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Introducción
El hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae Sorokin (Hypocreales: Clavicipitaceae) pertenece a la familia Moniliaceae. Fue aislado por Ilya Mechnikov en 1879 y a partir de esa fecha este hongo ha sido ampliamente estudiado, observándose de manera natural en más de 300 especies de insectos de diferentes órdenes. Metarhizium sp. puede encontrarse en el suelo donde puede sobrevivir por largos periodos o atacando insectos en los cuales causa la enfermedad llamada muscardina verde (Alves, 1998).
Los aceites esenciales son mezclas naturales complejas derivados de plantas aromáticas que pueden contener hasta sesenta compuestos en diferentes concentraciones y esto determina las propiedades biológicas de cada aceite esencial, están constituidos por terpenos, terpenoides, compuestos aromáticos y alifáticos, todos ellos volátiles y de bajo peso molecular (Bakkali, Averbeck, Averbeck, & Idaomar, 2008). En general, los aceites esenciales son considerados por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) como sustancias generalmente reconocidas como seguras (GRAS, Generally Recognized As Safety) y tienen una amplia variedad de aplicaciones en las industrias cosmética, farmacéutica, sanitaria, agrícola y alimenticia (Ambrosio, de Alencar, De Sousa, Moreno, & Da Gloria, 2017; Bakkali et al., 2008; Christofoli et al., 2015; Dornic et al., 2018; ElShafei, El-Said, Attia, & Mohammed, 2010; Halla et al., 2018; Khalili et al., 2015; Matusinski, Zouhar, Pavela, & Novy, 2015; Nguemtchouin, Ngassoum, Ngamo, & Cretin, 2010; Prakash, Kedia, Mishra, & Dubey, 2015; Rivera, Crandall, O'Bryan, & Ricke, 2015; Volpe, Nascimento, Insausti, & Grünhut, 2018; Zhaveh et al., 2015).
Una gran variedad de estudios ha demostrado que diversos aceites esenciales derivados de plantas medicinales y comestibles causan efecto inhibitorio en el crecimiento de hongos fitopatógenos (Acosta et al., 2016; Jing et al., 2014; Matusinski et al., 2015; Prakash et al., 2015), en hongos de interés médico como los dermatofitos (Danielli et al., 2017; Mahboubi, HeydaryTabar, & Mahdizadeh, 2017; Mahboubi & Kazempour, 2015). Sin embargo, no existen reportes a la fecha sobre el efecto tóxico de los aceites esenciales en los hongos entomotógenos, particularmente en el hongo M. anisopliae. Este conocimiento es importante porque los aceites esenciales además de la actividad antifúngica, tienen un amplio potencial insecticida (Badreddine, Olfa, Samir, Hnia, & Lahbib, 2015; Christofoli et al., 2015; Jemaa, Haouel, Bouaziz, & Khouja, 2012; Jiang, Akhtar, Zhang, Bradbury, & Isman, 2012; Koul, Singh, Kaur, & Kanda, 2013; Nguemtchouin et al., 2013; Polatoglu et al., 2016; Werdin, Gutiérrez, Ferrero, & Fernández, 2014) y pueden incluirse en el manejo integrado de plagas (MIP). El uso de diversos recursos y agentes en el MIP para controlar una plaga hace imprescindible conocer la compatibilidad de aquellos productos que se utilizan para determinar si su acción, al ser aplicados en conjunto, será exitosa, ya que un efecto antagónico sería indeseable. Por este motivo el objetivo de este trabajo fue determinar la compatibilidad del hongo M. anisopliae con diversos aceites esenciales mediante la evaluación del proceso de germinación de las conidias.
Materiales y Métodos
Cepas fúngicas y aceites esenciales
Las cepas de M. anisopliae CHE-CNRCB 223 (Ma56), CHE-CNRCB 237 (Ma57), CHE-CNRCB 225 (Ma60), CHE-CNRCB 227 (Ma62), CHE-CNRCB 232 (Ma67) fueron proporcionadas por el Centro Nacional de Referencia de Control Biológico (Colima, México). Los aceites esenciales que se usaron en este estudio se obtuvieron de diversas casas comerciales. Los aceites esenciales de hierbabuena, lavanda, clavo, canela, geranio y ciprés se obtuvieron de Aloha Cosmetics (Estado de México); naranja y limón de Neal’s Yard Remedies (Dorset, UK) y ajo de Maprinsa (Ciudad de México).
