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Introducción
Las plantas constituyen un recurso valioso en los sistemas de salud de los países en desarrollo. Aunque no existen datos precisos para evaluar la extensión del uso global de plantas medicinales, la Organización Mundial de la Salud (OMS, 2013) ha estimado que más del 80% de la población mundial utiliza, rutinariamente, la medicina tradicional para satisfacer sus necesidades de atención primaria de salud y que gran parte de los tratamientos tradicionales implica el uso de extractos de plantas o sus principios activos (Gallegos-Zurita & Gallegos, 2017).
La información sobre las propiedades curativas de las plantas medicinales se ha transmitido a lo largo de los siglos entre generaciones de comunidades humanas; la existencia de la medicina tradicional depende sobre la diversidad de especies de plantas y el conocimiento de su uso como medicamento (Maldonado et al., 2020), esto ha llevado a los científicos a evaluar extractos de plantas medicinales de semillas, cortezas, flores y hojas para aislar posibles antimicrobianos futuros, debido a que el creciente número de antibióticos comerciales están perdiendo su eficacia frente a los microorganismos que cada vez son más resistentes (Masqui et al., 2022).
A nivel etnobotánico, en la amazonia ecuatoriana se cuenta con el conocimiento ancestral de los pobladores nativos del interior de la Amazonía y en particular de la Provincia de Pastaza que refieren el uso de los extractos con actividad farmacológica, entre ellas se encuentra la planta Bidens pilosa, que se caracteriza por su variedad de principios activos (Ruiz et al., 2022), siendo el principal constituyente aislados los poliacetilenos conjugados como la fenilheptatrina y el a-tertienil que inhiben los organismos patógenos (Arroyo et al., 2010).
Por su parte en la Eryngium foetidum se ha determinado numerosos compuestos aromáticos como la 2,4,5-trimetilbenzaldehído y 5 -decanona reportados por Hemachandra et al. (2021) y su estudio se ha orientado a sus efectos antimicrobianos para el control en el crecimiento de Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli y Salmonella donde se evidenció la aparente sensibilidad de las bacterias gran-positivas y la resistencia de las gran-negativas (Malik et al., 2016).
El objetivo del presente trabajo fue identificar cualitativamente los metabolitos secundarios y evaluar la actividad antibacteriana in vitro de los extractos etanólicos de B. pilosa y E. foetidum determinando la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración mínima bactericida (CMB) sobre cepas de S. aureus, E. coli y S. typhimurium
Materiales y métodos
Material de estudio
Material vegetal: Las plantas de B. pilosa y E. foetidum, se recolectaron en el Centro de Investigación, Posgrado y Conservación de la Biodiversidad Amazónica (CIPCA), ubicado en el Cantón Arosemena Tola de la Provincia Napo, Ecuador (01º 11' 29" S, 77º 51' 25" O a una altura de 550 msnm, temperatura media de 25 °C, clima cálido húmedo, precipitación anual de 3538 mm y humedad relativa de 76%. Las especies fueron colectadas en los meses de mayo y noviembre de 2019 y se identificaron con base a sus características taxonómicas; posteriormente las hojas de cada planta se separaron de los materiales extraños, se pesaron y después se secaron a la sombra a temperatura ambiente durante ocho días hasta alcanzar un peso constante y por diferencia de peso se determinó el contenido de humedad de 12%. Las muestras de 1,2 mm, se empacadas en frascos de 500 g y almacenaron en un lugar limpio y seco hasta su procesamiento (León Méndez et al., 2015).
Tamizaje fitoquímico: Se pesaron 5 g del material vegetal seco para cuatro muestras por cada especie en estudio, empacadas con papel filtro y colocadas en vasos de precipitados de 150 ml. Se añadió 30 ml del disolvente (cloroformo, etanol al 96%, agua o HCl al 1%) a cada muestra, se taparon y calentaron en baño maría por 5 minutos (para HCl al 1%, fueron 10 minutos) (Rodríguez-Quezada et al., 2021).
A los extractos de cada planta se les agregó el reactivo indicado para determinar cualitativamente el metabolito secundario siguiendo la metodología propuesta por Más Toro et al., (2017). Se detectó la presencia de alcaloides, flavonoides, saponinas, taninos, terpenoides, glúcidos, fenoles totales y esteroles de acuerdo con los procedimientos propuestos por Pérez et al. (2021) y Rodríguez-Quezada et al. (2021).
