INTRODUCCIÓN

Codium fragile (Suringar) Hariot (Chlorophyta, Codiaceae) es una de las 15 especies que se han registrado en las costas del Pacífico mexicano (^{Pedroche et al., 2005}). Es una macroalga bentónica con cladoma multiaxial erecto y ramificado dicotómicamente donde los filamentos cenocíticos terminan en utrículos mucronados; se distribuye en Alaska al Pacífico de Baja California (^{Pedroche et al., 2002}, ²⁰⁰⁵). Dentro de esta especie se han reconocido, como taxones infraespecíficos: una forma, cuatro variedades, una subvariedad y 12 subespecies (^{INA, 2020}). Actualmente, como nombres taxonómicamente aceptados, hay once subespecies (^{Guiry & Guiry, 2021}).

Desde hace décadas se ha reconocido, dentro de este género, a un grupo de individuos que tienen la capacidad de colonizar áreas geográficas diferentes a las de su posible origen. A estos organismos se les ha denominado especies no nativas y en particular, dentro de este género, a la subespecie Codium fragile subsp. tomentosoides (Van Goor) P. C. Silva (= Codium fragile subsp. fragile (Suringar) Hariot) (^{Silva, 1979}) como una especie invasora (^{Rueness, 1989}; ^{Provan et al., 2005}).

Las algas marinas con esta característica han llamado la atención en los últimos años por el posible impacto que tienen sobre las poblaciones nativas y su capacidad de desplazar a otras especies o incluso modificar el ambiente en su entorno (^{Blackburn et al., 2014}; ^{Vaz-Pinto et al., 2014}). Como resultado, varias iniciativas en niveles diversos se han establecido en México con la finalidad de darle seguimiento a estas especies no nativas. Una de ellas, es la de la Comisión Nacional para Conocimiento y Uso de la Biodiversidad (CONABIO) que ha generado un banco de datos sobre las especies invasoras y cuya influencia ha permeado a nivel nacional, pues esta información fue empleada para publicar el Acuerdo sobre especies exóticas (^{SEMARNAT, 2016}). En ambas referencias se incluye la subespecie no nativa como presente en México y con la categoría de especie exótica (^{CONABIO, 2021}; ^{CABI, 2021}).

En otras partes del mundo esta entidad pasó desapercibida por mucho tiempo, debido en parte a que las especies no nativas son similares morfológicamente a las residentes, en sus etapas iniciales de colonización (^{Trowbridge, 1996}). ^{Silva (1955)} fue el primero en reconocer que Codium fragile era un complejo de poblaciones y subpoblaciones y que era la especie, de este género, con la mayor distribución geográfica, presentándose en todos los continentes. ^{Provan et al. (2005)}, mediante estudios moleculares con tres marcadores de cloroplasto (rbcL, trn, rpl), reconocieron qué de las once subespecies existentes, solo C. fragile subsp. tomentosoides podría considerarse como una especie invasora. Lo que más adelante también constataron ^{Verbruggen et al. (2017)} con estudios morfométricos, y moleculares, quienes emplearon adicionalmente el marcador tufA y sugirieron que C. fragile consta realmente de dos especies, una incluye al clado “invasor” y la otra al resto de las subespecies. Sin embargo, estos autores se abstuvieron de realizar los cambios nomenclaturales correspondientes, debido a la ausencia de congruencia entre el marcador empleado, con otros marcadores explorados (^{Provan et al., 2008}).

El primer registro, aunque no preciso, de Codium fragile en costas mexicanas fue el de ^{Collins (1909)}, como C. mucronatum f. (var.) californicum (J. Agardh) De Toni & Levi, quien mencionó su presencia de Alaska a México. Posteriormente, ^{Hollenberg (1942)} y ^{Silva (1951)} registraron a la especie para Bahía de Todos Santos, Baja California. A la fecha, la especie se ha registrado en cuarenta localidades en la costa occidental de Baja California, alcanzando, hacia el sur, una distribución hasta Punta Abreojos (26° 42’ N, 113° 35’ O) (^{Pedroche et al., 2002}). También existen registros para Bahía de la Paz, Golfo de California, Puerto Peñasco, Sonora y Punta Melaque, Jalisco que seguramente no son representativos de esta especie por las condiciones cálidas de sus aguas (^{Pedroche et al., 2005}). Es importante mencionar aquí que todos estos registros corresponden a C. fragile sin reconocer a subespecie alguna, excepto el registro de C. fragile subsp. mexicanum Maggs (^{Brodie et al., 2007}) para Punta Eugenia, en Baja California, México.

