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Introducción
El nogal pecanero (Carya illinoinensis) forma parte de las juglandáceas, una familia constituida por 9 géneros (Alfaroa, Oreomunnea, Carya, Juglans, Anamocarya, Cylocarya, Engelhardia, Platycarya y Pterocarya), y alrededor de 60 especies (Xiang et al., 2011). Se trata de una especie de árbol valorado principalmente por la nuez que produce (Litz, 2005).
Tomando en cuenta los diferentes tipos de explantes que se pueden utilizar para clonar una planta, la yema es el explante que más reduce el riesgo de variación somaclonal (Abahmane, 2011). Además, la yema apical es el explante más responsivo (Salar et al., 2013). No obstante, el nogal pecanero es una planta recalcitrante al cultivo in vitro (Renukdas et al., 2010), entendiendo por recalcitrancia a la condición por la cual algunas especies vegetales difícilmente logran ser desinfectadas con éxito, conservando la capacidad de generar brotes viables (Benson, 2003).
El tejido vegetal que contiene altas concentraciones de compuestos fenólicos es particularmente recalcitrante al cultivo in vitro (Benson, 2000). Un ejemplo de este tipo de compuestos es la naftoquinona juglona, la cual se encuentra en el ruezno, raíces, hojas y corteza de las juglandáceas (Ahmad & Suzuki, 2019). En general, cuando los compuestos fenólicos se oxidan, se producen quinonas las cuales le dan una apariencia oscura al tejido vegetal. Estas quinonas pueden oscurecer el medio de cultivo, y son compuestos altamente reactivos y tóxicos para el tejido vegetal (Titov et al., 2006), por ello pueden retardar el desarrollo del explante o incluso provocar su muerte (Sparjanbabu et al., 2019).
El tejido vegetal puede sintetizar compuestos fenólicos por eventos estresantes como la disección (Das & Srivastav, 2015) o el ataque de un microorganismo patógeno (Shalaby & Horwitz, 2015). El carbón activado adsorbe los compuestos fenólicos segregados por el tejido vegetal, lo cual inactiva a las enzimas polifenol oxidasa y peroxidasa, logrando así la disminución del oscurecimiento del tejido y, con ello, el incremento de la supervivencia de los explantes y la morfogénesis (Pan & van Staden, 1998). Además, el carbón activado es capaz de adsorber bacterias y sus toxinas (Ovington, 2007).
De hecho, el carbón activado absorbe muchas sustancias diferentes, algunas de las cuales se producen durante el autoclavado del medio de cultivo. Un ejemplo de estas sustancias es el 5-hidroximetil-furfural, el cual inhibe el crecimiento vegetal (Thomas, 2008). Otras de las sustancias absorbidas por el carbón activado son liberadas por el tejido vegetal inoculado en el medio, y otras son ingredientes del medio de cultivo (Eymar et al., 2000). Pero el carbón activado tiende adsorber primero las sustancias moderadamente polares, y adsorbe mejor los compuestos aromáticos que los compuestos olefínicos insaturados. De modo que el carbón activado tiene afinidad por los compuestos fenólicos y sus formas oxidadas, así como por las auxinas y citoquininas (Pan & van Staden, 1998).
Por otra parte, el carbón activado altera el pH del medio, lo cual es sumamente importante ya que el pH del medio afecta el crecimiento del tejido vegetal y los procesos morfogénicos, debido a que altera la disponibilidad y el consumo de los nutrientes (Eymar et al., 2000).
Otra forma de controlar la oxidación del tejido es mediante la adición de nitrato de plata (AgNO3) al medio de cultivo (Huh et al., 2017; Modeste et al., 2017), ya que este compuesto inhibe la acción del etileno (Kumar et al., 2009). El nitrato de plata puede ser añadido al medio en concentraciones variadas que pudieran ir de 1 a 15 mg/L (Abdollahi & Rashidi, 2017; Dhiman et al., 2020; Gammoudi et al., 2019; Huh et al., 2017; Malik et al., 2021; Modeste et al., 2017; Warchoł et al., 2021). Pero este compuesto no sólo reduce la oxidación del tejido vegetal, sino que también puede inducir un incremento en la callogénesis (Gammoudi et al., 2019; Malik et al., 2021; Warchoł et al., 2021), la producción de embriones somáticos (Abdollahi & Rashidi, 2017; Huh et al., 2017; Malik et al., 2021; Warchoł et al., 2021) y la regeneración de plántulas (Abdollahi & Rashidi, 2017; Malik et al., 2021; Warchoł et al., 2021), y asimismo mejorar la supervivencia de los explantes (Huh et al., 2017). Adicionalmente, se ha demostrado que el nitrato de plata inhibe el crecimiento de hongos fitopatógenos (Dhiman et al., 2020; Krishnaraj et al., 2012).
