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INTRODUCCIÓN
La resistencia bacteriana a los antibióticos es un problema de salud pública importante debido a que incrementa la morbilidad y mortalidad de la población, así como los costos de atención médica (Zahid et al. 2017). El aumento de bacterias resistentes a los antibióticos representa una amenaza para la salud mundial. En 2019, este problema estuvo asociado a aproximadamente 4.95 millones de muertes a nivel global (Murray et al. 2022).
Una de las bacterias consideradas de importancia crítica desde 2017 por la Organización Mundial de la Salud (OMS) es Escherichia coli (Havenga et al. 2019), ya que es una de las más prevalentes tanto en el tracto gastrointestinal de humanos y animales como en el ambiente. Su plasticidad genómica le permite ser una receptora eficaz de material genético externo, lo que la convierte en importante diseminadora de resistencia, por lo que suele utilizarse para monitorear la resistencia a antibióticos en el ambiente (Nekouei et al. 2018, Devanga et al. 2019).
Por otra parte, desde su introducción en el mercado las tetraciclinas han estado entre los antibióticos más utilizados en humanos, animales y agricultura por su amplio espectro y bajo costo (Thaker et al. 2010, Roberts y Schwarz 2016). Esta familia de antibióticos se ha clasificado entre los antibióticos más frecuentemente detectados en aguas residuales, superficiales y subterráneas por su baja movilidad y persistencia en tales fuentes (Wellington et al. 2013, Javid et al. 2016).
La resistencia a las tetraciclinas puede ser extrínseca e intrínseca, esta última a través de la adquisición de los genes tet, los cuales están implicados en tres mecanismos de resistencia: bombas de eflujo, protección ribosomal e inactivación enzimática (Belaynehe et al. 2018). Estos genes se han propagado a través de transferencia horizontal de elementos genéticos móviles (EGM) como plásmidos, transposones e integrones, principalmente por conjugación plasmídica, y pueden coseleccionar resistencia a otros antibióticos (Shin et al. 2015). A menudo se han localizado en EGM que albergan genes de resistencia a otros antibióticos (Nekouei et al. 2018).
Antibióticos como las tetraciclinas se caracterizan por ser escasamente metabolizados y son excretados en heces u orina hacia el ambiente (Kyselková et al. 2013), donde pueden alcanzar aguas superficiales y contribuir a la aparición, evolución y propagación de la resistencia a antimicrobianos (Delgado-Blas et al. 2021). En este contexto, los ambientes acuáticos generan gran interés en el ámbito sanitario debido a que son importantes fuentes de microrganismos como bacterias multirresistentes, y además están sometidos a contaminación antrópica con antibióticos de manera directa (Magaña-Lizárraga et al. 2022).
En el norte de Tamaulipas la fuente hídrica de mayor relevancia es el Río Bravo, que supera los estándares de contaminación fecal y toxicidad química establecidos por la Agencia de Protección Ambiental estadounidense (USEPA, por sus siglas en inglés). Dicha situación genera preocupación debido a que las aguas de este río son empleadas para fines de consumo, riego y recreativos en la región fronteriza de México y EUA, incrementando el riesgo de infecciones difíciles de tratar (Fuentes et al. 2019). En la región noreste de Tamaulipas, la información sobre la propagación de resistencia a antibióticos en ambientes acuáticos es limitada. Por ello, el objetivo de este trabajo fue evaluar la resistencia a tetraciclinas en E. coli aislada de agua superficiales y residuales en el noreste de Tamaulipas, México.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislados bacterianos
Se analizaron 50 aislados de E. coli procedentes del banco de cepas del Laboratorio Interacción Ambiente-Microorganismo del Centro de Biotecnología Genómica del IPN, los cuales se aislaron de agua procedente del Río Bravo, así como canales de riego, drenes y alcantarillas de la ciudad de Reynosa, Tamaulipas. Previamente se les sometió a identificación fenotípica mediante pruebas bioquímicas convencionales (lactosa, indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer, citrato de Simmons, urea de Christensen y H2S), así como a identificación de su filogrupo (A, B2, B2 o D).
