleatoria para la toma de muestras de hojas con la enfermedad visible. Durante el ciclo del cultivo se colectaron más de 300 muestras de hojas con signos de la enfermedad. Las muestras fueron procesadas y analizadas en los invernaderos del CIMMYT y, cuando fue conveniente, una segunda muestra fue analizada en el Laboratorio Nacional de Royas y Otras Enfermedades de Cereales (LANAREC) del INIFAP.

Obtención de aislamientos monopustulares e identificación de razas

Plántulas de nueve días de las variedades Altar C84 y Cirno C2008 fueron tratadas con ácido maleico (5 mg en 50 mL de agua por maceta de 200 mL) y se inocularon con esporas recolectadas de cada muestra de campo. El tratamiento con ácido maleico restringe el crecimiento de las plántulas y mejora la producción de esporas. Las macetas inoculadas se colocaron en una cámara de rocío durante 16 h con temperaturas de 18 a 20 °C, luego se colocaron en cámaras de plástico transparente en un invernadero mantenido entre 20 y 23 °C. Se aislaron tres pústulas (uredias) individuales de cada muestra de campo; cada aislamiento se incrementó en Altar C84 y en Cirno C2008 en cámaras de plástico transparente separadas para generar suficiente inóculo y posteriormente inocular plántulas de 9 d de edad de la serie de diferenciales de roya de la hoja (Cuadro 1). La mayoría de las diferenciales con genes conocidos de resistencia a la roya de la hoja (genes Lr) fueron desarrolladas por el Dr. P. L. Dyck en Winnipeg, Canadá, y están en un fondo Thatcher. También se incluyeron otros probadores de trigo cristalino, incluyendo Altar C84, Línea ND (DW7276), Gaza, Guayacan INIA (Lr61), Samayoa C2004, Júpare C2001, Banámichi C2004, Camayo y Cirno C2008. Las plantas se inocularon mediante aspersión con urediniosporas suspendidas en aceite mineral ligero (Soltrol 170, Chevron Phillips Chemical Co., Woodlands, Texas, EUA) y luego se colocaron en una cámara de rocío, como se describió anteriormente, antes de transferirse a un invernadero mantenido entre 20 y 23 °C.

El tipo de infección mostrado por las líneas de las diferenciales se evaluó 12 días después de la inoculación utilizando la escala de tipo de infección de 0 a 4 descrita por ^{Roelfs et al. (1992)}. La nomenclatura de la raza se ajusta a lo indicado por ^{Long y Kolmer (1989)} y ^{Singh (1991)} y utiliza diferenciales para 20 genes de resistencia agrupados en cinco conjuntos, como sigue: (I) Lr1, 2a, 2c, 3; (II) Lr9, 16, 24, 26; (III) Lr3ka, 11, 17, 30; (IV) Lr3bg, 13, 15, 18; y (V) Lr10, 19, 23, 27+31. En la determinación de las razas se decidió incorporar dos juegos adicionales de diferenciales: (VI) Lr14a, 28, 61, 72 ^{(Delgado-Sánchez et al., 2016)}, y el conjunto (VII) constituido por LrGz, 33, Cam, 51 para validarse en el presente estudio. También se caracterizaron dos aislamientos monopustulares en la misma serie de diferenciales en un invernadero mantenido a una temperatura entre 15 y 18 °C. Esta prueba se realizó para determinar avirulencia/virulencia de la raza para los genes de resistencia que se expresan mejor a temperaturas más bajas ^{(Singh et al., 2004)}, como Lr11 y Lr18. De las muestras analizadas, se decidió tomar el aislamiento MEX17.503 para incrementar y realizar las pruebas de resistencia en plántula y MEX17.544 (urediniosporas de campo) provenientes de Cirno C2008 sembrado en Huepaco, Huatabampo, Sonora, México para las pruebas de resistencia en campo, bajo el supuesto de que los dos aislamientos corresponden a la misma raza.

Pruebas de resistencia en invernadero

Para llevar a cabo las pruebas de invernadero en estado de plántula, se sembraron 350 genotipos de trigo cristalino resistentes a BBG/BPCG y CBG/BPCG, los cuales se distribuyeron en ocho charolas de plástico que contenían suelo pasteurizado con 48 genotipos por charola. Las charolas con sus respectivas plántulas se ubicaron en un invernadero con un régimen de temperatura diurna de 20 a 23 ^oC y nocturna de 18 a 20 ^oC. Cuando las plántulas mostraron la segunda hoja completamente extendida, aproximadamente a los 11 días después de la siembra, éstas se inocularon con una suspensión de urediniosporas del aislamiento MEX17.503 de P. triticina. Después de la inoculación, las plantas se colocaron en una cámara de rocío durante 16 h. Las charolas se sacaron y las plantas sin humedad superficial se colocaron en un invernadero con las mismas condiciones que se mencionaron anteriormente. Los signos de infección después de la inoculación fueron visibles a los ocho días; no obstante, los tipos de infección se tomaron 10 días después de la inoculación siguiendo la escala de 0 a 4 propuesta por ^{Roelfs et al. (1992)}, en esta escala se consideran como resistentes a individuos con un nivel de 0 a 2 y como susceptibles aquellos con niveles 3 y 4.