Aunada a los problemas de oxidación del tejido, la contaminación microbiana ha representado un impedimento para la micropropagación del nogal pecanero. Se ha intentado regenerar esta planta a través del cultivo in vitro de yemas de árbol adulto, pero esto no ha sido posible debido a que no se ha logrado erradicar la contaminación de los explantes, o bien, porque la yema no ha sido capaz de continuar su desarrollo hasta la generación de la planta completa in vitro (Rodriguez & Wetzstein, 1994).
Los estudios realizados sobre árboles adultos y patrones de nogal pecanero, señalan cuáles son los microorganismos que más afectan a esta especie vegetal. Por ejemplo, se han analizado muestras de árboles de nogal pecanero de 20 años de edad, establecidos en Coahuila, México, y se ha identificado una desatacada incidencia de Fusarium oxysporum, Fusarium solani y Lasiodiplodia theobromae (Alvidrez Villarreal et al., 2012). También se ha reportado que la producción de patrones de nogal pecanero en Brasil se ve afectada por la incidencia de infecciones fúngicas, específicamente por hongos del género Fusarium, que ocasionan la pudrición de las raíces de las plántulas (Poletto et al., 2020).
Conviene señalar que se ha demostrado que Fusarium oxysporum puede ser inhibido de manera efectiva mediante el tratamiento con procloraz (Amini & Sidovich, 2010; Nel et al., 2007; Özer & Köycü, 1998) y carbendazim (Kamdi et al., 2012; Nikam et al., 2007; Poddar et al., 2004).
De hecho, procloraz, benomilo y carbendazim pertenecen a la clase de los benzimidazoles, cuyo mecanismo de acción consiste en inhibir la síntesis de ergosterol en la célula fúngica para interrumpir su metabolismo. Estos fungicidas pueden ser efectivos contra Fusarium, Botrytis, Sclerotmia, Septoria, Uncinula, Erysiphe, entre otros. Sin embargo, los benzimidazoles pueden tener un efecto fitotóxico que se percibe como una disminución de la biomasa de tejido vegetal, y una reducción en el contenido de clorofilas a y b, carotenoides y pigmentos totales (Baibakova et al., 2019).
Por otra parte, no es necesario investigar la manera de eliminar los hongos del nogal, si la materia prima tiene una baja carga microbiana. Por ello, en diversas investigaciones, se ha realizado el cultivo in vitro de embriones cigóticos de nogal pecanero (Kumar & Sharma, 2005; Obeidy & Smith, 1993), especialmente semillas inmaduras (Burns & Wetzstein, 1995, 1997; Mathews & Wetzstein, 1993; McGranahan et al., 1993; Payghamzadeha & Kazemitabarb, 2010; Rodriguez & Wetzstein, 1994, 1998; Vendrame et al., 1999; Wetzsein et al., 1989; Wetzstein et al., 1990). Además, los embriones cigóticos, al estar compuestos por tejidos jóvenes, tienen un mayor potencial para la embriogénesis y la organogénesis, que los tejidos maduros y diferenciados (Elhiti & Stasolla, 2011).
No obstante, se debe tener en cuenta que cada semilla tiene una carga genética única (Coyle, 2004). En el caso de Carya illinoinensis, se trata de una especie que se reproduce por polinización cruzada (Thompson & Conner, 2011), y se sabe que las semillas presentan aún mayor diversidad genética cuando la planta se propaga de este modo (Pooja, 2004). Por lo tanto, al realizar el cultivo in vitro de una semilla, se obtienen clones de una planta con características fenotípicas impredecibles.
