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Introducción
Los cursos de química analítica son esenciales para la formación de profesionales en el campo de la química, bacteriología, microbiología, ingenierías, entre otras disciplinas (D. Olsen, 2016; Harris, 2007; Shi et al., 2022). Uno de los tópicos más ampliamente impartidos en los cursos de química analítica instrumental es la espectroscopía ultravioleta visible (UV-VIS), la cual se basa en la absorción de radiación electromagnética en el rango ultravioleta visible (UV-VIS) por parte de una sustancia a analizar (D. Olsen, 2016; Skoog et al., 2014; Sogorb Sánchez y Vilanova Gisbert, 2015).
Si bien gran cantidad de sustancias pueden absorber radiación electromagnética en la región del ultravioleta visible, es ampliamente conocido que no se absorbe con la misma eficiencia en todas las longitudes de onda. Por lo general, la radiación se absorbe más en unas regiones que en otras, dando como resultado, un espectro de absorción, el cual establece de forma indirecta para una sustancia, la cantidad de radiación absorbida para las diferentes longitudes de onda del espectro ultravioleta y visible, comúnmente en la región de los 200 a los 800 nm (Harris, 2007; Skoog et al., 2014).
A la hora de emplear un método analítico basado en la absorción UV-VIS con fines cuantitativos, uno de los parámetros más importantes para configurar en el espectrofotómetro es la longitud de onda de análisis. Para la mayoría de los casos, se escoge como longitud de onda de análisis, a aquella longitud de onda en la cual se presenta la máxima absorción de radiación; esta longitud de onda se conoce como la longitud de onda de máxima de absorción.
Escoger la longitud de onda de máxima absorción para estudiar la absorción de radiación de una serie de muestras de concentración conocida, con el fin de realizar una curva de calibración, permite obtener la mayor sensibilidad debido a que la pendiente sería la más alta posible para una determinada sustancia (Skoog et al., 2014). Por otro lado, cuando se selecciona una longitud de onda diferente a la del máximo de absorción, se esperaría obtener valores de absorbancia más bajos, y esto trae consigo una reducción en la sensibilidad y mayor dificultad para llevar a cabo la ejecución del método analítico (Hernandez Hernandez y González Pérez, 2022).
En caso de que se seleccione una longitud de onda en la cual la absorción de radiación sea mínima, no se podría efectuar una curva de calibración debido a que los valores de absorbancia obtenidos serían muy bajos o cercanos a cero, sin un aumento significativo de la absorbancia a medida que aumenta la concentración del analito en la solución. Esto refleja la importancia de seleccionar adecuadamente la longitud de onda a la hora de realizar una curva de calibración.
En este trabajo se propone una serie de experimentos, los cuales tienen como objetivo permitirle al estudiante interaccionar con el fenómeno de absorción UV-VIS y de comprender la importancia de seleccionar la longitud de onda adecuada a la hora de realizar una curva de calibración.
Materiales y equipos
Reactivos
Solución buffer de pH 3,7: se mezclaron 15 mL de ácido acético glacial (Merck Millipore) junto con 60 mL de etanol al 96% (Merck Millipore) y 20 mL de agua destilada en un vaso de precipitados. Seguidamente el pH fue ajustado a 3,7 empleando solución de amoniaco al 25% m/m. Finalmente, la mezcla obtenida se transfirió a un balón aforado de 100 mL para aforar hasta la marca.
Solución de azul de metileno de 125 mg/L: se disolvieron 500 mg de azul de metileno (en base seca o 570 mg en base húmeda, asumiendo C₁₆H₁₈ClN₃S.xH₂O donde x es igual a 2,5) en agua destilada hasta formar 100 mL de solución, para generar una solución de azul de metileno de 5000 mg/L. Seguidamente, a partir de esta solución se preparó una solución de azul de metileno de concentración 125 mg/L, la cual fue empleada para generar las soluciones de azul de metileno usadas en el presente estudio.
Solución de azul de bromotimol de 1000 mg/L a pH 3,7: se tomaron 100 mg de azul de bromotimol (Merck Millipore) y se diluyeron con solución buffer de pH 3,7 preparadas anteriormente, hasta un volumen de 100 mL.
Parte experimental
Obtención de espectros ultravioleta visible para soluciones de azul de metileno y azul de bromotimol
El espectro de absorción correspondiente al azul de metileno y al azul de bromotimol se analizó utilizando soluciones de azul de metileno y de azul de bromotimol de concentración 4,0 y 16 mg/L respectivamente. Cada solución fue analizada en un espectrofotómetro Merck Prove 300 en el rango de 380 - 800 nm empleando celda de plástico de paso óptico de 1 cm.
Demostración en el aula de la importancia de la longitud de onda de análisis en la espectroscopía ultravioleta visible
Se tomaron varias celdas plásticas para espectrofotómetro con paso óptico de 1 cm. A cada celda se le adicionó por separado distintas soluciones de azul de metileno y azul de bromotimol de diferente concentración. Para el caso de las soluciones de azul de metileno se emplearon concentraciones de 5,0, 10, 15 y 20 mg/L. Para el caso de las soluciones de azul de bromotimol se emplearon concentraciones de 20, 30, 40, 50 y 80 mg/L. Estas celdas pueden ser selladas con sus respectivas tapas para su posterior uso en el aula.