^{Pedroche (2001)} confirmó que el taxón C. fragile subsp. tomentosoides, no está presente en el Pacífico mexicano. Propuesta mantenida en ^{Okolodkov et al. (2007)}, ^{Miller et al. (2011)} y ^{Aguilar-Rosas et al. (2014)}. Incluso ^{Provan et al. (2008,} fig. 3) reconocen un haplotipo mexicano diferente a la cepa invasora. ^{Verbruggen et al. (2017)}, como se apunta arriba, denominaron un “clado fragile” para asignar a los individuos no nativos y un “clado nativo”, en donde se encuentran las subespecies: C. fragile subsp. bonnespei Maggs, C. fragile subsp. novae-zelandie (J. Agardh) P. C. Silva, C. fragile subsp. tasmanicum (J. Agardh) P. C. Silva y C. fragile subsp. mexicanum. Seguramente, como resultado de los trabajos publicados por ^{Provan et al. (2008)}, Maggs estableció el nombre Codium fragile subsp. mexicanum con localidad tipo en Punta Eugenia, Baja California (^{Brodie et al., 2007}). En este contexto y desde el punto de vista nomenclatural, previo a 2007, México no tenía representantes de otra subespecie que no fuera la subespecie típica: C. fragile subsp. fragile.

El objetivo del presente trabajo fue certificar, con base en información proporcionada por los marcadores psb y 23S del cloroplasto, que han brindado resultados alentadores en la discriminación de especies del Orden Bryopsidales (^{Pedroche, 2001}; ^{Tufiño-Velázquez & Pedroche, 2019}), la pertenencia de las poblaciones de C. fragile de las costas del Pacifico mexicano al clado invasor o nativo.

MATERIAL Y MÉTODOS

En el presente trabajo se incluyeron individuos recolectados en diversas localidades de Baja California, México; California y Oregón, USA y Banda, Japón. Se incluyeron, además en el análisis, secuencias originales procedentes de DNA genómico aislado de individuos recolectados a lo largo de la costa del Pacífico mexicano y que representan a la mayoría de las especies registradas para esta costa (Tabla 1).

Para la extracción, amplificación y obtención de secuencias se siguieron los protocolos y los cebadores empleados por ^{Pedroche (2001)} y ^{Tufiño-Velázquez & Pedroche (2019)}, los números de registro en GenBank se encuentran en la tabla 1. Las secuencias obtenidas fueron editadas y alineadas usando Muscle en MEGA versión X (^{Kumar et al., 2018}; ^{Stecher et al., 2020}) y Opal en MESQUITE versión 3.61 (^{Wheeler & Kececioglu, 2007}; ^{Maddison & Maddison, 2019}). Los análisis filogenéticos se realizaron con las directrices presentes en ^{Tufiño-Velázquez & Pedroche (2019)} empleando como grupo externo, a individuos del género Bryopsis. En este análisis, se construyeron matrices para cada marcador y una matriz concatenada, con las 31 secuencias generadas en el presente estudio. La elección del modelo evolutivo, al que se ajustan los datos, se obtuvo empleando JModeltest2 (^{Guindon & Gascuel, 2003}; ^{Darriba et al., 2012}). Se realizaron análisis de máxima verosimilitud (ML) y de inferencia bayesiana. La filogenia de ML fue inferida utilizando PAUP, versión 4.0a (build 163), (^{Swofford, 2001}) y MEGA versión X (^{Kumar et al., 2018}; ^{Stecher et al., 2020}), eligiendo el algoritmo de búsqueda heurística y el procedimiento de intercambio TBR para la reconexión de ramas en el árbol, y se estimó el respaldo nodal mediante análisis de bootstrap (100 réplicas). Para el análisis bayesiano se empleó la matriz combinada con la ayuda de MrBayes v3.2 (^{Ronquist et al., 2012}). La desviación estándar media de las frecuencias indicó que las muestras de los árboles se volvieron cada vez más parecidas y que se alcanzó una distribución estacionaria. Los árboles fueron visualizados con FigTree v. 1.4.3. (^{Rambaut, 2018}). Las distancias genéticas se obtuvieron con PAUP, versión 4.0a (build 163), (^{Swofford, 2001}) y con MEGA versión X (^{Kumar et al., 2018}; ^{Stecher et al., 2020}) con la opción de distancia “p” no corregida.

