¿Qué se considera para definir la variable de respuesta y los factores a estudiar?

En este punto los estudiantes determinan inicialmente la variable de respuesta. Se espera que aquí ellos determinen cual es la más significativa y que conduzca a los mejores resultados. Sumado a esto, aquí también se escogen todos los factores que puedan influir sobre la respuesta escogida. Lo ideal es que el estudiante logre centrar sus estudios solo con los factores relevantes, puesto que serán los que le brinden información realmente útil.

Es por esta razón que en nuestro análisis exploratorio se realizaron una serie de ensayos en los que se buscó la mejor zona de trabajo para aplicar el diseño experimental, siendo el rendimiento la variable de respuesta porque se pretende incrementar sus valores haciendo uso de la IMW. Se llevaron a cabo dos aproximaciones sintéticas, las variables a evaluar fueron potencia (PMW) y tiempo de irradiación (TI), son las que mayor influencia pueden tener sobre el rendimiento debido a que la variación más importante entre la metodología convencional y la mostrada en este documento, es la fuente de calentamiento, que para este caso es realizada por medio de irradiación con microondas. Con esto, en los ensayos 1-5 se mantuvo constante solamente el tiempo de irradiación, caso contrario a lo experimentado en los ensayos 6-14 donde lo que se mantuvo constante fue la potencia de irradiación (Tabla 1).

Teniendo en cuenta estos resultados, se puede apreciar que para los ensayos 1-5, los rendimientos son en general menores a los obtenidos por calentamiento convencional (Tabla 5). Aun así, se debe destacar que los mayores rendimientos en estos cinco ensayos se obtienen cuando la PMW es baja (Ensayos 1, 4). Adicionalmente, se debe indicar que el uso de PMW altas (≥140 W), genera sobrecalentamiento de la mezcla de reacción, por lo que no es adecuado manejar estas potencias, además de que los rendimientos en estos casos son más bajos probablemente por procesos degradativos. De este modo, en los Ensayos 6-14 se decide trabajar con potencias menores, PMW de 70 W. Es evidente que para los ensayos 6-14 los rendimientos tienden a incrementarse cuando los TI son mayores que los usados en los ensayos 1-5. Pero también es necesario indicar que cuando el TI es muy alto (> 12 min), el rendimiento muestra un decrecimiento. Pero en el caso de un TI de 12 min (Ensayo 12), el rendimiento es el más alto de todos los ensayos e incluso es un poco mayor a lo obtenido empleando calentamiento convencional. Los Ensayos 13 y 14 corroboran lo obtenido en el Ensayo 12.

¿Cómo seleccionar los niveles de cada factor?

Es en esta etapa donde los estudiantes evalúan en conjunto con el docente y definen el número de niveles que se van a probar por cada factor, así como, el número de repeticiones a realizar para cada nivel. Este paso es muy valioso para que ellos puedan ser más eficientes en sus procesos y comprendan como evitar gastos innecesarios, tiempo, reactivos, disolventes y entre otros aspectos.

Para nuestra investigación, la definición de los niveles de la PMW y el TI se efectuó teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los ensayos 1-14 del análisis exploratorio. Por tanto, para la optimización de la síntesis de 8-10 se llevó a cabo un diseño experimental 3x2, conformado por los 2 factores previamente mencionados, evaluados a 3 (TI) y 2 (PMW) niveles, adicionalmente sobre cada nivel se realizó 2 réplicas con el fin de corroborar los valores obtenidos de rendimiento en cada caso y disminuir así el error experimental.

Es momento de planear la parte experimental

Con los pasos previos, se ha definido el diseño experimental, por tanto, ya los estudiantes pueden definir cómo llevar a cabo su trabajo experimental. Este aspecto tiene gran relevancia, da las pautas para organizar su proceso en el laboratorio, su estudio y así evitar la pérdida de datos y/o resultados importantes.

En nuestro caso, teniendo en cuenta el número de factores, niveles y replicas planteadas, se generaron para cada uno de los compuestos terpiridínicos (8-10) un total de 18 experimentos y/o corridas (Tabla S1, Material Suplementario-MS), es mucho mejor si se implementan de forma aleatoria y por supuesto es recomendable hacerlos todos por separado, es decir, no es correcto realizar experimentos, por ejemplo de 8 mientras también se hacen los de 9.

