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Introducción
El cultivo de la caña de azúcar (Saccharum spp.) representa para México una importante actividad económica, debido al valor agregado de sus productos como sacarosa, melaza, etanol y energía. Durante el año 2022 México fue el octavo productor mundial de caña de azúcar. Las variedades CP 72-2086 y Mex 69-290 fueron las más cultivadas (FAO, 2023).
La cadena de valor en la agroindustria azucarera presenta serios retos tecnológicos, económicos y ambientales (SADER, 2022), mismos, que la hacen vulnerable a los cambios abruptos en el clima provocados por el cambio climático, que aumenta el número de fenómenos meteorológicos extremos, los cuales generan condiciones adversas que aparecen lentamente, como el aumento de la temperatura y pérdida de la biodiversidad (Gómez-Merino et al., 2022).
Es de suma importancia que los sistemas agroalimentarios tengan la capacidad y la resiliencia que generen las adaptaciones necesarias para seguir funcionando en presencia de perturbaciones no previstas (Mansoori et al., 2014). El incremento poblacional y la disponibilidad de los alimentos se han convertido en una preocupación mundial, aunado al aumento de la demanda de alimentos y al cambio climático. La biotecnología vegetal, a través de la micropropagación ha demostrado beneficios en la producción de material vegetal, con una identidad genética homogénea y vigorosa, asegurando un mejor crecimiento una vez establecido en el campo (Bello-Bello et al., 2018). En la búsqueda de estimular el metabolismo vegetal y mejorar el vigor fisiológico, los bioestimulantes se han convertido en una alternativa prominente, a causa de su capacidad de potenciar la productividad y la calidad de cultivos hortícolas y agronómicos (Han et al., 2021).
El fosfito (Phi) es un oxianión derivado del ácido fosforoso (H3PO3 -), que como bioestimulante aplicado en los cultivos promueve la asimilación de nutrimentos y activa procesos de resistencia o tolerancia contra factores de estrés ambiental (Yáñez-Juárez et al., 2018), favorece el crecimiento del sistema radical de las plantas y permiten un mayor crecimiento y rendimiento (Gómez-Merino y Trejo-Téllez, 2015; Halpern et al., 2015).
El Phi ha demostrado actuar como bioestimulante en las primeras etapas de crecimiento en caña de azúcar, permite mejorar indicadores de calidad como el jugo y presentar una respuesta positiva contra diversos tipos de estrés abiótico (Raposo Junior et al., 2013). El Phi ha mostrado efectos estimulantes en el crecimiento de tejidos vegetales en cultivo in vitro(Al-Mayahi, 2019).
Con el objetivo de mejorar el crecimiento y desarrollo de las vitroplantas de caña de azúcar, en esta investigación se evaluaron los efectos de diferentes dosis de Phi en variables de crecimiento y bioquímicas en dos variedades de caña de azúcar in vitro.
Materiales y métodos
Material vegetal y establecimiento in vitro
Se recolectaron puntas de tallos de las variedades CP 72-2086 y Mex 69-290 de caña de azúcar (Saccharum spp. Híbrido) en los campos experimentales del Colegio de Postgraduados, Campus Córdoba. La introducción de ápices se realizó por el método descrito por Bello-Bello (2018), y finalmente se realizó la siembra en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) en condiciones asépticas para la obtención de plántulas in vitro.