Análisis de sensibilidad fenotípica
Las bacterias fueron reactivadas en medio tripticasa de soya (TSA, por sus siglas en inglés) para cultivo en placas (MCD LAB), posteriormente se cultivaron en medio selectivo eosina azul de metileno (EMB por sus siglas en inglés) en placas (MCD LAB) para confirmar su pureza. En seguida se realizó el análisis de susceptibilidad a agentes quimioterapéuticos por el método de difusión en disco para tetraciclina (TET), doxiciclina (DOX) y minociclina (MIN) en disco (BD BBL Sensi-Disc, Becton, Dickinson and Company, EUA) siguiendo los parámetros indicados en el documento M100 (CLSI 2018). E. coli ATCC 25922 se empleó como cepa de referencia.
Adicionalmente, se determinó la sensibilidad a agentes diferentes a las tetraciclinas, que incluyeron ampicilina (10 µg), ciprofloxacina (5 µg), sulfametoxazol-trimetoprim (25 µg), levofloxacina (5 µg), estreptomicina (30 µg), gentamicina (10 µg), cefepime (FEP, 30 µg), cefotaxima (30 µg), amikacina (30 µg) y cloranfenicol (30 µg) en disco (BD BBL Sensi-Disc, Becton, Dickinson and Company, EUA).
Extracción de ADN bacteriano
La extracción de ADN se llevó a cabo por el método de lisis térmica (Mehrez et al. 2009, Vázquez-López et al. 2018), para lo cual se tomaron varias asadas de cada cultivo de 18 h crecido en medio TSA y fueron colocados en 500 μL de agua libre de nucleasas. Esta mezcla fue incubada a 95 ºC durante 15 min,. Posteriormente se centrifugó durante cinco minutos a 12 000 rpm y el sobrenadante (ADN) se colocó en microtubos que fueron mantenidos a -20 ºC hasta su uso.
Detección de genes
La amplificación de los genes tet se realizó por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por su sigla en inglés) de punto final a volumen final de 15 μL. Los iniciadores, así como las condiciones de la mezcla de reacción y amplificación se realizaron de acuerdo con lo reportado por Ng et al. (2001). La reacción se realizó en un termociclador MultiGene OptiMax. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % on SYBR Gold a 90 V por 45 min empleando marcador HyperLadder 100 pares base (pb). Como cepas control se utilizaron Enterococcus faecium ATCC 19433 y Enterococcus fecalis, así como un control negativo en el cual se añadió agua mili-Q estéril. Los amplicones esperados presentaban un tamaño de 210 pb, 659 pb, 418 pb, 406 pb y 468 pb para tet(A), tet(B), tet(C), tet(M) y tet(X), respectivamente.
Para la detección del gen intI, cada PCR se realizó a un volumen final de 15 μL y concentración final de buffer 5X GoTaq Flexi (Promega, EUA), MgCl2 2.7 mM, dNTPs 400 µM Mm (Promega, EUA), iniciadores 0.5 μM y agua libre de nucleasas. Se utilizaron los iniciadores reportados por Liu et al. (2013). La PCR se llevó a cabo en el termociclador MultiGene OptiMax. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % a 90 V por 45 min con SYBR Gold a 90 V por 45 min empleando marcador HyperLadderM 100 pb. Se esperaba un fragmento de 484 pb.