Obtención de los extractos vegetales En el laboratorio de química de la Universidad Estatal Amazónica (UEA), se realizó la extracción con etanol al 98%, con la técnica de Soxhlet durante 48 h (Pimentel Ramírez et al., 2015). El extracto etanólico se filtró y concentró en el rotaevaporador a presión reducida y temperatura constante de 80°C. Una vez evaporado el solvente, se obtuvo el extracto crudo de cada planta para su posterior almacenamiento a 4 °C. Se determinó la masa de cada uno de los extractos de las plantas estudiadas.
Microorganismos de ensayo: Se seleccionaron cepas bacterianas de referencia: una Grampositiva de S. aureus (C44-02) y dos Gramnegativas E. coli (D31-12) y S. typhimurium (D31-15) del cepario de colección de la UEA.
Preparación de los inóculos bacterianos: Se partió de cepas en estudio frescas y purificadas en un medio de cultivo básico. Con un asa de siembra en aro se tomó una pequeña cantidad de colonias para luego ser suspendidas en una solución de cloruro de sodio al 0,85% estéril hasta alcanzar la turbidez equivalente al 0,5 McFarland (1.5 X108 UFC/mL). Se verificó la densidad correcta del estándar de turbidez midiendo la absorbancia con un espectrofotómetro Lengguang 759S en longitud de onda de 540 nm (Lage et al., 2005).
Ensayo antibacteriano de extractos de hojas de B. pilosa y E. foetidum en organismos de prueba bacterianos
La actividad antibacteriana de los extractos B. pilosa y E. foetidum se determinó de acuerdo con la metodología descrita por (Torres et al., 2017). Para evaluar la actividad antimicrobiana se utilizó el método modificado de difusión en pocillos en agar Müeller Hinton para bacterias, se colocaron en las cajas Petri, 10 ml de agar, y se dejó en reposo hasta que solidifique, se adicionó 100 uL de inóculo de densidad celular de 1x107UFC/mL y con la ayuda de un asa de Drigalsky se pasó de manera uniforme sobre la superficie del agar. En cada placa se realizaron los pocillos (5 mm de diámetro) con ayuda de un sacabocado estéril, donde se depositó el extracto con una concentración de 5 y 10 mg/pocillo a partir del extracto madre (100 mg/mL de alcohol al 98 %) todos los ensayos se realizaron por triplicado. Luego de una incubación a 37 ºC por 24 h se realizó la lectura de los halos de inhibición con la ayuda de un calibrador Vernier. Las soluciones experimentales que actuaron como control negativo fue etanol al 98 % y control positivo Gentamicina (30μg/mL) se aplicaron en cantidades de 10 ul en discos de papel filtro Whatman # 3 (6mm de diámetro) con ayuda de una micropipeta marca Merck. Los ensayos se realizaron por triplicado.
Evaluación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y mínima bactericida (CMB):
La CMI (concentración mínima inhibitoria) de los extractos se determinó por el método de dilución de agar (Pastrana et al., 2017). Se tomó 5 colonias de las cajas de lacas Petri que cada microorganismo en estudio, para posteriormente ser diluidas en 5 mL de caldo triptosa hasta alcanzar la turbidez equivalente a 0.5 de la Escala Mac Farland, la cual equivale a una concentración de 108 UFC/mL (Chukwujekwu E et al., 2017). De esta solución se tomó 100 µL y se inóculo en cada uno de los tubos menos en el tubo control, posteriormente se añadió cada extracto en una concentración de 250, 125, 62.5, 31.25 y 15.62 mg/mL. Los cultivos fueron incubados durante 24 h a 37 ºC, sobre un agitador rotatorio, posteriormente el crecimiento bacteriano se examinó espectrofotométricamente. El tubo que no presentó turbidez o sea que se produce un crecimiento no visible fue tomada como la CMI de la sustancia para el microorganismo utilizado. Cada experimento se realizó por duplicado.
Para la determinación de la CMB, se tomaron alícuotas de los tubos en los que no se observó crecimiento en el ensayo de CMI y se sembraron en placas con gelosa sangre para Gram positivas y agar MacConkey para Gram negativas, las que se incubaron a 37 °C durante 24 h; la placa de menor concentración de extracto en la que no se observó crecimiento correspondió a la CMB. Los experimentos se realizaron por triplicado y sólo se validaron los resultados que mostraron coincidencia.
Análisis Estadístico: Los datos obtenidos en el estudio fueron estadísticamente analizados mediante un análisis de varianza (ANOVA) y prueba de rango múltiple de Duncan (DMRT) para determinar la diferencia entre medios de tratamiento. P< 0.05 fue considerado como significativo.
Resultados
El análisis fitoquímico preliminar de B. pilosa y E. foetidum revelaron la presencia algunos metabolitos secundarios (Cuadro 1) alcaloides, glucósidos, saponinas, terpenoides, fenoles, esteroles, flavonoides y taninos.