Tratamientos
Se evaluó la respuesta de la caña de azúcar cultivada in vitro y bioestimulada con Phi a partir de ácido fosforoso al 98 % (Sigma-Aldrich®; St. Louis, Missouri, EUA) en 0.1, 0.3 y 0.5 mM. El Phi fue agregado al medio de cultivo líquido MS (Murashige y Skoog, 1962), suplementado con ácido ascórbico 100 mg L-1, ácido cítrico 150 mg L-1, kinetina 1 mg L-1 y sacarosa 30 g L-1, el pH del medio fue ajustado a 5.7 con NaOH o HCl (0.1-1.0 N) y esterilizado a 120 °C por un periodo de 15 min en autoclave vertical (Lab-Tech LAC5060s, Namyangju, Corea del Sur). Se vertieron 200 mL de medio de cultivo en los biorreactores Rita®(Alvard et al., 1993) y se introdujeron 12 vitroplantas con longitud de 2 cm. El tiempo de inmersión de los biorreactores fue de 5 min con una frecuencia de 4, 8 y 12 h. El experimento se mantuvo in vitro durante 30 d.
Diseño y unidad experimental
Se utilizó un diseño completamente al azar, donde cada tratamiento tuvo tres repeticiones. Se realizaron dos experimentos independientes con base en la variedad, se tomó como unidad experimental a cada biorreactor con 12 vitroplantas
Medición de variables de crecimiento
Transcurridos 30 días, se evaluó el crecimiento de las vitroplantas, se contabilizó el número de brotes y hojas, largo y ancho de brotes y hojas por medio de un papel milimétrico con escala de 0.1 cm, se fotografió y procesó con el programa ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html) (Rueden et al., 2017). Para determinar el peso de biomasa fresca se utilizó una vitroplanta y se pesó en una balanza analítica digital (VELAB, VE-204, 049022, Monterrey, México). El peso de la biomasa seca se determinó en una estufa de circulación de aire forzado (HCF-125D, Riossa, Monterrey, México) por 72 h a 70 °C.
Medición de variables bioquímicas
Concentración de clorofilas
La cuantificación de clorofila a, b y total se realizó por la técnica de Harborne (1998) en absorbancia de 645 y 665 nm. Para la obtención del total de clorofila se realizó la suma de clorofila a y b y las proporciones correspondientes de clorofilas a/b en espectrofotómetro UV/Vis (Benchmark Scientific, Nueva York, NY, EUA).
Concentración de azúcares solubles totales
La determinación de azúcares solubles totales se realizó por el método de antrona (Brummer y Cui, 2005; basado en Southgate, 1976) en absorbancia de 620 nm a través de un espectrofotómetro UV/Vis.
Concentración de proteínas solubles
La concentración de proteínas totales se realizó por el método de Bradford (1976) modificado por Jones et al. (1989) en longitud de onda de 562 nm por espectrofotometría UV/Vis.
Concentración de aminoácidos libres totales
La concentración de aminoácidos libres totales en tejido foliar se determinó por el método de ninhidrina descrito por Moore y Stein (1954) y modificado por Sun et al. (2006). Para medición a través de las técnicas de espectrofotometría se utilizó un espectrofotómetro UV/Vis.
Análisis de datos
Para corroborar los supuestos normalidad y homogeneidad de varianzas, se realizaron pruebas de Shapiro-Wilk y de Levene (P ≤ 0.05). Los datos presentaron distribución normal y homogeneidad de las varianzas; fueron sometidos a análisis de varianza y pruebas de Tukey (P ≤ 0.05), para el análisis se utilizó el programa estadístico libre de R 4.0.1.V (R Core Team, 2013).
Resultados y discusión
Efecto del Phi en el crecimiento y desarrollo de vitroplantas de caña de azúcar
La adición de Phi promovió las variables de crecimiento en las variedades de caña de azúcar estudiadas, donde CP 72-2086 con la adición de 0.3 mM obtuvo el mayor número y longitud de brotes (Figuras 1A y 1B), la misma dosis en Mex 69-290 indujo la mayor longitud de brotes; sin embargo, la adición de 0.1 mM de Phi salió de esta tendencia al obtener el mayor número de brotes (Figuras 1C y 1D).
Figura 1 Número y longitud de brotes de vitroplantas de caña de azúcar en las variedades CP 72-2086 (A y B) y Mex 69-290 (C y D) expuestas a diferentes concentraciones de Phi. Medias ± error estándar con letras distintas sobre las columnas indican diferencias significativas entre tratamientos (Tukey, P ≤ 0.05).