RESULTADOS

Las secuencias de la región 23S constaron de 721 pb y en el marcador psb fueron 468 pb, de este último 85 posiciones corresponden a la región conservada de psbh (photosystem II reaction center protein H) y 80 posiciones a la de psbT (photosystem II reaction center protein T), restando 303 sitios variables. Las topologías de los árboles para ambos marcadores, así como del análisis combinado muestran congruencia (figuras 1-3). El clado Codium fragile se distingue como un grupo monofilético robusto con valores altos de “bootstrap” en los análisis de ML para el marcador 23S (94) (fig. 1) y para psb (99) (fig. 2). La figura 3 muestra la topología del análisis concatenado bayesiano con probabilidad posterior de 100. Se distinguen dos clados hermanos uno denominado “nativo” formado por individuos procedentes de Point Reyes y Tomales Bay en California, USA y Rancho Packard, Punta Baja e Isla Guadalupe en Baja California, México. Por su parte los individuos considerados como miembros del clan invasor están presentes en Richmond y Alameda, California, en la costa oeste de Estados Unidos y Banda, Toteyama-shi, Japón. Para estos clados, la distancia genética para el marcador 23S es de 0.4%, en cambio para psb se ubica en 2.2% La distancia no corregida (“p”) en el marcador 23S, entre los individuos de Japón y los de California de la cepa invasora fue de 0-0.1%, de igual manera la correspondiente entre los individuos del clado nativo (California-México) se ubicó en los mismos intervalos (0-0.1%). Las distancias genéticas inter-especie se ubican en 6% para el marcador 23S y para psb se ubican en 25%.

Figura 1 Hipótesis filogenética recuperada con el marcador 23S. La historia evolutiva se dedujo utilizando el método de máxima verosimilitud y el modelo de Tamura-Nei (^{Tamura & Nei, 1993}). Se muestra el árbol con la mayor probabilidad de registro (-2189.58). El porcentaje de árboles (bootstrap) en los que los taxones asociados se agrupan se muestra junto a las ramas. Los árboles iniciales para la búsqueda heurística se obtuvieron automáticamente aplicando algoritmos Neighbor-Join y BioNJ a una matriz de distancias por pares estimadas utilizando el modelo Tamura-Nei, y luego seleccionando la topología con un valor de probabilidad logarítmica superior. De acuerdo con JModeltest2 (^{Guindon & Gascuel, 2003}; ^{Darriba et al., 2012}), el modelo que mejor se ajustó a los datos, seleccionado por AICc, fue TPM2uf+I+G, con los siguientes valores: Lset base = (0.2938 0.1884 0.2596), nst = 6, rmat = (2.3958 3.9677 2.3958 1.0000 3.9677), rates = gamma shape = 0.5070, ncat = 4, pinvar = 0.5130. El árbol se dibuja a escala, con longitudes de rama medidas en el número de sustituciones por sitio (escala). Este análisis involucró 37 secuencias de nucleótidos. Hubo un total de 738 posiciones en el conjunto de datos final. Se realizaron análisis evolutivos en PAUP versión 4.0a (^{Swofford, 2001}) y MEGA X (^{Kumar et al., 2018}; ^{Stecher et al., 2020}), resultando en topologías congruentes. El recuadro indica el clado Codium fragile. 