Lo anterior denota el interés por trabajar con tejido adulto de nogal para su micropropagación. Y, una vez que se haya superado el establecimiento aséptico, se deben contemplar otros parámetros que pueden optimizar el cultivo, como la fuente de carbono y la concentración de sales minerales en el medio de cultivo. En cultivo de tejidos vegetales, se puede probar la suplementación del medio con diversos hidratos de carbono, sin embargo, la sacarosa es el estándar. Pero también es común adicionar el medio con los monosacáridos glucosa, fructosa, galactosa, manosa, arabinosa, ribosa y xilosa; los disacáridos maltosa, lactosa, celobiosa y trehalosa; y el trisacárido rafinosa. Por si fuera poco, se han obtenido resultados positivos cultivando tejidos en medio suplementado con polioles, también llamados azúcares de alcohol; ejemplos de estas fuentes de carbono son el sorbitol, el glicerol y el manitol (Yaseen et al., 2013).
El explante de hoja de árbol adulto constituye un punto de partida inexplorado para la regeneración de C. illinoinensis. Por ello, el objetivo de este estudio fue determinar un método de desinfección y las condiciones de cultivo in vitro que inducen una mayor producción de callo en explantes de hoja de árbol adulto de nogal pecanero.
Materiales y métodos
Material biológico
Se recolectaron hojas completas de árboles de nogal pecanero de 16 años de edad, de la cv. ʻWichitaʼ, provenientes de un huerto de 50 ha, ubicado en el bloque 1010 del Valle del Yaqui (Cd. Obregón, Sonora, México), con coordenadas 27°20'23.26"N y 109° 55'42.83"O. Las recolecciones se realizaron durante la mañana, en abril, mayo, junio y agosto de 2021. Inmediatamente después del corte de cada hoja, se aplicó solución de 25 g/L de sulfato cúprico en la zona de corte del pecíolo, y se pulverizó la superficie de la hoja con solución antioxidante de ácido ascórbico (0.125 g/L) y ácido cítrico (0.075 g/L).
Selección de foliolos
Durante la selección de los foliolos, se descartaron aquellos que presentaban lesiones causadas por la incidencia de luz solar o mordeduras de insectos, así como los foliolos contaminados por excremento de aves. Y únicamente se trabajó con foliolos apicales.
Desinfección del tejido vegetal
Se hicieron tres réplicas de desinfección para cada tratamiento. Para cada réplica, se pesaron aproximadamente 3 g de foliolos enteros, después éstos fueron desinfectados mediante inmersión consecutiva en una serie de soluciones desinfectantes y agua, en agitación constante a 100 rpm. Se utilizaron 200 mL de cada solución desinfectante por cada 3 g de tejido tratado; en el caso de que el tejido pesara más o menos de tres gramos, se hizo el cálculo del volumen requerido. El orden de las soluciones y los tiempos de inmersión considerados en los tratamientos de desinfección aparecen en la Tabla 1. Al final de la desinfección, los foliolos fueron sumergidos en solución 0.25 g/L de ácido ascórbico y 0.15 g/L de ácido cítrico durante 12 h.
Tabla 1 Tratamientos de desinfección de explantes de hoja de nogal pecanero.
| Tratamiento | Tiempo de inmersión | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Etanol al 70% | Solución al 1.8-2.7% de hipoclorito de sodio, con 2 gotas por litro de Tween 80 | Agua | Solución al 0.2% de Procloraz, con 2 gotas por litro de Tween 80 | Solución de 8.8 g/l de Carbendazim, con 2 gotas por litro de Tween 80 | Solución de 1 g/l de Carbendazim, con 2 gotas por litro de Tween 80 | Agua | |
| HD1 | 50 s | 50 s | (1 min) x 4 | - | - | - | |
| HD2 | 2 min | 2 min | (1 min) x 4 | - | - | - | |
| Velbistin | 2 min | 2 min | (1 min) x 4 | - | - | 20 min | (1 min) x 4 |
| Ultralite | 2 min | 2 min | (1 min) x 4 | - | 20 min | - | - |
| HD4 | 2 min | 2 min | (1 min) x 4 | 20 min | - | - | (1 min) x 4 |
El orden de la secuencia de inmersiones va de izquierda a derecha
Descripción del explante y medio de cultivo
Los foliolos desinfectados fueron disectados en campana de flujo laminar. A partir de cada réplica de ≈3 g de hoja, se obtuvieron 15 explantes (n=15) cortados bajo un molde de aluminio estéril de 1 cm2, los cuales fueron sembrados individualmente, en frascos con 10 ml de medio de cultivo con las composiciones descritas en la Tabla 2.
