Sensor CMOS como medidor de absorbancia

La absorbancia (A) es función del registro de intensidades que son obtenidas por el detector, es decir, es una comparación entre la intensidad de referencia (Ir) (intensidad medida en el detector sin muestra) y la intensidad de la muestra (I). La absorbancia puede ser calculada en función de dichos términos, aplicando la conocida ley de Lambert Beer como sigue ^[3]:

Por ser una comparación, la sensibilidad del detector es importante en los límites inferiores y superiores de medición admisibles del detector, por ejemplo, si el detector es capaz de medir absorbancias del orden de 5, significa que este puede medir intensidades muy bajas del orden de 0.001% de la intensidad de referencia, lo anterior permite medir concentraciones muy altas de un soluto. Por el contrario, absorbancias del orden de 0.001 significa que el detector debe ser capaz de medir intensidades altas del orden de 99.77 % de la intensidad de referencia, por lo tanto, puede medir concentraciones muy bajas de un soluto ^[3].

Habitualmente en espectrofotometría se emplean fotomultiplicadores como detectores, los cuales generan una corriente que es proporcional a la intensidad incidente, por lo tanto, el cálculo de la absorbancia se realiza empleando la Ecuación (1), pero en términos de intensidad de corriente.

Sin embargo, en la actualidad las cámaras digitales CMOS han empezado a remplazar este tipo de detectores ya que pueden ser empleadas como discriminadores de niveles de luz, es decir como sensores de luminancia. Para este caso, la luminancia es calculada a partir de la siguiente ecuación:

Dónde: L es la luminancia en candela/metro ^[2], N es el valor del pixel en la imagen digital en formato 8 o 16 bits, t es la velocidad de obturación (cuadros por segundos), f es el número de apertura, S es la sensibilidad del detector ISO, y k es una constante de calibración obtenida a partir de luminancias estándares ^[4].

Debido a que la absorbancia es obtenida por una división, esta resulta ser la misma en términos de luminancia, valor de pixel en 8 bits o 16 bits. Lo anterior se confirma en la Tabla 1, donde se muestra un valor de I e Ir y su cálculo de absorbancia en términos de las tres magnitudes. Debido a que es posible estimar la absorbancia en niveles de gris, en esta investigación usamos el formato de valor de pixel de 8 bits para su cálculo.

Por otro lado, el rango de medición inferior de absorbancia de una CMOS, puede estar limitado por la corriente de oscuridad, la cual es debida a electrones generados térmicamente en total oscuridad, por ejemplo, la CMOS empleada en esta investigación, tiene un ruido promedio de oscuridad de 2±1pixel en niveles de gris, lo cual equivale a una medición de absorbancia de 1.4065, considerando una intensidad de referencia de 255. El límite superior de medición de absorbancia, está limitado por la diferenciación entre niveles de gris a intensidades altas, para este experimento se observaron diferencia significativa entre niveles de gris hasta 251±1 pixel, lo cual equivale a una absorbancia de 0.0068. Por lo anterior el rango de medición de absorbancia de la CMOS es de 2.0986 a 0.0068.

Sistema óptico

Para la generación de las imágenes sólidas de solutos, se empleó un microscopio invertido marca Olympus modelo CKX41^[5], (ver Figura 1a), trabajando en campo claro, la descripción del funcionamiento del MLA (microscopio medidor de absorbancia) se describe a continuación: La luz incoherente proveniente de la fuente de tungsteno es filtrada a luz cuasi cromática por medio de un filtro pasa banda modelo FB510-10-Ø1 (marca thorlabs ^[6]), cuya longitud de onda central es de CWL=510 ± 2 nm, y un ancho medio de FWHM = 10 ± 2 nm, este filtro es insertado en el control deslizante modelo IX2-SLP en la poción reservada para iluminación en campo claro, las otras dos posiciones empleadas para iluminación en contraste de fase no son empleadas en el experimento, lo anterior se muestra en la Figura 1b.

Figura 1. a) Sistema optico empleado para la captura de imágenes solidas de reacciones enzimaticas y b) filtro y control dezlizante para iluminacion cuasi cromática. 

Posteriormente la luz cuasi cromática es dirigida a una placa de ELISA de 96 posos por medio de un condensador que genera iluminación tipo Köhler, cada poso puede ser seleccionado por el usuario por la platina x,y del microscopio. La intensidad e imagen de cada poso es colectada por medio del objetivo de 60x (N.A=0.85), de la marca edmundoptics y dirigida a una cámara digital CMOS Infinity 1 de 2.0 megapixeles de la marca lumera, con tamaño de pixel de 4.2µmx4.2µm y una resolución de imagen de 1600x1200 pixeles ^[7]. La intensidad promedio y la absorbancia para cada poso de la imagen digital es calculada por medio de un programa el cual es descrito en la siguiente sección. Cabe mencionar que el experimento es llevado a cabo en un cuarto oscuro, con el fin de evitar la luz parasita.