Tras la experimentación se deben analizar los resultados con métodos estadísticos

Al final del paso anterior, normalmente se tendrán muchos datos, es tarea de los estudiantes manejar la información obtenida por medio de métodos estadísticos como ANOVA que permite analizar la varianza, entre otros parámetros. Es un paso importante, otorgarles un mecanismo de análisis de datos, es necesario que se apropien del conocimiento de estas metodologías y del uso de software estadístico.

Por ende, en este trabajo se introducen los resultados en el software STATGRAPHICS, puesto que tiene facilidad de manejo y genera tanto tablas ANOVA (Tablas 2-4) como diferentes gráficas que permiten analizar lo obtenido de la manera más simple posible.

Ahora se deben interpretar los datos obtenidos

Los estudiantes analizarán detalladamente los resultados alcanzados, identificando las condiciones que generan los mejores valores en cuanto a variable de respuesta, recogerán todas las ganancias respecto a la información que se logra substraer del estudio. Este proceso de análisis se aborda bajo supervisión del docente. Además de esto, ellos abordarán de forma sistemática la caracterización espectroscópica y espectrométrica de los compuestos (si fuere el caso), esto con el fin de corroborar la obtención de estos bajo las condiciones óptimas de reacción. Se espera como un resultado de aprendizaje el manejo de los resultados y la correcta interpretación tras el proceso de caracterización.

De igual forma, a través de las Tablas 2-4 se observa que el factor PMW como TI y su interacción (PMW*TI) son relevantes para la determinación del rendimiento, esto teniendo en cuenta que el Valor P en estos casos es <0.05 con un nivel de confianza del 95.0 %.

Se puede observar que los valores de P para cada una de las variables son más bajas en el siguiente orden: 8, 9 y 10; observándose los rendimientos más altos en el mismo orden. Adicionalmente, se debe indicar que la interacción TI*TI en ninguno de los diseños experimentales tiene gran relevancia, puesto que su Valor P es >0.05 con un nivel de confianza del 95.0 %.

Las ecuaciones de regresión ajustadas obtenidas, se muestran a continuación:

• Para 8:

Rendimiento = 53.005 - 12.2900 * PMW - 3.97417 * TI - 5.32917 * PMW * TI - 2.12417 * TI ²

• Para 9:

Rendimiento = 41.6583 - 12.3294 * PMW - 3.34667 * TI - 4.7033 * PMW * TI - 2.72667 * TI ²

• Para 10:

Rendimiento = 33.4667 - 12.0083 * PMW - 2.73583 * TI - 4.24417 * PMW * TI - 2.3475 * TI ²

Con estas relaciones matemáticas, se puede predecir el rendimiento de reacción, dependiendo de los factores PMW, TI y su interacción PMW*TI. De los diagramas de Pareto (Figura S1, MS) de 8-10 se puede apreciar nuevamente que los factores PMW y TI, junto con su interacción PMW*TI, son relevantes, puesto que superan la línea que representa el valor crítico, mientras que la interacción TI*TI no es relevante, puesto que no la supera. También en este diagrama se observa que en los tres casos las variables PMW, TI y PMW*TI impactan negativamente el rendimiento de reacción a valores muy altos, en especial para el factor PMW. Esto se observa en la Tablas S1 del MS donde se aprecia que, a valores altos de PMW y TI, el rendimiento decae, quizás por procesos degradativos o inhibidores de la reacción por sobrecalentamiento. Los gráficos de Efectos Principales (Figura S2, MS) para 8-10 muestra curvas con pendientes negativas, lo cual se explica por lo previamente indicado, es decir, a valores altos de los factores PMW y TI, menor será el rendimiento de la reacción. Así mismo, de nuevo se ve que en los tres casos es el factor PMW el que su pendiente es más prominente, puesto que es el factor que mayor efecto negativo tiene en el rendimiento de la reacción cuando sus valores son más altos.