Ensayo de conjugación plasmídica
Para los ensayos de conjugación plasmídica se siguió el protocolo de Koo y Woo (2011) y Shin et al. (2015). Los aislados de E. coli resistente a tetraciclina se utilizaron como bacteria donadora y E. coli J53 azida resistente (ATCC BAA2730) como receptora. Ambas bacterias fueron cultivadas en caldo Luria Bertani (LB) en tubo (CONDALAB) a 37 ºC toda la noche. Se realizó una mezcla con las dos bacterias en un factor de dilución 1:3 y se incubaron hasta la fase logarítmica. Después, una alícuota de 100 μL fue dispersada en placas de TSA suplementado con tetraciclina (10 µg/mL) y azida sódica (200 µg/mL) y se incubadaron a 37 ºC por 24 h. Como control de calidad, las bacterias donantes y receptoras se cultivaron por separado en placas TSA suplementadas con tetraciclina (10 mg/L) y azida sódica (200 mg/L). A las transconjugantes de las placas que presentaron crecimiento se les realizó una PCR de los genes tet para verificar que habían adquirido dichos genes.
Tipificación del replicón plasmídico
Se identificaron los grupos de incompatibilidad plasmídica mediante tipificación de plásmidos basada en replicones (PBRT, plasmid based replicon typing), siguiendo las condiciones de reacción y amplificación reportadas por Carattoli et al. (2005) y Villa et al. (2010). La PBRT se basa en la realización de cinco PCR multiplex que amplifican tres replicones cada una y nueve PCR simples.
RESULTADOS
Análisis de sensibilidad fenotípica
Un total de 54 % (27/50) de aislados de E. coli fueron resistentes a tetraciclina, 16 % (8/50) a minociclina y 26 % (13/50) a doxiciclina. Los resultados por fuente se muestran en el cuadro I. Asimismo, entre los aislados resistentes a tetraciclina se observó la presencia de resistencia conjunta a tetraciclina, minociclina y doxiciclina en 22 % (6/27), a tetraciclina y minociclina en 7 % (2/27) y a tetraciclina y doxiciclina en 26 % (7/27).
CUADRO I RESISTENCIA FENOTÍPICA A TETRACICLINAS POR FUENTE.
| Origen | n | Tetraciclina (%) | Minociclina (%) | Doxiciclina (%) |
| Agua superficial | 25 | 15 (60) | 6 (24) | 6 (24) |
| Agua residual | 25 | 12 (48) | 2 (8) | 7 (28) |
| TOTAL | 50 | 27 (54) | 8 (16) | 13 (26) |
Respecto a los otros antibióticos evaluados, en total se observó resistencia a ampicilina (52 %), estreptomicina (55 %) y trimetoprim-sulfametoxazol (44 %) (Cuadro II). Además, es relevante la resistencia a ciprofloxacino (26 %, 7/27) y levofloxacino (18 %, 5/27), detectada principalmente en aguas residuales.
CUADRO II RESISTENCIA FENOTÍPICA A OTROS ANTIBIÓTICOS EN Escherichia coli DE AGUAS SUPERFICIALES Y RESIDUALES.
| Antibiótico | Resistencia fenotípica (n = 27) | Total (%) | |
| Superficial (15) | Residual (12) | ||
| Estreptomicina | 8 | 7 | 15 (55) |
| Ciprofloxacino | 1 | 6 | 7 (26) |
| Levofloxacino | 1 | 4 | 5 (18) |
| Cefepime | 0 | 1 | 1 (4) |
| Gentamicina | 3 | 0 | 3 (11) |
| Trimetoprim-sulfametoxazol | 7 | 5 | 12 (44) |
| Amikacina | 1 | 0 | 1 (4) |
| Ampicilina | 8 | 6 | 14 (52) |
| Cloranfenicol | 4 | 4 | 8 (30) |
Asimismo, se observó resistencia a más de una familia de antibióticos, en promedio a dos familias y como máximo a seis. Fue común detectar resistencia conjunta a sulfametoxazol, ampicilina, estreptomicina y tetraciclina.
Por otro lado, es destacable que 48 % (13/27) de los aislados de E. coli resistente evaluados pertenecen al filogrupo A (comensales), 33 % (9/27) al filogrupo D, 11 % (3/27) al filogrupo B2 y 7 % (2/27) al filogrupo B1 (Fig. 1).