Producción de conidias
Cada cepa fúngica fue inoculada en matraces Erlenmeyer de 500 mL con 100 mL de caldo dextrosa Sabouraud enriquecido con 1% de extracto de levadura y suplementado con 25 μg mL-1 de estreptomicina. Los matraces se incubaron en un agitador rotatorio (STIK, Shaking Incubator PSE Series, Shangai, China) a 200 rpm por 48 h a 28 °C. Posteriormente 9 mL de cada cultivo se mezclaron con 200 mL de agar dextrosa Sabouraud a 40 °C y se vertieron 20 mL de la mezcla en cajas Petri (10 cajas por cepa). Las cepas se incubaron a 28 °C durante 21 días para la producción de las conidias. La recolección de conidias se realizó cubriendo la superficie de cada placa con 5 mL de una solución estéril de Tween 80 al 0.05%. La superficie de cada placa se raspó con una espátula y la suspension de conidias se recuperó en un frasco con tapa de rosca y la concentración se determinó con una cámara de Neubauer (Rosas-García et al., 2001).
Compatibilidad de los aceites esenciales con las conidias de M. anisopliae
Para determinar el efecto de los aceites esenciales en la germinación de la conidias, se realizaron pruebas de compatibilidad con diez aceites esenciales. Los aceites esenciales se probaron a dos concentraciones, 5 μL mL-1 y 10 μL mL-1, utilizando como base la concentración comercial insecticida (1 mL L-1) reportada por Fontes-Puebla, Fu-Castillo, and López-Arroyo (2012). Los experimentos se realizaron en tubos Falcon de 50 mL conteniendo 20 mL de caldo dextrosa Sabouraud, Tween 80 al 0.05 %, el aceite esencial y una concentración de 3 × 106 conidias mL-1 de cada cepa. Las suspensiones de conidias se incubaron en un agitador rotatorio a 150 rpm y 28 ºC ± 2 ºC por 12 h. Posteriormente, los porcentajes de germinación de las conidias se determinaron con una cámara de Neubauer. Cada experimento se repitió cinco veces. Los datos obtenidos se sometieron a un análisis de varianza y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p ≤ 0.05) with Minitab v. 17, Statistical software (State College PA, USA).
Resultados
La compatibilidad de los aceites esenciales con la germinación de las conidias de todas las cepas probadas de M. anisopliae mostró diferencia significativa a la concentración de 5 µL mL-1 (Tabla 1).
Tabla 1 Compatibilidad de la germinación de las conidias de M. anisopliae con diferentes aceites esenciales a la concentración de 5 µL mL-1
| Porcentaje de la germinación de las conidias (Media ± EE*) | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Aceite esencial† | Ma56 | Ma57 | Ma60 | Ma62 | Ma67 | F | Sig. |
| Control ‡ | 98.60 ± 0.24a | 96.60 ± 0.74a | 97.60 ± 0.40a | 98.40 ± 0.24a | 98.00 ± 0.31a | -- | NS |
| Ajo | 97.20 ± 0.86a | 97.20 ± 1.11a | 97.20 ± 1.71a | 97.20 ± 1.1a | 97.60 ± 0.40a | 0.03 | NS |
| Canela | 1.60 ± 1.60c | 0.00 ± 0.00d | 1.00 ± 1.00c | 0.40 ± 0.40c | 0.60 ± 0.40c | 0.48 | NS |
| Ciprés | 96.40 ± 0.51a | 95.80 ± 2.03a | 97.20 ± 1.71a | 95.80 ± 3.71a | 96.00 ± 1.52a | 0.07 | NS |
| Clavo | 1.00 ± 0.31c | 2.80 ± 0.86d | 2.20 ± 1.56c | 0.80 ± 0.37c | 1.00 ± 0.31c | 1.12 | NS |
| Eucalipto | 97.4 ± 0.50a | 93.00 ± 0.83a | 95.40 ± 1.21a | 95.00 ± 0.89a | 98.00 ± 0.89a | 4.99 | * |
| Geranio | 3.80 ± 0.80c | 1.40 ± 0.51d | 0.80 ± 0.37c | 2.60 ± 0.24c | 4.00 ± 1.05c | 4.57 | * |
| Lavanda | 77.20 ± 2.44b | 79.40 ± 2.84b | 81.20 ± 3.17b | 84.20 ± 1.62b | 81.80 ±4.07b | 0.8 | NS |
| Limón | 99.60 ± 0.24a | 99.20 ± 0.20a | 99.60 ± 0.40a | 99.00 ± 0.00a | 98.00 ± 0.31a | 6 | * |
| Hierbabuena | 98.40 ± 0.24a | 54.40 ± 7.81c | 94.80 ± 2.60a | 85.80 ± 3.38b | 86.6 ± 0.74b | 18.94 | * |
| Naranja | 97.60 ± 0.40a | 98.00 ± 0.44a | 98.60 ± 0.51a | 98.00 ± 0.31a | 98.00 ± 0.54a | 0.63 | NS |
| F | 1960.89 | 264.06 | 757.16 | 690.63 | 936.24 | ||
†Concentración de10 μL mL-1. ‡ Caldo Sabouraud dextrosa + Tween 80 al 0.05 %. *Valores en la misma columna con diferente letra son significativamente diferentes. Prueba de Tukey (p = 0.05), df = 10/44, p < 0.00. Los valores subrayados en la misma fila son significativamente diferentes. Prueba de Tukey (p = 0.05), df = 4/20, p < 0.00.