Cuadro 1 Componentes fitoquímicos de los extractos de B. pilosa y E. foetidum
| Grupo de compuestos | Prueba | B. pilosa | E. foetidum |
|---|---|---|---|
| Alcaloides | Dragendorff/Mayer | + | - |
| Flavonoides | Cloruro férrico | + | + |
| Glúcidos | Keller-Killiani | + | + |
| Saponinas | Prueba de espuma | + | - |
| Taninos | Cloruro Férrico | + | + |
| Terpenoides | Liebermann-Buchard | + | + |
| Fenoles | Cloruro Férrico | + | + |
| Esteroides/esteroles | Salkowski | + | + |
+ = presencia; - = ausencia
Como resultado del proceso de extracción a partir de aproximadamente 450 g de vegetal de B. pilosa y E. foetidum, se obtuvieron 5.8 ± 0.2 y 0.91 ± 0.7 g del extracto de interés. En el Cuadro 2 se muestran los porcentajes de rendimiento de los extractos en estudio B. pilosa y E. foetidum. El mejor porcentaje de rendimiento fue obtenido con las hojas de B. pilosa de 1.3 % y para la E. foetidum de 0.21 % en noviembre.
Cuadro 2 Porcentaje de rendimiento del extracto etanólico de B. pilosa y E. foetidum.
| Mes de recolección | Porcentaje de rendimiento % | |
|---|---|---|
| B. pilosa | E. foetidum | |
| Mayo | 0.24 | 0.14 |
| Noviembre | 1.3 | 0.21 |
En el Cuadro 3 se observa la acción de los extractos bioactivos que inhibieron el crecimiento de las cepas de S. aureus, E. coli y S. typhimurium.
Cuadro 3 Halo de inhibición de los extractos etanólicos, de B. pilosa y E. foetidum frente a S. aureus,
| Bacterias | Halo de inhibición (mm) | |||
|---|---|---|---|---|
| B. pilosa | E. foetidum G Etanol | |||
| 5 mg/mL | 10 mg/mL | 5 mg/mL | 10 mg/mL 30μg/mL 98 % | |
| S. aureus | 8,8 ± 1,4 d | 11,3 ± 1,6 c | 15,0 ± 1,2 b | 21,0 ± 2,0 a 21 ± 1.5 a - |
| E. coli | 5,7 ± 0,7 c | 7,8 ± 0, 9 b | 10,0 ± 1,2 a | 11,7 ± 0,7 a 18 ± 0.8 a - |
| S. typh. | 7,0 ± 0,3 c | 8,3 ± 0,6 c | 11,7 ± 0,7 b | 12,3 ± 0,3 b 23 ± 1.6 a - |
a,b,c,d Medias con letras diferentes dentro de filas difieren significativamente
( desviación estándar
G: Gentamicina
La interacción entre las concentraciones de los extractos de B. pilosa y E. foetidum y el crecimiento de las cepas S. aureus, E. coli y S. typhimurium muestran un comportamiento definido a la razón de un incremento de la concentración y el halo de inhibición. Los datos obtenidos presentan un nivel de significancia menor de α 0.05. (P-valor). La concentración de 10 mg/mL del extracto de E. foetidum para las tres cepas en estudio fue la que presentó valores superiores frente al extracto de B. pilosa (S. aureus: 21,0 ± 2,0, E. coli: 11,7 ± 0,7 y S. typhimurium: 12,7 ± 0,3). La media del diámetro del halo de inhibición indicó que el halo del extracto etanólico de la E. foetidum se encontró por debajo del control gentamicina. No se observó la formación de halo alrededor del alcohol, lo que elimina que los halos formados puedan deberse al etanol empleado para la preparación de los extractos.
Las CMI de los extractos analizados de B. pilosa y E. foetidum aparecen en el Cuadro 4. Se observa que los extractos etanólicos de ambas plantas, a concentraciones altas, tienen una acción inhibitoria sobre las tres especies bacterianas utilizadas.