Fig. 1 Distribución de Escherichia coli de acuerdo con filogrupos y resistencia fenotípica. (a) Distribución en aguas superficiales; (b) distribución en aguas residuales. TET: tetraciclina; DOX: doxiciclina; MIN: minociclina; STX: trimetoprim-sulfametoxazol; AMP: ampicilina; CHL: cloranfenicol; STR: estreptomicina; LVX: levofloxacino; FEP: cefepime; CIP: ciprofloxacino.
Detección de genes tet e intI
Respecto a los genes tet, el más frecuente en todas los aislados fue tet(A), el cual se detectó en 74 % (20/27), seguido por tet(B) con 18 % (5/27), tet(M) 4 % (1/27) y tet(C) 4 % (1/27); tet(X) no fue detectado (Cuadro III, Fig. 2). La presencia de múltiples genes tet en un mismo aislado también fue detectada, encontrándose que tet(A), tet(B) y tet(M) se presentaron en 4 % (1/27), tet(A) y tet(B) en 7 % (2/27). Adicionalmente, el gen intI se presentó en 22 % (6/27) de los aislados (Fig. 3). Con relación a los análisis estadísticos, éstos no mostraron diferencia significativa entre tet e intI (p > 0.05).
CUADRO III DISTRIBUCIÓN DE LOS GENES TET E INTI DETECTADOS EN Escherichia coli.
| Origen | Genes tet (n) | |||||
| tet(A) | tet(B) | tet(C) | tet(M) | tet(X) | intI | |
| Superficial | 10 | 2 | 1 | 1 | 0 | 3 |
| Residual | 10 | 3 | 0 | 0 | 0 | 3 |
| TOTAL | 20 | 5 | 1 | 1 | 0 | 6 |
Fig. 2 Gel representativo del amplicón de tet(A) (210 pb). Gel de agarosa al 1.5% con SYBR Gold, 90 V por 45 min. M: marcador HyperLadder 100 pb (carriles 1-11, aislados de Escherichia coli de aguas superficiales; carril 12, control positivo; carril 13, control negativo).
Conjugación plasmídica
El ensayo de conjugación bacteriana mostró que el 41 % (11/27) de aislados de E. coli resistente a tetraciclina tienen el potencial de transferir resistencia al grupo de las tetraciclinas (Fig. 4), lo cual se presentó principalmente en E. coli aislada de aguas superficiales del Río Bravo (81 %, 9/11). Asimismo, tras confirmar los genes tet transferidos, sólo tet(A) fue transferido a la cepa receptora en 81 % (9/11) y 72.7 % (8/11) en E. coli aisladas de agua superficiales, en tanto que la presencia de intI se demostró en las transconjugantes en 27 % (3/11).
Fig. 4 Conjugación plasmídica. (a) control negativo de Escherichia coli resistente a tetraciclina (sin conjugar) crecida en medio tripticasa de soya suplementado con tetraciclina (10 µg/mL) y con azida sódica (200 µg/mL). (b) Transcojugante crecida en medio soya tripticasa, suplementado con tetraciclina (10 µg/mL) y con azida sódica (200 ug/mL).
Tipificación del replicón plasmídico
De los 11 aislados que mostraron conjugación exitosa, sólo en cinco se caracterizaron replicones plasmídicos, entre los que se encuentra el grupo IncF (FIB, FIA y FII), IncP, IncW, Inc K/B e IncI (Cuadro IV). Los cinco aislados mostraron más de un replicón (en promedio tres).