Las gráficas de Interacción (Figura S3, MS) muestran, de manera similar, que para los compuestos 8-10 a valores bajos de PMW y TI, los rendimientos son altos; pero para estas mismas variables a valores altos el rendimiento disminuye. Cuando se evalúa la relación a una PMW alta y TI bajo, el rendimiento es bajo, pero no tan notorio como en el caso anterior. De esta forma, se puede decir que es realmente significante la interacción entre PMW y TI.

Para este caso, se utilizan los gráficos de superficies de respuesta (Figura S4, MS) para determinar los valores de PMW y TI que generan el mayor rendimiento de reacción para 8-10. De este modo, las superficies muestran ciertas similitudes, a razón de que indican la zona donde se presenta mayor rendimiento. Es decir, cuando el PMW y el TI tiene valores de 70 W (valor bajo) y 12 min (valor medio), respectivamente. Con lo cual estos valores son los óptimos para obtener el mayor rendimiento de reacción. Una vez empleadas las condiciones óptimas para la síntesis de los compuestos y posterior purificación por recristalización en EtOH, los rendimientos obtenidos para cada derivado de terpiridina, muestran un valor mayor a lo obtenido por la metodología convencional. Se ha reportado por triplicado los rendimientos de reacción, sus promedios y las desviaciones estándar (DE), respectivas (Tabla 5).

Se debe destacar, que los valores obtenidos en cada réplica para 8-10 sintetizados por medio de IMW, presentan una DE baja, lo que indica que la metodología usada permite obtener rendimientos con alta reproducibilidad. Esto es favorable, puesto que siempre se puede saber cuánto se va a obtener del producto esperado bajo condiciones establecidas, como en este caso 12 min de TI y 70 W de PMW. Adicionalmente, con el fin de corroborar los resultados obtenidos bajo las condiciones óptimas estandarizadas en el Microondas Whirlpool modificado, se lleva a cabo la síntesis de 8-10 (por triplicado en cada caso) en un equipo Milestone flexiWAVE diseñado para realizar síntesis orgánica asistida por Microondas logrando obtener mejoras en cuanto a rendimiento (Tabla 5). De este modo, se puede observar que los rendimientos en todos los casos son ligeramente mayores que los obtenidos con el Microondas Whirlpool modificado; por tanto, se considera que el estudio y análisis de estos resultados son válidos en la presente investigación, pues son consistentes con lo obtenido en un equipo diseñado para síntesis asistida por microondas como lo es el equipo de Milestone.

Es importante indicar los alcances logrados

Siempre es relevante exponer los logros conseguidos con el fin de permitir avances en la ciencia y dejar claridad sobre lo alcanzado. Se espera que, en esta etapa final de la elaboración del diseño experimental, los estudiantes aprendan la relevancia de presentar sus resultados, y su apropiación para hacerlo de forma ordenada, concisa y metódica.

Afianzados en nuestra experiencia podemos decir que se ha logrado llevar a cabo la optimización de la síntesis de tres 4’-aril-2,2’:6’,2’’-terpiridinas realizando un diseño experimental 3x2 y haciendo uso de la reacción de Kröhnke mediada por calentamiento por IMW, obteniendo una PMW de 70 W y un TI de 12 min como condiciones óptimas de reacción (corroboradas con un equipo diseñado para síntesis microondas), con las cuales se obtuvieron buenos rendimientos, que son mayores que los obtenidos por CC. Por ende, se logra reducir considerablemente los tiempos de reacción e incrementar los rendimientos, como resultado de la aplicación de un diseño experimental a procesos reales, cuyo enfoque estadístico estimula a los estudiantes a resolver retos experimentales, alcanzando resultados motivantes y alentadores en sus procesos de formación investigativa. Así mismo, estos compuestos, pudieron ser caracterizados por medio de técnicas espectroscópicas: FTIR, UV-Vis, RMN ¹H y ¹³C como también espectrometría de masas, encontrando que la ruta planteada en este trabajo permite la correcta obtención de los compuestos terpiridínicos. Sumado a esto, la propuesta de enseñanza planteada permite a los estudiantes de Química o afines, tener un paso a paso para que ellos mismos puedan plantear su diseño experimental, además de que con esta experiencia de laboratorio se esperan alcanzar diferentes aprendizajes que favorezcan el crecimiento integral del estudiantado en competencias de ciencia y tecnología por medio de metodologías que los ayuden a ser ordenados con su trabajo experimental y los motiven a indagar, cuestionar, analizar sobre situaciones y/o problemas experimentales y la resolución de los mismos.