Cuadro 4 Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de los extractos de B. pilosa
| Bacterias | B. pilosa (mg/mL) | E. foetidum (mg/mL) |
|---|---|---|
| S. aureus | 62.5 | 15.6 |
| E. coli | 125.0 | 62.5 |
| S. typhimurium. | 125.0 | 62.5 |
El extracto etanólico de E. foetidum mostró actividad inhibitoria contra S. aureus, comprobado por la mínima concentración requerida para su inhibición. Por el contrario, al realizar el enfrentamiento de las cepas de E. coli y S. typhimurium se evidenció que requieren mayor concentración de extracto para su inhibición siendo mayor la concentración de B. pilosa. Se puede suponer que los extractos etanólicos de las plantas probadas, tienen baja actividad sobre bacterias gramnegativas, posiblemente, porque las bacterias presentan compuestos anfipáticos que operan como bombas de expulsión de diversas sustancias, por lo cual, el antibacteriano es expulsado de manera inmediata, sin alcanzar a cumplir el efecto (Argote et al., 2017). Por otro lado, de acuerdo con nuestros datos este primer estudio, E. auerus, E. coli y S. typhimurium mostraron tener mayor sensibilidad a causa de algún compuesto fitoquímico presente en los extractos en estudio, como se muestra en Cuadro 1 se puede establecer la presencia de Taninos, Esteroides, Fenoles y Flavonoides en el extracto etanólico de E. foetidum. En las pruebas fitoquímicas preliminares se analizó la presencia o ausencia de aquellos metabolitos secundarios que están ampliamente distribuidas en los extractos de B. pilosa y E. foetidum y que están relacionadas con alguna o varias actividades biológicas. Se puede deducir que estos metabolitos secundarios son sintetizados como respuesta a la influencia de diferentes factores relacionados con su hábitat, como son la temperatura, el pH, la salinidad, presencia de otros organismos (Sotero et al., 2017)
En el Cuadro 5, se muestra la CMB por las diferentes concentraciones del extracto etanólico de B. pilosa y E. foetidum, observándose que la concentración de 31.25 mg/mL del extracto de E. foetidum impide la formación de unidades formadoras de colonias de S. aureus . Mientras que el extracto de B. pilosa frente a S. typhimurium. La inhibición se logra con una concentración de 250 mg/mL. Se puede decir que a medida que aumenta la concentración del extracto disminuye el recuento de unidades formadoras de colonias.
Discusión
Los metabolitos secundarios identificados en los extractos de la B. pilosa se incluyen dentro del estudio realizado por Xuan & Khanh, (2016) quienes determinaron 301 compuestos pertenecientes a poliacetilenos, glucósidos de poliacetileno, flavonoides, glucósidos de flavona, auronas, chalconas, glucósidos de okanina, ácidos fenólicos, terpenos, feofitinas, ácidos grasos, taninos y fitoesteroles de los diferentes partes de esta planta, siendo considerados muchos de los metabolitos como los compuestos bioactivos que son potencialmente responsables por las acciones farmacológicas.
Respecto a la evaluación de metabolitos secundarios del extracto de E. foetidum, la identificación cualitativa permitió corroborar los estudios realizados Paul et al. (2011) quienes determinaron la presencia de flavonoides, taninos, saponina y varios triterpenoides; pero no se informaron la presencia de alcaloides. Los estudios farmacológicos de las partes aéreas de la planta han demostrado actividad antihelmíntica debido a la acción eryngial, antiinflamatoria gracias a las fracciones de fitoesteroles, actividad anticonvulsiva en los modelos respectivos y actividad antibacteriana selectiva contra las especies de Salmonella y el género de bacterias Erwinia (Paul et al., 2011).
Respecto a la actividad antibacteriana, los extractos de B. pilosa fueron efectivos para inhibir S. aureus tal como se observa en los diámetros de inhibición de 11,3 ± 1,6 mm en comparación con E. coli que mostraron halos de 7,8± 0,9 mm y para S. typhimurium 8,3 ± 0,6 mm. Los resultados obtenidos fueron superiores a los reportados por Cruz et al., (2010) quienes demostraron la acción bactericida del extracto de B. pilosa contra S. aureus con formación de halos de inhibición de 17,6 mm y negativo para E. coli. Otro estudio mostró halos de inhibición de 15.66 ± 0,25 mm para S. aureus y para E. coli halos de inhibición de 18,2 ± 0,25 mm (Singh et al., 2017). En el presente estudio se encontró que E. coli (bacteria Gram negativa) es más resistente al extracto etanólico de la B. pilosa que S. aureus (bacteria Gram positiva), esto se reafirma con los estudios de Panda et al. (2019) quienes demostraron que los patógenos Gram-positivos fueron claramente más susceptibles a la mayoría de los extractos en comparación con las especies Gramnegativas, esto debido a que los extractos presentan fitocompuestos como fenoles, flavonoides, taninos, saponinas, esteroides y terpenos. Estudios realizados por da Silva et al. (2014) quienes utilizaron las hojas de B. pilosa presentaron diámetros medios de los halos de inhibición significativamente mayores que la clorexidina 0,12% y el extracto fue más activos frente a S. aureus ATCC (p < 0,05).