Figura 2 Hipótesis filogenética recuperada con el marcador psb. La historia evolutiva se dedujo utilizando el método de máxima verosimilitud y el modelo de Tamura-Nei (^{Tamura & Nei, 1993}). Se muestra el árbol con la mayor verosimilitud (-3575.24). El porcentaje de árboles (bootstrap) en los que los taxones asociados se agrupan se muestra junto a las ramas. Los árboles iniciales para la búsqueda heurística se obtuvieron automáticamente aplicando algoritmos Neighbor-Join y BioNJ a una matriz de distancias por pares estimadas utilizando el modelo Tamura-Nei, y luego seleccionando la topología con un valor de probabilidad logarítmica superior. Se utilizó una distribución Gamma discreta para modelar las diferencias de velocidad evolutiva entre los sitios (5 categorías (+G,parámetro = 0,5574)). El modelo de variación de tasas permitió que algunos sitios fueran evolutivamente invariables ([+I],0,00% sitios). El árbol se dibuja a escala, con longitudes de rama medidas en el número de sustituciones por sitio (escala). Este análisis involucró 34 secuencias de nucleótidos. Hubo un total de 658 posiciones en el conjunto de datos final. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA X (^{Kumar et al., 2018}; ^{Stecher et al., 2020}). El recuadro indica el clado Codium fragile. 

Figura 3 Hipótesis filogenética recuperada con la información combinada (concatenada) de los marcadores 23S y psb. La historia evolutiva se dedujo utilizando el método de inferencia bayesiana en MrBayes v3.2 (^{Ronquist et al., 2012}), definiéndose nst = 6 y rates = invgamma para la partición molecular, el número de generaciones fue de 10 millones y se descartó una fracción de 25%. La desviación estándar media de las frecuencias indicó que las muestras de los árboles se volvieron cada vez más parecidas y que se alcanzó una distribución estacionaria (split frequency = 0.000525). Los números en las ramas representan valores de probabilidades posteriores en porcentaje. El recuadro indica el clado Codium fragile. 

DISCUSIÓN

Las divergencias en otros marcadores se encuentran en un 14% máximo para inter-especie y 0.7-0.8% intra-especie con rbcL (^{Verbruggen et al., 2007}; ^{Verbruggen & Costa, 2015}) mientras que en tufA oscila entre 6-22%, para este mismo marcador, a nivel intra-especie, oscila entre 0.9-1.5% (^{Lee & Kim, 2015}; ^{Verbruggen & Costa, 2015}). Como se puede observar, tufA posee niveles más altos de divergencia que rbcL al igual que 23S en este estudio, no así con respecto a psb. Como se mencionó arriba, las topologias de 23S y psb en este estudio son congruentes; sin embargo la dificultad para amplificar y alinear los fragmentos de psb sugiere que 23S es un mejor candidato para contrastar con tufA, que se ha sugerido puede ser el marcador de barras universal para algas marinas (^{Saunders & Kucera, 2010}) o para el género Codium (^{Verbruggen & Costa, 2015}).