Cada celda fue irradiada con el láser violeta (405 nm) y rojo (650 nm) con el fin de verificar empíricamente la absorción de radiación por parte de las soluciones analizadas, mediante la atenuación de la intensidad del láser al salir de la celda. La luz del láser se hizo incidir sobre una superficie blanca en un ambiente de baja iluminación.
Experimentos en el laboratorio para la demostración de la importancia de la selección de la longitud de onda en análisis cuantitativos mediante ultravioleta visible
Para demostrar la importancia de la selección de la longitud de onda en el análisis cuantitativo mediante ultravioleta visible, se llevaron a cabo una serie de curvas de calibración usando la longitud de onda de máxima absorción y una longitud de onda de mínima absorción. Las curvas de calibración se realizaron empleando soluciones de azul de metileno y azul de bromotimol a pH 3,7 de diferentes concentraciones. Para el azul de metileno, se emplearon soluciones de 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 y 5,0 mg/L. Para el azul de bromotimol se emplearon soluciones de 2,0, 4,0, 8,0, 12, 16, 20, 24, 28 y 40 mg/L. La absorbancia se analizó empleando los valores máximos de absorción para cada analito, siendo 665 nm para el azul de metileno y 425 nm para el azul de bromotimol. Los análisis fueron llevados a cabo empleando un espectrofotómetro Merck Prove 300 y una celda de plástico de 1 cm de paso óptico.
Resultados
Espectros de absorción UV-VIS del azul de metileno y azul de bromotimol
El azul de metileno es un colorante ampliamente utilizado en diferentes aplicaciones en biología y química analítica, el cual se caracteriza por presentar un color azul intenso (Karthi et al., 2022; Lv et al., 2022; Tong et al., 2022). La Figura 1.a representa el espectro de absorción UV-VIS de una solución de azul de metileno de concentración 4,0 mg/L.
Figura 1 Espectro de absorción de a) azul de metileno (4,0 mg/L) y b) azul de bromotimol (16 mg/L) a pH 3,7.
Como se puede observar, el máximo de absorción del azul de metileno se ubica cerca de los 664 nm, mientras que, en la región cercana a los 405 nm, se observa una región de mínima absorción. De igual forma, la Figura 1.b muestra el espectro de absorción del azul de bromotimol a pH igual a 3,7 a una concentración de 16 mg/L. Para esta sustancia, el máximo de absorción se ubica a 425 nm, mientras que a 650 nm se tiene una región de absorción prácticamente nula (Ali et al., 2017; Pudipeddi et al., 2008). Los espectros UV-VIS expresados en la Figura 1, permiten evidenciar que, para las condiciones analizadas, el azul de metileno podría absorber satisfactoriamente un láser de color rojo (650 nm) pero no un láser de color violeta (405 nm). Por otro lado, el azul de bromotimol podría absorber satisfactoriamente un láser de color violeta, pero no un láser de color rojo. Esto permitiría poder demostrar, de forma experimental, la importancia que tiene la selección de la longitud de onda, a la hora de realizar experimentos donde se analice la absorbancia de una sustancia.
Demostración de la importancia de la selección de la longitud de onda en medidas de absorción de radiación UV-VIS
Para este propósito se prepararon una serie de soluciones de azul de metileno y azul de bromotimol (pH = 3,7) a diferentes concentraciones, y se hizo pasar, a través de ellas, el haz de un láser de color rojo (650 nm) y violeta (405 nm), y se analizó la proyección producida por el haz al incidir sobre una superficie blanca. La intensidad del haz después de pasar a través de la celda se analizó cualitativamente de acuerdo a la intensidad del haz de luz proyectado sobre la superficie blanca. La Figura 2 muestra los resultados obtenidos cuando se hizo pasar un láser de color rojo (650 nm) o violeta (405 nm) sobre una serie de soluciones de azul de metileno de diferente concentración.
Figura 2 Proyección del haz de luz de color violeta o rojo después de pasar sobre una serie de soluciones de azul de metileno de diferente concentración.
Como se puede apreciar en la Figura 2, a medida que aumenta la concentración de azul de metileno, la intensidad del haz de luz de color rojo después de pasar por la celda se ve disminuida, siendo significativamente atenuada cuando la concentración de azul de metileno es 20 mg/L. Por otro lado, para el caso del láser violeta no se observó una reducción aparente en la intensidad del haz después de pasar por la celda. Estos resultados están en concordancia con el hecho de que el azul de metileno presenta un máximo de absorción de 664 nm (cercano a 650 nm), mientras que su absorción a 405 nm no es significativa.