Imagen sólida

La imagen sólida de una reacción enzimática, en esta investigación, se refiere a la imagen digital obtenida por un microscopio conectado una cámara digital, en este caso no es el interés la estructura presente en la imagen digital, sino el valor promedio de los pixeles en la imagen de luminancia ^[8], el cual es empleado en el cálculo de la absorbancia. El procedimiento para obtener este valor es el siguiente: Se captura una imagen sólida con una cámara digital CMOS, esta imagen es descompuesta en sus componentes RGB, las cuales son empleadas para obtener una imagen de luminancia relativa de acuerdo a la norma CIE XYZ ^[9] posteriormente se calcula la intensidad promedio Im de todos sus pixeles, aproximando al valor más próximo. Este valor es empleado para calcular la absorbancia correspondiente a la imagen sólida empleando la Ecuación (1) y considerando Ir=251. Este procedimiento se muestra en la Figura 2.

Figura 2. Procedimiento de conversión de imagen sólida a valor de absorbancia. 

Un ejemplo de una secuencia de imágenes solidas de violeta de genciana para concentraciones en aumento, son presentadas en la Figura 3, en cada caso se obtienen el promedio de intensidad de los pixeles en la imagen de luminancia, y como se puede observar esta disminuye conforme aumenta la concentración del colorante, mientras que la absorbancia aumenta progresivamente. En estas imágenes solidas no existe alguna estructura, ya que la intensidad promedio y el valor de absorbancia es la de interés.

Figura 3. Secuencia de imágenes solidas de colorante violeta de genciana para concentraciones de 1.5 a 4.5 mg/dL. Para cada imagen C=concentración mg/dL, Im=Intensidad promedio de pixeles en la imagen, A=Absorbancia. 

Programa para el cálculo de Absorbancia y concentración

Se implementó un programa que realiza mediciones de absorbancia y concentración a partir de imágenes solidas de solutos, este programa se realizó en el software Labview 2015 y utilizando el toolkit visión ^[10], este último permite la activación y captura de la cámara CMOS, además de contar con funciones especializadas en el procesamiento de imágenes.

El programa cuenta dos opciones, medición de absorbancia (A) y medición de concentración (C), que el usuario puede elegir de acuerdo a sus necesidades (ver Figura 4). Para el caso de medición de absorbancia, el programa solicita al usuario introducir el número de lecturas (1) a realizar, posteriormente el usuario ubica el primer poso a leer en la placa de Elisa utilizando la platina x, y (2) del microscopio; a continuación el programa activa la cámara CMOS y captura una imagen (3) de tamaño 1600x1200 pixeles. Las imágenes RGB de la imagen captura son extraídas y empleadas para obtener una imagen de luminancia (4) de la cual se obtiene la intensidad promedio I_m (5) de todos sus pixeles, redondeado al valor más próximo. Este valor es empleado para calcular la absorbancia correspondiente a la imagen sólida en turno (Ecuación (1) y considerando Ir=251). El proceso de conversión de imagen solida a medición de absorbancia, es mostrado en la Figura 2. Posteriormente el programa retorna al paso 2 y el usuario ubica un nuevo poso a leer. Finalmente, las n mediciones de absorbancia son almacenadas en un vector (6) que contiene las relaciones de concentración conocidas y sus mediciones de absorbancia.

Figura 4. Pasos que realiza el programa para obtener mediciones de absorbancia y concentración de reacciones enzimáticas. 

Para la opción de la medición de concentración el vector que contiene las relaciones de concentración y absorbancia es utilizado para obtener una recta de calibración (7) por medio de una regresión lineal, esta recta es del tipo:

Dónde: A es la absorbancia, m es la pendiente de la recta, c es la concentración, y b es la intersección con el eje de la absorbancia. Por último, el programa estima concentración (8) a partir del despeje de la recta de calibración en términos de la concentración (ver Ecuación (3)). El diagrama de flujo del programa es mostrado en la Figura 4.

Colorante de utilidad clínica

Con el único fin de analizar el desempeño del MLA, se realizó comparación cuantitativa de mediciones de absorbancia entre un lector de elisa modelo H Reader 1 y el sistema propuesto. Para lo anterior, se emplearon diferentes concentraciones de un colorante de utilidad clínica como lo es el violeta de genciana (C₂₄H₂₈N₃Cl al 1 % en agua destilada), el cual usualmente se emplea para la realización de curvas de calibración en determinación de metabolitos en sangre. Se preparó una solución stock de violeta de genciana a una concentración de 100mg/dL, y se obtuvieron disoluciones en agua destilada de 1.5 a 6.5 con variación de 1mg/dL (C en la columna uno de la Tabla 2). Las mediciones de absorbancia para los dos lectores son mostradas en la siguiente tabla.

Se puede observar en la Tabla 2 que las mediciones de abs-E y abs-MLA (mediciones de absorbancia del lector de ELISA y el sistema propuesto respectivamente) son muy cercanas unas a otras, por lo tanto, podemos intuir que el sistema MLA es comparable con lectores de absorbancia comerciales.