La variedad CP 72-2086 con la dosis de 0.3 mM Phi tuvo diferencias estadísticas significativas en comparación con el testigo ya que obtuvo el mayor número, longitud y ancho de las hojas (Figuras 2A, 2B y 2C). La variedad Mex 69-290, con la dosis de 0.1 mM Phi, aumentó el número y longitud de hojas (Figura 2D y 2E). La dosis de 0.3 mM incrementó el ancho de hojas (Figura 2F) en comparación con el testigo.
Figura 2 Número, longitud y ancho de hojas en vitroplantas de caña de azúcar de las variedades CP 72-2086 (A, B y C) y Mex 69-290 (D, E y F), expuestas a diferentes concentraciones de Phi. Medias ± error estándar con letras distintas sobre las columnas indican diferencias significativas entre tratamientos (Tukey, P ≤ 0.05).
La dosis de 0.3 mM Phi incrementó la variable peso de biomasa fresca y seca en la variedad CP 72-2086 a 3.48 g y 0.78 g en promedio, lo que representó un aumento con respecto al testigo (Figuras 3A y 3B), la dosis de 0.3 mM Phi en Mex 69-290 presentó el mayor peso de biomasa fresca y la dosis de 0.5 mM Phi obtuvo el mayor peso de biomasa seca con 0.72 g en la variedad Mex 69-290, en comparación con el testigo (Figuras 3C y 3D).
Figura 3 Peso de la biomasa fresca y seca de vitroplantas de caña de azúcar de las variedades CP 72-2086 (A y B) y Mex 69-290 (C y D), expuestas a diferentes concentraciones de Phi. Medias ± error estándar con letras distintas sobre las columnas indican diferencias significativas entre tratamientos (Tukey, P ≤ 0.05).
Las dosis evaluadas de Phi promovieron significativamente el crecimiento en las variedades de caña de azúcar estudiadas con respecto al testigo. Los bioestimulantes se han convertido en una alternativa debido a que inducen respuestas horméticas; esto es, un fenómeno dosis-respuesta presentándose principalmente por una estimulación a dosis bajas y una inhibición a dosis altas (Jalal et al., 2021).
El incremento en las variables de crecimiento puede estar relacionado con la combinación de fosfato presente en la planta y las dosis de Phi, presentando un efecto sinérgico que conduce a una mayor absorción total de P por las plantas (Ávila et al., 2013).
La utilización de Phi en plantas en las cuales ha promovido una mejora en el crecimiento, desarrollo y tamaño de los cultivos se relaciona con la capacidad de estos organismos de poder asimilar el Phi como una fuente de fósforo, en plantas de arroz afines a asimilar Phi se ha observado la sobreexpresión de genes NAD que favorecen el desarrollo celular; además, en la planta modelo Arabidopsis thaliana se ha observado que la acumulación de Phi en los brotes y hojas ha permitido un mejor desarrollo celular al sobreexpresar genes de proteínas transportadoras de fosfatos (PHT) (Datta et al., 2024; Jost et al., 2015).
La relación que existe entre el peso de la biomasa fresca y seca se asocia con la capacidad fotosintética de las plantas; sin embargo, la idea de relación entre el peso de biomasa fresca y seca se ha ido descartando, debido a que el contenido foliar de agua no mantiene una proporción con respecto al peso seco, la que puede variar entre individuos, variedades y comunidades (Huang et al., 2019). El Phi se acumula en diferentes orgánulos, principalmente en el citosol; en presencia de fosfato la acumulación de Phi aumenta en la vacuola (Thao y Yamakawa, 2009), la vacuola constantemente presenta cambios morfológicos asociados con diferentes señales ambientales y de crecimiento; sin embargo, establecer los procesos biológicos que derivan estos cambios todavía es tema de estudio (Cui et al., 2020).