Fuente: Elaboración propia.
El proceso de germinación en todas las cepas fue compatible con la exposición de los aceites de ajo, ciprés, eucalipto, limón y naranja y los porcentajes de germinación fueron superiores al 93%. La germinación de las conidias fue menor al 4% en presencia de los aceites de canela, clavo y geranio, por lo que estos aceites se consideraron incompatibles para todas las cepas. Adicionalmente la germinación de las conidias de la cepa Ma57 fue incompatible con el aceite de eucalipto y la germinación de la cepa Ma60 fue incompatible con el aceite de geranio. La germinación de las conidias de la cepa Ma67 fue incompatible con el aceite esencial de limón y la de la cepa Ma57 fue incompatible con el aceite de hierbabuena.
Los aceites esenciales aplicados a la concentración de 10 µL mL-1 también mostraron diferencias significativas entre las cepas con respecto a la compatibilidad con la germinación de las conidias (Tabla 2).
Tabla 2 Compatibilidad de la germinación de las conidias M. anisopliae con diferentes aceites esenciales a la concentración de 10 µL mL-1
| Porcentaje de la germinación de las conidias (Media ± EE*) | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Aceite esencial† | Ma56 | Ma57 | Ma60 | Ma62 | Ma67 | F | Sig. |
| Control ‡ | 98.60 ± 0.24a | 96.60 ± 0.74a | 97.60 0.40a | 98.40±0.24ab | 98.0 ± 0.31ab | -- | NS |
| Ajo | 98.0 ± 0.31a | 97.20 ± 1.11a | 98.60 ± 0.92a | 98.40 ± 0.40ab | 97.20 ±0.37ab | 0.03 | NS |
| Canela | 1.80 ± 0.91b | 0.80 ± 0.58b | 1.40 ± 0.60b | 0.60 ± 0.40c | 0.80 ± 0.49c | 0.65 | NS |
| Ciprés | 99.60 ± 0.40a | 95.80 ± 3.71a | 98.60 ± 0.67a | 95.60 ± 1.83ab | 98.20 ±0.58ab | 0.87 | NS |
| Clavo | 0.60 ± 0.40b | 0.80 ± 0.37b | 0.80 ± 0.49b | 1.60 ± 0.60c | 1.40 ± 0.40c | 0.89 | NS |
| Eucalipto | 98.00 ± 0.31a | 99.40 ± 0.24a | 96.80 ± 0.49a | 98.60 ± 0.24ab | 98.80 ± 0.20a | 9.72 | * |
| Geranio | 1.40 ± 0.40b | 0.80 ± 0.58b | 0.20 ± 0.20b | 0.60 ± 0.24c | 0.40 ± 0.24c | 1.61 | NS |
| Lavanda | 2.40 ± 0.67b | 1.80 ± 0.66b | 2.00 ± 0.31b | 1.00 ± 0.31c | 0.80 ± 0.20c | 2.02 | NS |
| Limón | 99.40 ± 0.24a | 99.20 ± 0.20a | 99.20 ± 0.37a | 98.60 ± 0.51ab | 98.60 ± 0.51a | 0.92 | NS |
| Hierbabuena | 2.60 ± 0.40b | 2.80 ± 1.24b | 2.00 ± 0.31b | 1.20 ± 0.20c | 1.00 ± 0.31c | 1.68 | NS |
| Naranja | 97.80 ± 0.86a | 97.40 ± 0.67a | 97.20 ± 0.73a | 98.80 ± 0.49a | 96.60 ± 0.24b | 1.64 | NS |
| F | 9373.58 | 1469.74 | 8664.14 | 5817.85 | 18339.71 | ||
†Concentración de10 μL mL-1. ‡ Caldo Sabouraud dextrosa + Tween 80 al 0.05 %. *Valores en la misma columna con diferente letra son significativamente diferentes. Prueba de Tukey (p = 0.05), df = 10/44, p < 0.00. Los valores subrayados en la misma fila son significativamente diferentes. Prueba de Tukey (p = 0.05), df = 4/20, p < 0.00.