Tabla 2 Composición de medios de cultivo probados para la inducción de la callogénesis en explantes
| Tratamiento | Fuente de carbono (30 g/L) | Antioxidante | Concentración de sales de Murashige y Skoog M6899 Sigma (g/L) |
|---|---|---|---|
| Estándar | Sacarosa | - | 1.46 |
| AgNO3 | Sacarosa | AgNO3 (5 mg/L) | 1.46 |
| CA | Sacarosa | Carbón activado (1 g/L) | 1.46 |
| MS+ | Sacarosa | - | 4.4 |
| Glucosa | Glucosa | - | 1.46 |
| Maltosa | Maltosa | - | 1.46 |
En todos los tratamientos se incluyó 1 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, y 7.5 g/L de agar bacteriológico. Antes de autoclavar el medio, el pH fue ajustado a 5.7 con HCl 1 N ó NaOH 1 N, según el requerimiento.
Desarrollo del cultivo
Los explantes cultivados fueron incubados por 50 días, a 25°C, expuestos a dos tratamientos luminosos: (1) oscuridad continua y (2) fotoperiodo de 16 horas de luz blanca y 8 h de oscuridad. Además, se probaron dos posiciones de inóculo: (1) cara adaxial (haz) en contacto con el medio de cultivo y (2) cara abaxial (envés) en contacto con el medio de cultivo.
Durante la incubación se realizaron examinaciones visuales periódicas, cada 10 días a partir de la siembra, para contabilizar los explantes contaminados y los explantes con callo, y para evaluar el nivel de oscurecimiento de cada explante.
Cálculo del índice de oscurecimiento
La incidencia de oxidación en los explantes de hoja se evaluó asignando un nivel de oscurecimiento a cada explante, considerando su apariencia (Tabla 3). Después de evaluar el nivel de oscurecimiento de cada explante, se calculó el índice de oscurecimiento, utilizando la Ecuación 1.
Tabla 3 Descripción de los niveles de oscurecimiento en explantes de hoja.
| Nivel de oxidación |
Características del explante |
|---|---|
| 0 | Coloración verde saludable en toda la superficie del explante |
| 1 | Coloración verde saludable en toda la superficie del explante, excepto por la presencia de una pequeña mancha de tejido oxidado |
| 2 | Explante con coloración verde-marrón en toda su superficie |
| 3 | Explante verde de tonalidad oscura. También reciben esta puntuación los explantes con presencia de grandes manchas de color marrón |
Peso del callo
Al finalizar el periodo de incubación, se seleccionaron al azar 5 explantes con callo, de 3 réplicas, de cada tratamiento (en total 3x5=15 explantes por tratamiento). Luego, los callos fueron raspados y colocados en cajas de Petri en peso constante. Se anotó el peso fresco de cada callo, y a continuación los callos fueron secados a 60 °C durante 24 h (Golkar et al., 2019). Enseguida, el material se dejó enfriar en un desecador, para posteriormente ser pesado. Después, se calculó el peso seco del callo y su porcentaje de humedad.
Adicionalmente, se seleccionaron 7 explantes con callo blanco, 7 explantes con callo marrón y 7 explantes con callo amarillo, para hacer la determinación del peso fresco y seco de cada tipo de callo, y calcular su porcentaje de humedad.
Análisis estadístico
El análisis de varianza de los datos se realizó en el paquete estadístico IBM® SPSS® Statistics, versión 22 (Chicago, IL, EUA). Las medias de índice de oscurecimiento, porcentaje de explantes contaminados, porcentaje de explantes con callos, peso fresco, peso seco y porcentaje de humedad de los callos, fueron comparadas mediante las pruebas de rango múltiple de Duncan y Tukey, según lo especificado en cada Tabla de resultados.
Resultados
En la Tabla 4 se muestra la evolución del índice de oxidación calculado para los explantes sometidos a los diferentes tratamientos probados. Al pasar 10 días de incubación, se observaron índices de oxidación nulos e incluso índices de oxidación de hasta 2.79; aunque fue más común encontrar índices de oxidación por encima de 2.5 a los 50 días de incubación.