La aplicación de Phi en diversos cultivos ha demostrado su efectividad al aplicarlo como un bioestimulante; en fresa (Fragaria × ananassa Duch. cv. Festival) el Phi incrementó la calidad y sanidad del fruto (Estrada-Ortiz et al., 2013). En lisianthus (Eustoma grandiflorum Raf.), variedades Mariachi Blue y Echo, la aplicación de fosfito en dosis de 0.1 mM promovió una mejora en la calidad del cultivo (Torres-Flores et al., 2018). En lechuga (Lactuca sativa) y acelga (Beta vulgaris var. cicla L.) la adición de dosis de 0.25 mM Phi mejoró de forma sustancial su rendimiento y calidad (Estrada-Ortiz et al., 2016). En especies de Brassica (B. campestris cv. Mibuna Early y B. juncea cv. Red Giant), la aplicación de 0.1 y 0.5 mM Phi incrementó el peso de la biomasa seca y el área foliar (Trejo-Téllez et al., 2019). En acelga (Beta vulgaris var. cicla L.), la aplicación de Phi bioestimuló principalmente el metabolismo y el contenido de nutrimentos (Estrada-Ortiz et al., 2016). En papa (Solanum tuberosum) y tomate (S. lycopersicum L. cv Hayslip), la utilización del Phi estimuló la floración y la calidad en la poscosecha (Lovatt y Mikkelsen, 2006). La estimulación con Phi promueve un incremento en el número de hojas, altura de planta y biomasa, que está en relación con un aumento en la respiración celular (Méndez-Natera, 2002).
La dosis de 0.1 mM Phi tuvo efectos inhibitorios en el peso de biomasa seca en ambas variedades, la respuesta de las plantas a la aplicación de Phi depende de la capacidad del bioestimulante en la absorción de fósforo cuando se presenta en dosis adecuadas; sin embargo, cuando es aplicado en dosis no adecuadas ocasiona un bajo crecimiento, disminuye el área foliar y ocasiona un déficit en la absorción de fósforo (Exley, 2015; Vinas et al., 2020).
Efecto del Phi en la concentración de clorofilas
En clorofila a la concentración fue de 0.73 mg g-1 para la dosis de 0.3 mM Phi en la variedad CP 72-2086 y para Mex 69-290 la mayor concentración fue en la dosis de 0.5 mM con 0.74 mg g-1. La dosis de 0.1 mM Phi presentó en ambas variedades la mayor concentración de clorofila b y total en comparación con el testigo (Cuadro 1).
Cuadro 1 Concentración de clorofilas en vitroplantas de caña de azúcar de las variedades CP 72-2086 y Mex 69-290 expuestas a diferentes dosis de Phi a los 30 días de tratamiento in vitro.
| Variedad | Phi (mM) | Clorofila (mg g-1 PBF) | ||
| a | b | Total | ||
| CP 72-2086 | Testigo | 0.67 ± 0.09a | 0.35 ± 0.01c | 1.02 ± 0.03bc |
| 0.1 | 0.68 ± 0.05a | 0.58 ± 0.03a | 1.27 ± 0.06a | |
| 0.3 | 0.73 ± 0.02a | 0.40 ± 0.01bc | 1.14 ± 0.02ab | |
| 0.5 | 0.51 ± 0.01b | 0.44 ± 0.01ab | 0.94 ± 0.02c | |
| Mex 69-290 | Testigo | 0.63 ± 0.02b | 0.31 ± 0.01c | 0.95 ± 0.03b |
| 0.1 | 0.73 ± 0.01a | 0.41 ± 0.01a | 1.15 ± 0.02a | |
| 0.3 | 0.52 ± 0.01c | 0.37 ± 0.06b | 0.88 ± 0.01b | |
| 0.5 | 0.74 ± 0.02a | 0.38 ± 0.01ab | 1.13 ± 0.09a | |
Medias (± error estándar) con letras diferentes en las columnas indican diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos (Tukey, P ≤ 0.05). PBF: peso de biomasa fresca.