General

Todos los reactivos y disolventes usados fueron de grado analítico de las marcas PanReac AppliChem, Sigma-Aldrich, Macron, Merck o Fischer Scientific. La CCF se realizó en placas de Silica gel 60 F₂₅₄ adquiridas de Merck. Las placas de CCF se revelaron usando una Lampara UV MiniMAX™ by SPECTROLINE a = 254 nm. La síntesis por irradiación microondas, se llevó a cabo en un microondas Whirlpool WMP07ZD (700 W, 2450 MHz) modificado y en un equipo microondas sofisticado, Milestone flexiWAVE. El análisis de los resultados del Diseño Experimental se desarrolló usando el software STATGRAPHICS Centurion XVI v.16.1.03. Los puntos de fusión fueron determinados haciendo uso de un Fusiómetro OptiMelt MPA100 SRS. Los espectros de IR fueron tomados en un Espectrómetro FTIR Thermo Nicolet iS10 por medio de pastillas de KBr en un rango de 4000.0 a 400.0 cm^-1. Los espectros UV-Vis, se obtuvieron en el Espectrofotómetro Thermo Genesys 6 en el rango de 200.0 a 800.0 nm usando acetonitrilo (ACN) acidificado como disolvente y una concentración de 10 mg/L de 8, 9 o 10. Los espectros de RMN ¹H y ¹³C, se obtienen en un Espectrómetro Bruker Ascend™ 400 disolviendo los compuestos en cloroformo deuterado (CDCl₃). Los espectros de MS se obtuvieron con un Espectrómetro Shimadzu GC/MS QP-2010, sonda sólidos e ionización por impacto electrónico.

Síntesis de los derivados de terpiridina 8-10 mediante IMW (condiciones óptimas)

En el proceso de síntesis de 8-10, las condiciones usadas de PMW y el TI corresponden a las que se encontraron como óptimas de acuerdo con el diseño experimental realizado, es decir, 70 W y 12 min respectivamente. Adicionalmente, se debe destacar que las cantidades de 2-acetilpiridina (1), y aldehídos aromáticos (2-4) como también las de EtOH, KOH y NH₄OH, se dejaron constantes tanto en el análisis exploratorio como en el Diseño Experimental: En un balón de 100 mL que contiene 20 mL de EtOH, se adicionan 0.3961 g (6 mmol) de KOH y se agita hasta completa disolución. Posteriormente, se añaden lentamente 450 µL (4 mmol) de 2-acetilpiridina y el apropiado aldehído aromático (2 mmol), dejando esta mezcla de reacción en agitación a temperatura ambiente por 2 h. Pasado este tiempo, a la mezcla se le adiciona lentamente un exceso de NH₄OH al 30 % (5 mL), y se agita por 5 min a temperatura ambiente. El balón se conecta a un sistema de reflujo dentro del equipo microondas, y se irradia por 12 min a una Potencia de 70 W (condiciones óptimas). La mezcla se deja enfriar hasta temperatura ambiente y se añaden 50 mL de agua desionizada fría. El precipitado formado se filtra al vacío y se lava con etanol y agua desionizada. Este sólido se deja secar toda la noche a 70 °C y se purifica por recristalización en EtOH. La CCF, se lleva a cabo usando como fase móvil alcohol isobutílico: acetona: cloroformo (relación 4:3:3) + 2 gotas de ácido acético diluido 1:10.

Síntesis de los derivados de terpiridina 8-10 mediante CC

La síntesis convencional de 8-10 se diferencia de la síntesis por IMW en dos aspectos: 1) El calentamiento es llevado a cabo sobre una plancha calefactora con agitación y 2) El tiempo de calentamiento es llevado a cabo a reflujo durante 20 h (^{Sasaki, 2016}; ^{Tu et al., 2007}). La obtención de los derivados terpiridínicos por calentamiento convencional, es importante puesto que permiten ser referencia y comparar el rendimiento de reacción con el obtenido por IMW.