CUADRO IV GENES TRANSFERIDOS DE LOS AISLADOS DE Escherichia coli RESISTENTE A TETRACICLINAS (DONADORA) A LA RECEPTORA (Escherichia coli J53).
| Donadoras | Transconjugantes | ||||
| Aislados | Origen | Perfil de resistencia fenotípico | Filogrupo | Replicón transferido | Genes transferidos |
| 3AS | Agua (superficial) | TET DOX GE STX CHL STR | B1 | FIA FIB FII | tet(A) intI |
| 15AS | Agua (superficial) | TET STX AMP | A | FIB P K/B | tet(A) |
| 23AS | Agua (superficial) | TET | A | I1 P FII | tet(A) intI |
| 63AS | Agua (superficial) | TET | B2 | I1 FIB FII | tet(A) intI |
| 5AR | Agua (residual) | TET MIN DOX | D | I1 FIB W | tet(A) |
| 1AS | Agua (superficial) | TET MIN DOX AK AMP STR | A | ND | ND |
| 9AS | Agua (superficial) | TET MIN STX AMP STR | D | ND | tet(A) |
| 10AS | Agua (superficial) | TET STX AMP CHL | A | ND | tet(A) |
| 11AS | Agua (superficial) | TET STX AMP CHL STR | A | ND | tet(A) |
| 21AS | Agua (superficial) | TET MIN GE STR | A | ND | tet(A) |
| 26AR | Agua (residual) | TET DOX CHL STR LVX CIP | D | ND | ND |
ND: no detectado; TET: tetraciclina; DOX: doxiciclina; GE: gentamicina; STX: trimetoprim-sulfametoxazol; STR: estreptomicina; AMP: ampicilina; MIN: minociclina; AK: amikacina; CHL: cloranfenicol; LVX: levofloxacino.
DISCUSIÓN
Las tetraciclinas, que actualmente son consideradas parte de los contaminantes emergentes (Robledo-Zacarías et al. 2017), son antibióticos que siguen teniendo relevancia terapéutica contra una gama amplia de bacterias que incluyen grampositivas y gramnegativas, micoplasmas, clamidias y rickettsias, así como otros microrganismos como parásitos protozoarios (Scaria et al. 2021).
La resistencia a tetraciclinas de primera y segunda generación está ampliamente extendida no sólo en bacterias de interés clínico sino también de origen ambiental, ya que tales antibióticos poseen uno de los resistomas más grandes (al-Bahry et al. 2016).
En el presente estudio, del grupo de las tetraciclinas, se identificó resistencia a tetraciclina, minociclina y doxiciclina. La resistencia a esta última es preocupante debido a que forma parte de la lista de medicamentos esenciales (WHO 2019), cuyo uso terapéutico abarca humanos y animales.
En los aislados de E. coli de aguas del Río Bravo, el gen tet(A) fue el más frecuente. Dichos resultados son similares a los reportados previamente a partir de diferentes fuentes ambientales (Shin et al. 2015, Belaynehe et al. 2018, Perewari et al. 2022), por lo que es posible que en los entornos acuáticos donde se recuperaron las bacterias evaluadas en este trabajo persista una presión selectiva constante que contribuye a mantener este gen entre las comunidades bacterianas, además de que los EGM que albergan a los genes tet a menudo seleccionan otros genes de resistencia (coselección), lo cual ha contribuido en gran medida al incremento de cepas de E. coli con multirresistencia (MDR) a antibióticos (Shin et al. 2015). Previamente, en el Río Bravo se detectaron antibióticos como azitromicina, ciprofloxacina, doxiciclina, eritromicina, sulfametoxazol, tetraciclina y trimetoprim en sedimentos y agua, así como bacterias con MDR y la presencia de integrones 1 y 2 (Fuentes et al. 2019).
Además de la resistencia a tetraciclinas, en este trabajo los aislados de E. coli también exhibieron resistencia a otros antibióticos, principalmente a estreptomicina, ampicilina y sulfametoxazol, lo cual es congruente con los hallazgos de Fuentes et al. (2019).
Es destacable que la mayoría de los aislados resistentes a tetraciclina pertenecía al filogrupo A, al que pertenecen de E. coli comensal (Bhowmik et al. 2022); además, la mayor parte de dichas bacterias mostraron resistencia a dos o más antibióticos, lo cual muestra la importancia de estudiar no solo a las bacterias patógenas sino también a las comensales. En el mismo contexto, es preocupante la resistencia fenotípica a miembros de las quinolonas como ciprofloxacino y levofloxacino, antibióticos de importancia crítica, ya que son de los más eficaces en la actualidad tanto en humanos como animales (Astorga et al. 2019).