Por otro lado, para el caso del azul de bromotimol, se observó que la intensidad del haz del láser de color violeta se vio seriamente reducida a medida que aumentaba la concentración de azul de bromotimol, siendo prácticamente imperceptible cuando la concentración de azul de bromotimol fue de 80 mg/L (ver Figura 3). Por otro lado, cuando se hizo incidir el láser de color rojo sobre esta serie de soluciones de azul de bromotimol, no se observó una disminución aparente en la intensidad del láser, sino que se observó una dispersión del haz de luz proyectado sobre la superficie blanca; este último fenómeno no se discute en este trabajo. Los resultados obtenidos en el anterior experimento están en concordancia con el hecho de que el azul de bromotimol a pH 3,7 presenta un máximo de absorción de 425 nm (cercano a 405 nm) (Shimada y Hasegawa, 2017) mientras que a 650 nm presenta una absorbancia prácticamente nula.
Figura 3 Proyección del haz de luz de color violeta o rojo después de pasar sobre una serie de soluciones de azul de bromotimol de diferente concentración.
Estos experimentos anteriormente mencionados permitirían al docente poder exponer, experimentalmente en el aula, la importancia que tiene la selección de la longitud de onda, a la hora de analizar la absorbancia de un analito determinado.
Experimentos de profundización en el laboratorio mediante la realización de curvas de calibración
Con el fin de determinar el efecto que tiene la selección de la longitud de onda sobre la calidad de los datos obtenidos en una curva de calibración, se analizó la absorbancia de una serie de soluciones de azul de metileno y azul de bromotimol de diferentes concentraciones, empleando un espectrofotómetro. Como se muestra en la Figura 4.b, cuando se lleva a cabo una curva de calibración de azul de bromotimol a pH 3,7, utilizando la longitud de onda de máxima absorción (425 nm) se obtiene una tendencia clara del comportamiento lineal entre la absorbancia y la concentración, indicando un óptimo cumplimiento de la ley de Lambert - Beer en esta región analizada (Skoog et al., 2014). No obstante, cuando se realiza la curva de calibración a una longitud de onda en donde la absorción es no significativa (en este caso a 664 nm), no se obtiene una tendencia coherente entre la concentración y la absorbancia, sino que se obtiene una serie de resultados dispersos en torno a un valor determinado (ver Figura 4.a). Esto demuestra que cuando se lleva a cabo una curva de calibración empleando una longitud de onda donde la absorción de radiación no es significativa, no se logra obtener una relación directa entre la absorbancia y la concentración para el analito analizado. La obtención de valores negativos puede ser debida al efecto de dispersión del haz de luz por parte de un láser de color rojo (aproximadamente 650 nm) tal como se vio en la Figura 3, sin embargo, este fenómeno no es objeto de estudio en el presente trabajo.
Figura 4 Curva de calibración para soluciones de azul de bromotimol a pH 3,7 utilizando longitudes de onda de a) 664 nm y b) 425 nm.
Para el caso de la curva de calibración empleando azul de metileno como analito, en ambos casos (usando la longitud de onda de máxima absorción y de baja absorción) se pudo establecer una relación lineal entre la absorbancia y la concentración del analito (ver Figura 5). No obstante, como se puede ver en esta gráfica, las pendientes de la recta en ambas curvas de calibración son significativamente diferentes, siendo mayor para el caso en donde se utilizó la longitud de onda de máxima absorción (verFigura 5.a). Esta diferencia observada en el valor de las pendientes obtenidas evidencia que la sensibilidad del método analítico se ve significativamente influenciada por la selección de la longitud de onda; cuando se escoge la longitud de onda de máxima absorción, se obtiene la mayor pendiente (lo cual favorece la sensibilidad del método analítico) mientras que cuando se escoge la longitud de onda de menor absorción, se obtiene una baja pendiente, lo cual desfavorece la sensibilidad del método analítico.
Dinámica de evaluación de los conceptos relacionados en el presente trabajo
Con el fin de llevar a cabo un proceso de evaluación de la asimilación de conceptos por parte del estudiante, se propone la siguiente dinámica expresada en la Tabla 1. Se recomienda llevar a cabo esta actividad en un laboratorio, con todas las normas de bioseguridad requeridas.
Tabla 1 Dinámica de evaluación de conceptos básicos relacionados con el efecto de la longitud de onda sobre la eficiencia de absorción por parte de soluciones de analitos absorbentes en el rango UV-VIS.
Para el procedimiento de evaluación para la verificación de saberes adquiridos, el docente podrá generar un formulario escrito donde se evalúen los conceptos mencionados en la Tabla 1, haciendo uso de preguntas abiertas, selección múltiple, u otro tipo de preguntas que considere pertinente.
Conclusión
La selección de la longitud de onda es un parámetro crucial en el análisis químico de una solución de un analito absorbente. La demostración práctica de este fenómeno puede ser una herramienta valiosa para enseñar a los estudiantes la importancia de la selección de la longitud de onda durante la ejecución de un método analítico. Mediante experimentos sencillos y económicos, se puede demostrar cómo una sustancia puede absorber significativamente en algunas regiones de longitudes de onda y no en otras, lo que puede afectar los resultados del análisis químico. En conclusión, la selección cuidadosa de la longitud de onda es fundamental para garantizar la precisión y exactitud de los resultados analíticos.