Por otro lado, con el fin de cuantificar la exactitud en la medición de concentraciones por parte del MLA, se obtuvo la recta de calibración del sistema aplicando una regresión lineal a los datos de concentración y Abs-MLA obteniendo un R2 =0.9959. Dicha ecuación lineal es despejada con respecto a la concentración para su correspondiente cálculo, como se muestra en la siguiente ecuación:

Dónde: C-MLA es la concentración estimada en mg/ dL, A es la absorbancia, 0.0207 es la intersección en el eje de la absorbancia y 0.3064 pendiente de la recta de calibración. Así mismo el error en la medición en la concentración (E-C) es mostrado en la cuarta columna de la tabla dos, el cual es calculado a partir del valor absoluto de la diferencia de la concentración experimental con la concentración calculada con la ecuación cuatro, en esta columna se observa que el error aumenta conforme aumenta la concentración, esto puede deberse a que la diferencia entre intensidad de niveles de gris de imágenes digitales de soluciones, a concentraciones altas es muy pequeña. Por ejemplo, para concentraciones de 5.5 y 6.5mg/dL la variación de intensidad es tan solo de dos en una escala de grises. Lo anterior también se puede verificar observando la Figura 5, ya que ambas graficas se separan más a concentraciones altas.

Figura 5. Grafica comparativa de mediciones de absorbancia de abs-E y abs-MLA. 

Recta de calibración de glucosa

Fue realizada una recta de calibración con el reactivo líquido para la determinación fotométrica de glucosa en suero o plasma del Grupo Mexlab ^[11], con el objetivo de cuantificar el desempeño del MLA comparado con un lector de ELISA empleado en la investigación. La recta de calibración del sistema aplicando una regresión lineal a los datos de concentración y Abs-MLA fue obtenida con un R2 =0.9991. Dicha recta de calibración es despejada con respecto a la concentración para su cálculo, como se muestra en la siguiente ecuación:

Dónde: C-MLA es la concentración estimada por el sistema propuesto en mg/dL, A es la absorbancia, 0.0207 es la intersección en el eje de la absorbancia y 0.3064 pendiente de la recta de calibración. En la tabla tres se muestran las mediciones de absorbancia de ambos lectores (Abs-E y Abs-MLA), columna dos y tres, mientras que en la cuarta y quinta columna son mostrados las concentraciones estimadas con la Ecuación cinco (C-MLA) y su error respectivamente (E-C).

La comparación de las rectas de calibración para los dos sistemas se muestra en la Figura 6, donde se puede notar que a concentraciones altas ambas se empiezan a separar, posiblemente porque la cámara digital CMOS tiene menos sensibilidad a concentraciones altas.

Figura 6. Gráfica comparativa de mediciones de absorbancia de Abs-E y Abs-MLA, para el caso del reactivo líquido para la determinación fotométrica de glucosa en suero. 

Utilidad clínica del MLA

Uno de los objetivos principales de esta investigación, es el empleo del MLA como una alternativa a lectores de absorbancia convencionales, para análisis clínicos, en este caso el sistema tiene una doble funcionalidad, ya que puede servir como microscopio o cuantificador de concentraciones.

Por lo anterior se realizó la determinación de glucosa en muestras problemas de pacientes voluntarios de la Universidad de la Cañada, otorgándose al individuo una copia del consentimiento informado para el aseguramiento de su participación en esta investigación.

Se formaron dos grupos de tres pacientes, el primer grupo son individuos clínicamente sanos y el otro grupo fueron diagnosticados previamente como hipoglucémicos. A estos grupos se les extrajo 5 mL de plasma sanguíneo sin coagulante, después de dejar coagular la muestra, se continuo a centrifugar las muestras a 3500 rpm durante 5 minutos, para la obtención de suero sanguíneo. Una vez obtenidas la muestras, se realizó la reacción enzimática de Trinder God-Pod ^[11] y finalmente las mediciones de concentraciones fueron estimadas empleando el analizador de química sanguínea semiautomatizado (AQSA), modelo Easykem plus y el MLA, para este último caso, la concentración fue estimada a partir de la ecuación cinco correspondiente a la recta de calibración glucosa. Los resultados de ambos equipos son comparados en la Tabla 4.

PC: Número de paciente. C-AQSA: Medición de concentración con AQSA en mg/dL. Abs-MLA y C-MLA: Lecturas de absorbancia y concentración del sistema propuesto respectivamente. E-C: Error en concentración, calculado a partir de C-AQSA menos C-MLA.

Como puede observarse en la tabla cuatro, los pacientes uno y dos presentaron rangos de medición de absorbancia fuera del rango, permitido por el MLA, mientras que los otros cuatro pacientes están dentro del rango de medición, también puede observarse que los errores de medición no fueron mayores a 1mg/dL.