Fuente: Elaboración propia.
Los aceites de lavanda y hierbabuena permitieron hasta 2.8% de la germinación de las conidias en todas las cepas. El aceite de eucalipto fue el más compatible con la cepa Ma57 y la cepa Ma60 fue la más incompatible con este aceite.
Discusión
El proceso de germinación de las conidias de las cinco cepas fue afectado de manera diferente por la acción de los aceites esenciales probados. En general, las cinco cepas resultaron ser altamente incompatibles con los aceites de canela, clavo y geranio, por lo que la germinación de las conidias solo fue del 4% a 5 µg mL-1 y 10 µg mL-1. Los aceites esenciales de ajo, ciprés, eucalipto, limón y naranja fueron compatibles con el proceso de germinación a alta y baja concentraciones permitiendo una germinación cercana al 100%. El aceite de hierbabuena solo fue compatible a baja concentración con la germinación de las cepas Ma56 y Ma60 (superior al 94%) y a alta concentración fue incompatible con este proceso en todas las cepas. En la cepa Ma57, el aceite de hierbabuena redujo la germinación a 54% y el aceite de lavanda exhibió un comportamiento similar al de la hierbabuena, pero inhibió el proceso de germinación a alta concentración. Se observa que la actividad de estos dos aceites esenciales es dependiente de la concentración.
En este estudio se observa que los aceites esenciales tienen diferentes efectos sobre las conidias y las cepas ofrecen diferentes respuestas en la interacción con los aceites esenciales. Se observa que el mismo aceite esencial puede causar efectos diferentes en cepas diferentes, lo que indica que los aceites esenciales tienen especificidad en el modo de acción y esta a su vez puede depender de la concentración a la que se aplica, de acuerdo a resultados similares obtenidos por Arslan and Dervis (2010), quienes relacionaron la concentración de los aceites esenciales de romero, tomillo, salvia y oregano con la actividad antifúngica hacia el hongo Verticillium dahliae. Por otra parte, las cepas presentan diferente sensibilidad a la acción de un aceite en particular, por lo tanto, la actividad específica y la concentración de un aceite esencial son parámetros muy importantes que deben ser considerados en el diseño de insecticidas biológicos (Sánchez et al., 2011). De acuerdo con varios reportes, algunos aceites vegetales se utilizan para preparar suspensiones miscibles para la aplicación de hongos ya que mantienen la tasa de germinación y la infectividad de la conidia (Mola & Afkari, 2012; Peng, Wang, Yin, Zeng, & Xia, 2008). Así mismo, se ha observado que los aceites vegetales repelen o atraen a los insectos (Luz & Batagin, 2005) o simplemente no tienen efectos sobre ellos, sin embargo estos efectos no se han definido adecuadamente y sería posible que los aceites esenciales tuvieran una función similar. Los resultados indican que existen algunos aceites esenciales que son compatibles con el proceso de germinación de las conidias de M. anisopliae y que podrían ser utilizados potencialmente en el control de plagas. Algunos aceites como el de canela, clavo y geranio que inhibieron la germinación de las conidias, independientemente de sus propiedades insecticidas, no podrán ser aplicados de manera conjunta con este hongo para el control de insectos plaga. Se deberán realizar más estudios para definir y diseñar la combinación hongo-aceite esencial con mayores propiedades patogénicas y tóxicas que pueda ser aplicada en el control de plagas.
Conclusiones
Los aceites esenciales de ajo, ciprés, eucalipto, limón y naranja fueron compatibles con el proceso de germinación de las conidias de cinco cepas de M. anisopliae y potencialmente pueden ser utilizados de forma combinada para el control de plagas de insectos. Por otro lado, los aceites esenciales de canela, clavo y geranio no pueden ser utilizados de manera conjunta con las conidias del hongo M. anisopliae ya que no permiten la germinación de las conidias en las cepas probadas, reduciendo con ello las posibilidades de control que ejerce el hongo sobre los insectos. Los aceites esenciales de lavanda y hierbabuena podrían ser utilizados en combinación con el hongo, siempre y cuando se defina una concentración adecuada.