Tabla 4 Índice de oscurecimiento en explantes de hoja al transcurrir el tiempo de incubación.
| Desinfección | Medio de cultivo | Orientación | Luz/ Oscuridad | Fechas de siembra | Índice de oscurecimiento | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 10 días | 20 días | 30 días | 40 días | 50 días | |||||
| HD1 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 21/04/2021 | 1.64 ± 0.40a, b, c |
1.99 ± 0.46a, b, c, d |
2.49 ± 0.38e, f, g |
2.82 ± 0.10e, f |
2.84 ± 0.14f |
| HD1 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 26/06/2021 | 0.07 ± 0.12a |
0.24 ± 0.10a |
1.09 ± 0.47a, b, c, d, e |
2.23 ± 0.45d, e, f |
2.52 ± 0.24d, e, f |
| HD2 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 22/04/2021 | 0.93 ± 0.96a, b |
2.28 ± 0.24b, c, d |
2.29 ± 0.32d, e, f, g |
2.62 ± 0.04d, e, f |
2.67 ± 0.12e, f |
| Velbistin | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 26/04/2021 | 1.61 ± 0.47a, b, c |
2.60 ± 0.24d |
2.80 ± 0.20g |
2.87 ± 0.12e, f |
2.87 ± 0.12f |
| Ultralite | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 27/05/2021 30/05/2021 03/06/2021 |
0.04 ± 0.08a |
0.66 ± 0.75a, b, c |
0.99 ± 0.71a, b, c, d |
1.80 ± 0.53b, c, d, e |
2.27 ± 0.42d, e, f |
| Procloraz | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 26/04/2021 | 0.98 ± 0.54a, b, c |
1.09 ± 1.25a, b, c, d |
2.87 ± 0.13g |
2.98 ± 0.04f |
3.00 ± 0.00f |
| Ultralite | CA | Adaxial | Oscuridad | 16/06/2021 | 2.30 ± 0.67b, c |
1.44 ± 0.76a, b, c, d |
0.76 ± 0.37a, b, c |
0.58 ± 0.43ª |
0.60 ± 0.13a, b |
| Ultralite | AgNO3 | Adaxial | Oscuridad | 01/06/2021 30/05/2021 |
0.68 ± 0.18a, b |
0.91 ± 0.54a, b, c, d |
1.31 ± 0.77a, b, c, d, e, f |
2.02 ± 0.20c, d, e, f |
2.38 ± 0.21d, e, f |
| Velbistin | Glucosa | Adaxial | Oscuridad | 07/05/2021 18/05/2021 |
0.00 ± 0.00a |
0.77 ± 0.42ª, b, c, d |
0.77 ± 0.40a, b, c |
1.13 ± 0.53a, b, c |
1.16 ± 0.52a, b, c |
| Ultralite | Glucosa | Adaxial | Oscuridad | 09/06/2021 27/05/2021 |
0.75 ± 0.23a, b |
0.66 ± 0.18ª, b, c |
0.67 ± 0.12a, b |
0.89 ± 0.14a, b |
1.78 ± 0.34c, d, e |
| Velbistin | Maltosa | Adaxial | Oscuridad | 07/05/2021 18/05/2021 |
0.42 ± 0.33a |
1.58 ± 0.50ª, b, c, d |
1.78 ± 0.77a, b, c, d, e, f, g |
2.36 ± 0.49d, e, f |
2.40 ± 0.55d, e, f |
| Ultralite | Maltosa | Adaxial | Oscuridad | 27/05/2021 03/06/2021 |
1.07 ± 0.78a,b,c |
1.29 ± 0.56a, b, c, d |
1.93 ± 0.07b, c, d, e, f, g |
2.38 ± 0.37d, e, f |
2.58 ± 0.33e, f |
| Velbistin | MS+ | Adaxial | Oscuridad | 18/05/2021 27/05/2021 |
0.52 ± 0.36a,b |
2.25 ± 0.50b, c, d |
2.73 ± 0.11f, g |
2.67 ± 0.12d, e, f |
2.67 ± 0.12e, f |
| Ultralite | Estándar | Adaxial | Luz | 27/05/2021 | 0.67 ± 1.04a,b |
1.24 ± 0.95a, b, c, d |
2.13 ± 0.60c, d, e, f, g |
2.44 ± 0.28d, e, f |
2.84 ± 0.14f |
| Velbistin | Estándar | Abaxial | Oscuridad | 04/05/2021 | 0.36 ± 0.50a |
0.44 ± 0.48 a, b |
0.47 ± 0.46a |
0.47 ± 0.46a |
0.50 ± 0.50a |
| HD1 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 20/08/2021 | 1.51 ± 1.34a, b, c |
1.06 ± 0.83 a, b, c, d |
1.63 ± 0.72a, b, c, d, e, f, g |
1.68 ± 0.42b,c,d |
1.58 ± 0.40b, c, d |
| HD3 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 21/08/2021 | 2.79 ± 0.17c |
2.47 ± 0.42 c, d |
2.51 ± 0.54e, f, g |
2.40 ± 0.53d, e, f |
2.33 ± 0.46d, e, f |
Los datos son la media del índice de oscurecimiento, observado en 3 réplicas de desinfección-siembra. Los tratamientos fueron una combinación de fungicida utilizado durante la desinfección de foliolos, y fotoperiodo empleado durante la incubación de los explantes. Los distintos superíndices indican diferencias significativas entre medias de la misma columna, según la prueba de Duncan (ANOVA de una vía, P<0.05). ± señala la desviación estándar de n=15 (15 explantes por cada una de las 3 réplicas).