Pruebas de resistencia en planta adulta

Los 350 genotipos evaluados en plántula fueron sembrados en el campo El Batán, Texcoco, Estado de México durante el verano de 2017. Los genotipos se establecieron aleatorizados en un bloque sin repeticiones para evitar colinealidad. Las parcelas estuvieron constituidas por un surco de doble hilera de 1.0 m de longitud y 0.75 m de distancia entre surcos. En los cuatro lados del experimento se sembraron bordos con la variedad Cirno C2008, además de grupos de plantas en medio de las calles entre las parcelas. Para evaluar la resistencia de los genotipos, los bordos y los grupos de Cirno C2008 fueron inoculados con esporas frescas del aislamiento MEX17.544 en forma consecutiva en tres ocasiones. Los niveles de infección alcanzados fueron satisfactorios, lo que permitió la toma de datos usando la escala modificada de Cobb ^{(Peterson et al., 1948)} con un ajuste que va del 0 al 100 % del área infectada por el hongo causante de la roya de la hoja y la respuesta de la planta, de acuerdo con ^{Roelfs et al. (1992)}.

Desarrollo de la epidemia

El 22 de enero del 2017 se detectaron las primeras pústulas de roya de la hoja en la variedad Cirno C2008 en el Bajo Río Mayo, las cuales se incrementaron conforme el cultivo se desarrolló. En la semana 5 se identificaron 20 lotes con presencia de roya, añadiéndose 30 lotes en la sexta semana, 38 en la séptima, 40 en la octava, 87 en la novena, 91 en la décima, 84 en la onceava, 64 en la doceava, 97 en la treceava y 20 en la decimocuarta semana de muestreo, dando un total de 571 campos, concluyendo que todos los lotes sembrados con Cirno C2008 presentaron roya de la hoja.

Identificación de razas y virulencia

Las urediniosporas provenientes de las primeras 12 muestras mostraron virulencia en plántulas de Cirno C2008; esto indicó la posibilidad de que una nueva raza estaría presente debido a que ante las razas caracterizadas desde 2001, Cirno C2008 siempre fue resistente en estado de plántula. Pruebas posteriores en plántula y planta adulta indicaron que Cirno C2008 fue susceptible a esta nueva raza. Una vez confirmada la susceptibilidad de Cirno C2008, se procedió a realizar aislamientos monopustulares, los cuales se multiplicaron hasta obtener suficientes urediniosporas para inocular las diferenciales de roya de la hoja mencionadas en el Cuadro 1. Todos los aislamientos obtenidos de las 12 muestras iniciales tuvieron el mismo comportamiento en las diferenciales, por lo que se decidió utilizar y multiplicar el aislamiento MEX17.503 para pruebas posteriores de resistencia. Tomando como base la respuesta de las diferenciales en plántula (Cuadro 1), la raza de P. triticina identificada fue designada como BBG/ BP usando la nomenclatura de ^{Singh (1991)} y ^{Singh et al. (2004)}, que es similar a la identificada en el año 2008 que venció la resistencia de Júpare C2001 y Banámichi C2004 ^{(Huerta-Espino et al., 2009)}, pero con virulencia para el o los genes de resistencia de Cirno C2008.

Todos los aislamientos obtenidos de las muestras de campo de muestreos subsecuentes correspondieron a la misma raza inicialmente denominada BBG/BP_Cirno ^{(Huerta Espino et al., 2017)} o BBG/BPCam haciendo referencia al gen de resistencia ^{(Herrera-Foessel et al., 2005)}, lo que resulta impráctico en cuanto a la nomenclatura, aunque práctico al indicar que es la raza que venció la resistencia de Cirno C2008 y su progenitor Camayo ^{(Herrera-Foessel et al., 2005)}. No se detectó variación adicional en términos de virulencia o avirulencia en las otras muestras obtenidas de campo analizadas en el laboratorio/invernadero y se confirmó que los aislamientos MEX17.503 y Mex17.544 usados en plántula y planta adulta son iguales (Cuadro 2).