^{Provan et al. (2005)} demostraron que la variabilidad genética entre los clados que se pueden diferenciar en C. fragile es muy baja y postularon que quizá esto se debe al efecto fundador sufrido durante la invasión, cuando menos en las poblaciones que han arribado al Mediterráneo. Los resultados de distancias genéticas aquí presentadas en dos marcadores diferentes, 23S y psb, a los estudiados por ^{Provan et al. (2005)}, demuestran que estas distancias no son comparables a las existentes entre especies y por lo tanto se diría que se trata de entidades infra específicas hasta cierto punto geográficamente discretas. En general, se ha considerado que las áreas que poseen la más alta diversidad son las áreas de origen del taxón involucrado (^{Briggs, 1974}); sin embargo, esto no ha sido contrastado con estudios filogenéticos en la mayoría de los organismos y sobretodo, en el grupo de las macroalgas marinas. Dos de las muchas preguntas importantes que surgen de este caso, como en muchos otros son: ¿cuál es el área de origen del taxón y cuáles son los tiempos de divergencia en este grupo? (^{Ilves & Taylor, 2008}). ^{Silva (1955)} especuló que el origen de C. fragile podría ser Japón, pues todas las subespecies reconocidas, en ese entonces, tenían representantes en esa región; por ende, las regiones con mayor diversidad son las áreas de origen de los taxa, como se mencionó líneas arriba. Aunado a esto y de acuerdo con las teorías del origen de la diversidad tropical, la mayoría de las especies acuáticas proceden de los centros de mayor diversidad en el Indo Pacífico, de un área en específico conocida como el Triángulo Coral (^{Bowen et al., 2013}) y aunque también es posible una radiación en la dirección contraria, parecería que en Codium es poco probable. En cuanto a la divergencia y en esa misma línea de pensamiento, todas las poblaciones del Pacífico norte comparten un solo haplotipo, a excepción de las de California y México (^{Provan et al., 2008}), demostrando una gran homogeneidad. Entonces, ¿estos últimos derivan de la subespecie C. fragile subsp. fragile pero se han “naturalizado” y ahora son nativos? Codium fragile subsp fragile se localiza en ambientes de aguas tranquilas y con poco movimiento y quizá por dispersión, poblaciones se establecieron en ambientes diferentes dando origen a las subespecies C. fragile californicum y C. fragile mexicanum. ¿No podrían ser posteriores a la introducción de la invasora? De otra manera tendríamos que formular una hipótesis diferente: Los haplotipos americanos alcanzaron estas costas de manera histórica e independiente de C. fragile subsp fragile, que arribó por la intervención humana ¿Cuál es la relación histórica de estos taxones? Recordemos que con los marcadores empleados en el presente trabajo no hay diferencias entre algunas de las poblaciones californianas y las mexicanas. Una alternativa de análisis podría ser implementar el método de ML propuesto por ^{Ree et al. (2005)} que consideran una evaluación de los caracteres ancestrales, incorporando tiempos de divergencia conocidos; por ejemplo, calibrándolos con el origen del mar de Japón hace casi 15MA y la dispersión desde ahí hacia el Pacífico este. Esta aproximación ha dado resultados interesantes en el estudio de la distribución de algunos peces (^{Ilves & Taylor, 2008}) en donde se ha demostrado el origen occidental de la diversificación.

Así, el taxón conocido como C. fragile subsp. fragile es originario de Japón, cuando menos su nombre, y por lo tanto su presencia en América y en particular en México se consideraría una invasión; sin embargo, en México y con las investigaciones hasta ahora realizadas, se confirma la presencia de un haplotipo diferente que corresponde quizá a lo que se denomina C. fragile subsp. mexicanum. Un haplotipo diferente al de California (C. fragile subsp. californicum (J. Agardh) Magss) según algunos autores (^{Provan et al., 2008}) y reconocido morfológicamente como existente desde hace algún tiempo (^{Silva, 1951}, ¹⁹⁷⁹), aunque los análisis de psb y 23S, aquí presentados, no reconocen diferencias entre los individuos de USA y México pertenecientes a este haplotipo. De esta manera, es posible que todos los registros mexicanos sean representativos de la subespecie C. fragile subsp. mexicanum.

Uno de los retos más importantes en el estudio de las invasiones es distinguir entre los patrones, que son los momentos temporales de que disponemos, de aquellos procesos que han llevado a la presencia de ciertas especies en lugares en donde presumiblemente no se encontraban. Por medio de los patrones podemos identificar presencias, pero ¿cómo determinar procedencias y la posibilidad de evolución posterior a la colonización (proceso) de especies no nativas? Poco se sabe sobre que tan rápido evolucionan las poblaciones que colonizan nuevos ambientes (^{Cox, 2004}); algunos estudios han demostrado que estos espacios promueven una especiación rápida como resultado de una adaptación divergente, pues el aislamiento reproductivo puede actuar en solo unas pocas generaciones, o puede requerir una acumulación larga y gradual (^{Hendry et al., 2000}). Sabemos que las oportunidades para el aislamiento alopátrico son menores en los océanos, lo que deja mayores oportunidades para la especiación a lo largo de los límites ecológicos y en la medida en que la dispersión y el flujo de genes influyen en la especiación, el proceso no puede ser el mismo en tierra y mar o cuando menos debe trabajar en gran medida, a diferentes escalas (^{Bowen et al., 2013}). Estudios más amplios, de las poblaciones en Baja California e incorporando al marcador tufA, bridarán información sobre la situación genética de nuestras poblaciones, pero sobretodo sobre su historia evolutiva.