La Tabla 5 señala la proporción de explantes contaminados por microorganismos, en cada tratamiento. El número total de explantes contaminados es predominantemente el resultado de la interacción del tratamiento de desinfección probado y la fecha de siembra del explante.
Tabla 5 Porcentaje de explantes de hoja visiblemente contaminados por microorganismos, al transcurrir el tiempo de incubación.
| Desinfección | Medio de cultivo | Orientación | Luz/Oscuridad | Fechas de siembra | Porcentaje de explantes visiblemente contaminados | Porcentaje total de explantes contaminados | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 10 días | 20 días | 30 días | 40 días | 50 días | ||||||
| HD1 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 21/04/2021 | 0.00 ± 0.00a |
4.44 ± 3.85 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00a |
4.44 ± 3.85 0.00a |
| HD1 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 26/06/2021 | 4.44 ± 3.85a, b |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00 |
2.22 ± 3.85 |
2.22 ± 3.85a, b |
8.89 ± 3.85ª |
| HD2 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 22/04/2021 | 8.89 ± 3.85a, b |
11.11 ± 3.85 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00a |
20.00 ± 6.67a, b |
| Velbistin | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 26/04/2021 | 4.44 ± 3.85a, b |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00a |
4.44 ± 3.85a |
| Ultralite | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 27/05/2021 30/05/2021 03/06/2021 |
0.00 ± 0.00a |
2.22 ± 3.85 |
4.44 ± 7.70 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00a |
6.67 ± 6.67a |
| Procloraz | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 26/04/2021 | 0.00 ± 0.00a |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00a |
0.00 ± 0.00a |
| Ultralite | CA | Adaxial | Oscuridad | 16/06/2021 | 4.44 ± 3.85a, b |
13.33 ± 13.33 |
2.22 ± 3.85 |
4.44 ± 7.70 |
0.00 ± 0.00a |
24.44 ± 10.18a, b |
| Ultralite | AgNO3 | Adaxial | Oscuridad | 01/06/2021 30/05/2021 |
2.22 ± 3.85a |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00a |
2.22 ± 3.85a |
| Velbistin | Glucosa | Adaxial | Oscuridad | 07/05/2021 18/05/2021 |
6.67 ± 6.67a, b |
4.44 ± 7.70 |
2.22 ± 3.85 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00a |
13.33 ± 11.55a |
| Ultralite | Glucosa | Adaxial | Oscuridad | 09/06/2021 27/05/2021 |
22.22 ± 10.18b, c |
2.22 ± 3.85 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00a |
24.44 ± 10.18a, b |
| Velbistin | Maltosa | Adaxial | Oscuridad | 07/05/2021 18/05/2021 |
0.00 ± 0.00a |
2.22 ± 3.85 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00a |
2.22 ± 3.85a |
| Ultralite | Maltosa | Adaxial | Oscuridad | 27/05/2021 03/06/2021 |
8.89 ± 10.18a, b |
2.22 ± 3.85 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00a |
11.11 ± 13.88a |
| Velbistin | MS+ | Adaxial | Oscuridad | 18/05/2021 27/05/2021 |
4.44 ± 3.85a, b |
4.44 ± 7.70 | 2.22 ± 3.85 | 0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00a |
11.11 ± 3.85a |
| Ultralite | Estándar | Adaxial | Luz | 27/05/2021 | 2.22 ± 3.85a |
0.00 ± 0.00 | 2.22 ± 3.85 | 0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00a |
4.44 ± 3.85a |
| Velbistin | Estándar | Abaxial | Oscuridad | 04/05/2021 | 0.00 ± 0.00a |
2.22 ± 3.85 | 2.22 ± 3.85 | 4.44 ± 3.85 |
4.44 ± 3.85b | 13.33 ± 13.33a |
| HD1 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 20/08/2021 | 31.11 ± 10.18c |
6.67 ± 6.67 | 4.44 ± 7.70 | 4.44 ± 7.70 |
0.00 ± 0.00a | 46.67 ± 13.33b |
| HD3 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 21/08/2021 | 17.78 ± 13.88a, b, c |
0.00 ± 0.00 | 4.44 ± 3.85 | 0.00 ± 0.00 |
0.00 ± 0.00a | 22.22 ± 15.40a, b |
Los datos son la media del número de explantes contaminados, observado en 3 réplicas de desinfección-siembra. Los tratamientos fueron una combinación de fungicida utilizado durante la desinfección de foliolos, y fotoperiodo empleado durante la incubación de los explantes. ± señala la desviación estándar de n=15 (15 explantes por cada una de las 3 réplicas). Los distintos superíndices indican diferencias significativas entre medias de la misma columna, según la prueba de Duncan (ANOVA de una vía, P<0.05).