Por otra parte, el gen intI está ampliamente diseminado en la familia de los Enterobacterales y bacterias de interés clínico gramnegativas, y desempeña un papel importante en la evolución y diseminación de resistencia (Deng et al. 2015, Gillings 2017). Estos EGM suelen albergar genes que codifican para la resistencia a β-lactámicos, aminoglucósidos, tetraciclina, trimetoprim, cloranfenicol, quinolonas, eritromicina y compuestos cuaternarios de amonio (Kaushik et al. 2018). En este estudio, intI se detectó en 22 % de los aislados, por lo que es posible que el resto los genes tet detectados en este trabajo estén presentes en otros EGM. Además, los resultados obtenidos en la presente investigación son comparables con lo reportado por Odetoyin et al. (2017), Belaynehe et al. (2018) y Kaushik et al. (2019).
Además, en el presente estudio sólo el 44 % de E. coli tuvo la capacidad de transferir la resistencia a tetraciclinas mediante conjugación, y fueron identificados siete replicones plasmídicos en las transconjugantes, destacando el grupo de incompatibilidad IncF. Los replicones de este grupo se caracterizan por codificar múltiples replicones (Rozwandowicz et al. 2018), por estar limitados a los Enterobacterales y por estar presentes en bajo número de copias, generalmente con tamaño mayor a 100 kb (Villa et al. 2010). Son de los más prevalentes alrededor del mundo en diferentes fuentes y se relacionan con resistencia a antibióticos (Partridge et al. 2018). Respecto a las transconjugantes en quee no se identificó ningún replicón plasmídico, podrían albergar plásmidos que no estaban en el panel evaluado (Poole et al. 2017).
Cabe señalar que la tasa de transferencia por conjugación obedece a diferentes factores entre los que destaca la presión selectiva a la que han estado expuestas las bacterias en su entorno. Asimismo, la capacidad de transferencia en la naturaleza puede no reflejarse igualmente en los estudios de conjugación en condiciones de laboratorio (Poole et al. 2017).
La presencia de más de un plásmido conjugativo representa un costo metabólico adicional para la bacteria anfitriona. Igualmente, el proceso de conjugación por sí mismo hace sensible a la bacteria al ataque de fagos, ya que los pili conjugativos sirven como receptores para éstos (Gama et al. 2017). Asimismo, en algunos plásmidos, los genes involucrados en la transferencia de material genético suelen estar reprimidos y la eficiencia de conjugación se reduce (Frost y Koraimann 2010). Cabe destacar que el presente trabajo es el primero que evalúa la transferencia de genes de resistencia en Tamaulipas.
Los hallazgos aquí reportados ponen de manifiesto la capacidad de propagación de determinantes de resistencia a antibióticos en aislados de E. coli que en su mayoría pertenecen al filogrupo de las comensales (A). Éstas pueden convertirse en importantes reservorios silenciosos de genes de resistencia y propagarlos a bacterias patógenas; en consecuencia, provocar infecciones graves y difíciles de tratar tanto en humanos como en animales.
CONCLUSIONES
Los aislados de E. coli procedentes de aguas superficiales y residuales de Tamaulipas representan un riesgo sanitario y ambiental, ya que tienen el potencial de propagar la resistencia a tetraciclinas y a múltiples antibióticos mediante coselección, por lo que podrían transferir su resistencia a otras comunidades bacterianas no sólo en el medio acuático sino también en ambientes relacionados. Por lo anterior, es de vital importancia establecer estrategias de vigilancia a mayor escala enfocadas a reducir la propagación de la resistencia a antibióticos en el ambiente, así como evaluar la virulencia de éstas y las presiones selectivas que influyen en su dispersión a otros entornos y comunidades bacterianas.