La raza fue designada como BBG/BP_Cirno ^{(Huerta-Espino et al., 2009}; ²⁰¹⁷⁾; sin embargo, se consideró necesario agregar dos juegos adicionales de diferenciales para poder seguir su evolución. En el juego VI se agregaron Lr14a, Lr28, Lr61 y Lr72 ^{(Delgado-Sanchez et al., 2016)}, mientras que en el juego VII se incluyeron Gaza (LrGz), Lr33, Camayo (LrCam) y Lr51, de tal forma que las razas existentes en México, y que preferentemente atacan trigos cristalinos, usando la nueva nomenclatura se ilustran en el Cuadro 2. La fórmula de avirulencia/virulencia para BBG/BPCJ es: Lr1, Lr2a, Lr2b, Lr2c, Lr3, Lr3bg, Lr3ka, Lr9, Lr13, Lr14a, Lr15, Lr16, Lr17, Lr18, Lr19, Lr21, Lr24, Lr25, Lr26, Lr28, Lr29, Lr30, Lr32, Lr35, Lr36, Lr61/Lr10, Lr11, Lr12, Lr14b, Lr20, Lr23, Lr27, Lr31, Lr33, Lr72 y LrCam. La raza BBG/BPCJ es producto de una mutación simple que venció el gen de resistencia que Cirno C2008 y su progenitor Camayo poseen. Con base en los tipos de infección, no se detectó ninguna otra diferencia entre BBG/BPCJ y BBG/ BPCG, identificada en el año 2008. La evolución de las razas de P. triticina causantes de la roya de la hoja en trigos cristalinos fue casi nula hasta antes del 2001 ^{(Singh et al., 2004)} (Figura 1), y sólo apareció una variante en 2010.

Figura 1 Diagrama de la evolución, en México, de las razas de P. triticina causante de la roya de la hoja en trigos cristalinos. 

Las introducciones de 2001 han evolucionado y adquirido virulencia para los genes de resistencia presentes en las variedades que mayor superficie han ocupado en el Sur de Sonora, México incluyendo Júpare C2001, Banámichi C2004 ^{(Huerta-Espino et al., 2009)} y Cirno C2008, evaluadas en el presente estudio, como se ilustra en la Figura 1. Las pruebas realizadas en las diferenciales en el invernadero a temperaturas por debajo de 18 ^oC sirvieron para confirmar la virulencia para Lr11 y la avirulencia para Lr18, ambos sensibles a alta temperatura; es decir, con temperaturas arriba de los 20 ^oC las plantas que poseen estos genes se comportan como susceptibles.

Entre los genotipos previamente identificados como resistentes a las razas BBG/BPCG y CBG/BPCG, la mayoría permanecieron resistentes a la raza BBG/BPCJ en las pruebas de invernadero y sólo las líneas previamente resistentes que se enlistan en el Cuadro 3 fueron susceptibles a BBG/BPCJ en plántula y planta adulta. Estas líneas son criollos introducidos de Etiopia y la línea de donde se identificó el gen de resistencia LrCam también proviene de un trigo criollo de Etiopía ^{(Herrera-Foessel et al., 2005)}.

Algunos de estos genotipos, ahora susceptibles en plántula, permitieron la expresión de genes de resistencia efectiva sólo en planta adulta con respuesta de hipersensibilidad (R o MR), y sólo el genotipo IAR.W.185.1 podría contener genes de resistencia no especifica por su tipo de infección compatible (MS) (Cuadro 3).

Algunas líneas que permanecieron resistentes a la raza BBG/BPCJ, tanto en plántula como en estado adulto, se presentan en el Cuadro 4, aunque sólo se enlistan las de mayor resistencia en planta adulta. El uso de otras razas virulentas a Lr14a permitió la postulación de los genes de resistencia presentes en genotipos y variedades de reciente liberación, como Baroyeca Oro C2013, Quetchehueca Oro C2013, Isabel Oro C2018 y Don Lupe Oro C2020, entre otras.

Cabe resaltar que estas variedades y otros genotipos son resistentes a la raza BBG/BPCJ por la presencia de Lr14a que, aunque aún no existe virulencia entre las razas de trigo cristalino en México, se ha reportado virulencia para Lr14a en trigos cristalinos en otros países ^{(Goyeau et al., 2010)}. Lo anterior indica vulnerabilidad de las variedades actualmente recomendadas para siembra en el sur de Sonora, México a la eventual evolución de virulencia para Lr14a. Los genes Lr3 y Lr61, aunque efectivos a la raza BBG/BPCJ, son inefectivos para CBG/BPCQ y BBB/BNJQ, respectivamente (Cuadro 4). La roya de la hoja causada por P. triticina sigue siendo el reto principal del mejoramiento genético del trigo cristalino en México y otras partes del mundo donde este tipo de trigo es importante.

El cultivo de variedades con un solo gen de resistencia, como es el caso de variedades que sólo poseen Lr14a, contribuye a que la evolución del patógeno causante de la enfermedad sólo requiera de una mutación simple en su desarrollo evolutivo hacia virulencia. Una situación similar ocurría en México en el caso de trigos harineros antes de que se generalizara el uso de genes de resistencia no especifica, y por supuesto, la acumulación de varios genes permitió alcanzar niveles muy altos de resistencia hasta llegar a casi inmunidad ^{(Singh et al., 2000)}. En trigos cristalinos se podría desarrollar una estrategia similar combinando el gen Lr46 que confiere resistencia no especifica y que se ha identificado en trigos cristalinos ^{(Herrera-Foessel et al., 2011}; ^{Lan et al., 2017)}. Este gen se podría combinar con Lr68 ^{(Herrera-Foessel et al., 2008b)} y otros genes de raza específica para alcanzar una resistencia más durable y romper el ciclo de auge y caída (Boom-Bust) de la resistencia, que en promedio es de cinco años en el sur de Sonora, México.