Los resultados evidencian que las dosis de Phi influyen positivamente en la concentración de clorofilas, molécula importante en el crecimiento y desarrollo de la planta, y en el proceso de fotosíntesis. El fósforo es un nutrimento del cual se ha descrito su influencia en la estabilidad de las moléculas de clorofila (Bojović y Stojanović, 2006). En la planta de Arabidopsis thaliana, la aplicación de altas concentraciones de Phi (entre 40 y 50 % del fósforo total) tuvieron un efecto en el contenido de clorofila en hojas, las cuales presentaron un cambio de coloración; las hojas que presentaron un color verde claro tuvieron una menor concentración de clorofila, mientras que las hojas tratadas con Phi al 30 % desarrollaron un color verde oscuro, determinando que hubo un incremento significativo en la concentración de clorofila (Ticconi et al., 2001).
En el caso de fresa silvestre (Fragaria vesca), la aplicación de Phi promovió el aumento de la concentración foliar de clorofila total en la etapa de fructificación (Blanke, 2002). La aplicación de Phi en plantas disminuye la capacidad de la asimilación de fósforo, lo que conduce a cambios principalmente en la membrana de los cloroplastos (Estrada-Ortiz et al., 2016).
El Phi muestra efectos benéficos en la concentración de la molécula de clorofila cuando es aplicado en bajas dosis (Bojović y Stojanović, 2006), aunque se debe aplicar de manera sincronizada con una dosis adecuada de fertilizantes que satisfagan las necesidades del cultivo, incluso se consideran otros factores de influencia como es el genotipo de la planta, el estado fenológico y condiciones ambientales para obtener una mayor concentración de clorofilas (Lovatt y Mikkelsen, 2006).
La concentración de clorofilas en la fotosíntesis es vital para el crecimiento y desarrollo de las plantas; sin embargo, su decremento puede causar alteraciones en la actividad fotosintética (Khairi et al., 2015). El Phi tiene una respuesta hormética en la caña de azúcar cuando es aplicado a altas concentraciones, ocasiona un estrés y provoca daños en la capacidad fotosintética generando la degradación o disminución en la síntesis de clorofila (Cha-Um y Kirdmanee, 2008). La estimulación con Phi promueve un incremento en el número de hojas, altura de planta, biomasa de peso seco, lo que está en relación con un aumento en la capacidad fotosintética y respiración celular (Méndez-Natera, 2002).
Concentración de azúcares, proteínas y aminoácidos
Las dosis de 0.3 y 0.5 mM Phi presentaron el mayor promedio de concentración de azúcares totales en las variedades CP72-2086 y Mex 69-290 en comparación con el testigo. La dosis de 0.1 mM Phi indujo el mayor contenido de proteínas en ambas variedades a 430 y 561 µg g-1 PBF con respecto al testigo que presentó 325 y 314 µg g-1 PBF. La dosis de 0.5 mM Phi aumentó la concentración de aminoácidos libres totales de manera significativa en ambas variedades a 0.24 y 0.37 nM g-1 PBF (Cuadro 2).
Cuadro 2 Concentración de azúcares, proteínas y aminoácidos en vitroplantas de caña de azúcar de las variedades CP 72-2086 y Mex 69-290 expuestas a diferentes dosis de Phi a los 30 días de tratamiento in vitro.