El extracto de E. foetidum por su parte generó significativamente mayor halo de inhibición que la B. pilosa para las tres cepas siendo la cepa de S. aureus la de mayor halo de inhibición (21,0 ± 2.0 mm). Begum et al. (2018) determinaron halos de inhibición para S. aureus de 19,54 ± 1.5 valores muy cercanos a los encontrados en el presente estudio, sin embargo, para E. coli los valores determinados por los autores fueron superiores (28,77 ± 1.3). (Brito & Silva, 2022) estudiaron diferentes extractos de especies vegetales del Norte de Brasil y encontraron resistencia antimicrobiana para S. aureus (10 ± 1,4 mm) y negativo para E. coli con E. foetidum, Lingaraju et al. (2016) al examinar el efecto antibacteriano de la E. foetidum encontraron halos de inhibición de 15 para E. coli y 20 para E. aureus. Estudios farmacológicos realizados por Paul et al. (2011) de las partes aéreas de E. foetidum demostraron actividad antibacteriana selectiva contra las especies de Salmonella debido a las fracciones de fitoesteroles.
CMI y CMB de los microrganismos frente al extracto de B. pilosa y E. foetidum, la metodología fue dirigida inicialmente a la determinación de la actividad de los antibióticos, pero ha sido modificado para determinar la actividad antimicrobiana; adaptándose para determinar la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales y los extractos de plantas (Sun et al., 2021). La CMI se define como la menor concentración del extracto que produce el 90% de reducción en el crecimiento de las colonias. La CMB se define como la mínima concentración del extracto que produce al menos un 99,9% de reducción en el crecimiento de las colonias (Stan et al., 2021).
Respecto a la concentración mínima inhibitoria (CMI) los resultados obtenidos en la presente investigación mostraron inhibición para E. aureus de 15,62 mg/ml con extracto de E. foetidum y para gramnegativas se requiere de mayor concentración (62,5 mg/ml). En referencia al extracto de B. pilosa la inhibición se alcanzó con concentraciones de 62,5 mg/ml para E. aureus y 125 mg/ml para las gramnegativas. Lingaraju et al. (2016) reportaron CMI para las bacterias grampositivas y gramnegativas en estudio, concentraciones de 2,5 mg/ml en extracto de E. foetidum. Lawal et al. (2015) determinaron que los extractos metanólicos de la B. Pilosa inhiben las bacterias de E coli a concentraciones de 200 (µg/ml) y para E. aureus. Cruz et al. (2010) demostraron el efecto del extracto etanólico de la B. pilosa para E. aureus de 12 µg/ml. La diferencia de polaridad de los extractos parece ser un factor para considerar debido a que los compuestos altamente polares extraen la mayor cantidad de principios bioactivos; estudios realizados han demostrado que los compuestos polares tienen efectos antimicrobianos, aunque compuestos no polares como naftoquinonas también han demostrado este efecto (Lawal et al., 2015). Falowo et al. (2016) demostraron que el ensayo antibacteriano de los extractos de B. pilosa reveló una apreciable actividad de amplio espectro frente a las bacterias examinadas (E. coli) con concentraciones inhibitorias mínimas utilizando rangos entre 0,6 y 10,0 mg/mL. En la determinación de la CMB, el extracto etanólico de E. foetidum (10 mg/mL) presentó mayor actividad antimicrobiana frente aS. aureus con CMB 31.25 mg/mL, Para B. pilosa frente aS. aureus una CMB de 125 mg/mL E. coli y S. typhimurium fueron más resistentes con CMB 125 y 250 mg/mL respectivamente. En el presente estudio, se demostró que el etanol utilizado como solvente de los extractos en crudo no es el responsable de la actividad antimicrobiana, debido a que se encontró que la CMI y la CMB del etanol negativos. Con ello se aclara que el etanol es sólo utilizado como un solvente de esta resina y no como coadyuvante y, aunque está demostrado que los extractos etanólicos de las plantas en estudio son efectivas que las acuosas.
Conclusiones
Con los resultados obtenidos en el presente trabajo, se pudo encontrar que los extractos etanólicos obtenidos a partir de las plantas B. pilosa y E. foetidum presentaron actividad in vitro frente a S. aureus, E. coli y Salmonella typhimurium. Sobre S. aureus, el extracto de Eryngium foetidum fue el que tuvo mayor acción antibacteriana, clasificándose como sensibles. Las plantas estudiadas, en particular E. foetidum, por la actividad demostrada ante S. aureus, pueden constituir una alternativa contra bacterias Gram positivas.