Los resultados de callogénesis se presentan en la Tabla 6. Se observa que únicamente los explantes inoculados en medio adicionado con nitrato de plata empezaron a producir callo habiendo transcurrido tan sólo 10 días de incubación. En la mayoría de los tratamientos, la respuesta callogénica empezó a manifestarse a los 20 días de incubación.
Tabla 6 Porcentaje de explantes de hoja con callo, al transcurrir el tiempo de incubación.
| Desinfección | Medio de cultivo | Orientación | Luz/Oscuridad | Fechas de siembra | Porcentaje de explantes con callo | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 10 días | 20 días | 30 días | 40 días | 50 días | |||||
| HD1 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 21/04/2021 | 0.00 ± 0.00b |
73.33 ± 6.67ª, b, c |
100.00 ± 0.00a | 100.00 ± 0.00a |
100.00 ± 0.00a |
| HD1 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 26/06/2021 | 0.00 ± 0.00b |
62.22 ± 42.86ª, b, c, d |
91.11 ± 3.85ª, b | 95.56 ± 3.85a, b |
91.11 ± 3.85a, b |
| HD2 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 22/04/2021 | 0.00 ± 0.00b |
68.89 ± 13.88ª, b, c |
84.44 ± 10.18ª, b, c | 88.89 ± 3.85a, b |
88.89 ± 3.85a, b |
| HD3 (Velbistin) | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 26/04/2021 | 0.00 ± 0.00b |
95.56 ± 3.85ª |
95.56 ± 3.85ª | 95.56 ± 3.85a, b |
95.56 ± 3.85a, |
| HD3 (Ultralite) | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 27/05/2021 30/05/2021 03/06/2021 |
0.00 ± 0.00b |
60.00 ± 52.92a, b, c, d |
97.78 ± 3.85a |
93.33 ± 6.67a, b |
91.11 ± 3.85a, b |
| HD4 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 26/04/2021 | 0.00 ± 0.00b |
86.67 ± 6.67ª, b |
100.00 ± 0.00a |
100.00 ± 0.00a |
100.00 ± 0.00a |
| Ultralite | CA | Adaxial | Oscuridad | 16/06/2021 | 0.00 ± 0.00b |
0.00 ± 0.00d |
0.00 ± 0.00e |
0.00 ± 0.00f |
0.00 ± 0.00e |
| Ultralite | AgNO3 | Adaxial | Oscuridad | 01/06/2021 30/05/2021 |
37.78 ± 37.91a |
73.33 ± 23.09ª, b, c |
82.22 ± 7.70ª, b, c, d |
86.67 ± 11.55a,b |
86.67 ± 11.55a, b |
| Velbistin | Glucosa | Adaxial | Oscuridad | 07/05/2021 18/05/2021 |
0.00 ± 0.00b |
84.44 ± 3.85ª, b |
80.00 ± 6.67a, b, c, d |
84.44 ± 7.70a, b |
84.44 ± 7.70a, b |
| Ultralite | Glucosa | Adaxial | Oscuridad | 09/06/2021 27/05/2021 |
0.00 ± 0.00b |
13.33 ± 11.55c, d |
44.44 ± 10.18c, d, e |
53.33 ± 6.67c, d, e |
55.56 ± 7.70c, d |
| Velbistin | Maltosa | Adaxial | Oscuridad | 07/05/2021 18/05/2021 |
0.00 ± 0.00b |
0.00 ± 0.00d |
55.56 ± 48.23ª, b, c, d |
80.00 ± 17.64a, b, c |
86.67 ± 6.67ªa, b |
| Ultralite | Maltosa | Adaxial | Oscuridad | 27/05/2021 03/06/2021 |
0.00 ± 0.00b |
44.44 ± 26.94ª, b, c, d |
77.78 ± 20.37ª, b, c, d |
86.67 ± 17.64a, b |
88.89 ± 13.88a, b |
| Velbistin | MS+ | Adaxial | Oscuridad | 18/05/2021 27/05/2021 |
2.22 ± 3.85b |
71.11 ± 27.76ª, b, c |
86.67 ± 6.67ª, b, c |
88.89 ± 3.85ª, b |
88.89 ± 3.85a, b |
| Ultralite | Estándar | Adaxial | Luz | 27/05/2021 | 0.00 ± 0.00b |