| Variedad | Phi (mM) | Azúcares (mg g-1 PBF) | Proteínas (µg g-1 PBF) | Aminoácidos (nM g-1 PBF) |
| CP 72-2086 | Testigo | 0.09 ± 0.00c | 325 ± 3.37d | 0.05 ± 0.00c |
| 0.1 | 0.22 ± 0.00b | 430 ± 5.75a | 0.15 ± 0.00b | |
| 0.3 | 0.25 ± 0.00a | 470 ± 4.79b | 0.24 ± 0.00a | |
| 0.5 | 0.24 ± 0.00a | 392 ± 3.35c | 0.24 ± 0.00a | |
| Mex 69-290 | Testigo | 0.08 ± 0.00c | 314 ± 2.00d | 0.05 ± 0.00d |
| 0.1 | 0.15 ± 0.00b | 561 ± 13.4a | 0.18 ± 0.00c | |
| 0.3 | 0.23 ± 0.00a | 519 ± 2.60b | 0.29 ± 0.00b | |
| 0.5 | 0.24 ± 0.00a | 344 ± 4.06c | 0.37 ± 0.00a |
Medias (± error estándar) con letras diferentes en las columnas indican diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos (Tukey, P ≤ 0.05). PBF: peso de biomasa fresca.
Las dosis de Phi presentaron un efecto en la concentración de azúcares, proteínas y aminoácidos en el cultivo in vitro de caña de azúcar, lo que se considera como resultado favorable, ya que los azúcares sostienen el crecimiento de tejidos demandantes y son componentes importantes de la pared celular de las plantas; además, participan como moléculas señalizadoras en procesos asociados con el crecimiento y desarrollo de las plantas (Van den Ende, 2014). El incremento del contenido de los carbohidratos se relaciona con una mejor producción (Stapleton et al., 2001). Los azúcares solubles totales son un indicador bioquímico para conocer el estatus nutrimental de la planta (Van den Ende, 2014).
En fresa en la etapa de floración y fructificación, la adición de fosfato en forma de Phi presentó un aumento en la concentración de clorofilas, proteínas y aminoácidos, en tanto que en la etapa de floración se observaron efectos positivos en la concentración de azúcares totales en hojas (Estrada-Ortiz et al., 2011). Estos resultados son muy similares a los del presente estudio, donde la adición de 0.1 mM de Phi en el medio de cultivo in vitro promovió una mayor concentración de proteínas, mientras que una mayor dosis de 0.5 mM resultó en una reducción en la concentración de la proteína; esto puede deberse a que el fosfito en concentraciones no adecuadas inhibe la fosforilación de proteínas y suprime la actividad de las enzimas nucleicas como las fosfatasas ácidas, principalmente cuando hay estrés por fósforo (Ticconi et al., 2001).
En estudios previos se ha observado que la eficiencia del Phi depende de la dosis y susceptibilidad de los cultivos al estrés (Thao y Yamakawa, 2009). De acuerdo con Moor et al. (2009), el Phi activa una respuesta en la expresión de proteínas que ayudan a la adaptación a diferentes tipos de estrés, lo que ocasiona respuestas positivas en la calidad de los cultivos.
La utilización de Phi como bioestimulante, en dosis adecuadas, aumenta la concentración de aminoácidos libres como ácido aspártico, asparagina y glutamina (Estrada-Ortiz et al., 2011). Los aminoácidos son esenciales para la asimilación del nitrógeno y precursores de proteínas y ácidos nucleicos; el aumento de la concentración de aminoácidos puede deberse a la adaptación de las plantas a diferentes condiciones ambientales y de estrés, ya que la concentración de los aminoácidos y otros compuestos nitrogenados solubles son de vital importancia en el metabolismo vegetal (Hsu y Kao, 2003).
Conclusiones
La adición de fosfito (Phi) en la dosis de 0.3 mM presentó un efecto bioestimulante en las variedades CP 72-2086 y Mex 69-290 de caña de azúcar. En la variedad CP 72-2086, específicamente, provocó un incremento significativo en las variables número y tamaño de brotes y en la concentración de clorofilas, proteínas, aminoácidos y azúcares totales, por lo que el uso de Phi es una alternativa como bioestimulante en la obtención de plantas sanas y vigorosas en la micropropagación in vitro.