0.00 ± 0.00d |
0.00 ± 0.00e |
0.00 ± 0.00f |
0.00 ± 0.00e |
| Velbistin | Estándar | Abaxial | Oscuridad | 04/05/2021 | 0.00 ± 0.00b |
40.00 ± 6.67ª, b, c, d | 66.67 ± 13.33ª, b, c, d | 68.89 ± 16.78b, c, d |
68.89 ± 16.78b, c |
| HD1 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 20/08/2021 | 0.00 ± 0.00b |
28.89 ± 16.78b, c, d | 46.67 ± 13.33b, c, d | 44.44 ± 10.18d, e |
40.00 ± 6.67d |
| HD3 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 21/08/2021 | 0.00 ± 0.00b |
13.33 ± 13.33c, d | 37.78 ± 16.78d, e | 40.00 ± 13.33e |
40.00 ± 13.33d |
Los datos son la media del número de explantes con callo, observado en 3 réplicas de desinfección-siembra. Los tratamientos fueron una combinación de fungicida utilizado durante la desinfección de foliolos, y fotoperiodo empleado durante la incubación de los explantes. ± señala la desviación estándar de n=15 (15 explantes por cada una de las 3 réplicas). Los distintos superíndices indican diferencias significativas entre medias de la misma columna, según la prueba de Duncan (ANOVA de una vía, P<0.05).
Los callos generados en todos los tratamientos fueron clasificados de acuerdo a su color, y se procedió a realizar el análisis destructivo de su peso fresco y seco. El promedio de los pesos de los callos y sus porcentajes de humedad se encuentran en la Tabla 7.
Tabla 7 Peso fresco y seco, y porcentaje de humedad de callos, según su color.
| Color del callo | Peso fresco | Peso seco | % de humedad del callo fresco |
|---|---|---|---|
| Blanco | 0.0106 ± 0.002c | 0.0019 ± 0.0015c | 79.58 ± 8.30b |
| CV | 0.87 | 0.81 | 0.10 |
| Marrón | 0.1128 ± 0.0127a | 0.0118 ± 0.0012a | 89.52 ± 0.87a |
| CV | 0.11 | 0.10 | 0.01 |
| Amarillo | 0.0352 ± 0.0219b | 0.0049 ± 0.0026b | 83.66 ± 5.33a,b |
| CV | 0.62 | 0.52 | 0.06 |
Los datos son los promedios del peso fresco y seco, así como del porcentaje de humedad de los callos, observados en siete explantes con callo de la misma coloración (n=7). ± señala la desviación estándar. Los distintos superíndices indican diferencias significativas entre medias de la misma columna, según las pruebas de Duncan y Tukey (ANOVA de una vía, P<0.05).
Finalmente, para cuantificar la producción de callo, se evaluó el peso fresco y seco, así como el porcentaje de humedad de los callos, según el tratamiento recibido por el explante. Los resultados de estas evaluaciones se muestran en la Tabla 8. Se observa que los explantes responsivos, presentaron callos con un peso fresco promedio dentro del rango de 6 a 81 mg, con un peso seco de 1 a 7.3 mg, y un porcentaje de humedad de 67.68 a 90.30 %.
Tabla 8 Peso fresco y seco del callo, y porcentaje de humedad del callo fresco, correspondiente a los tratamientos de desinfección, adición de antioxidantes en el medio de cultivo, modificación de fuente de carbono y concentración de sales MS, incubación con fotoperiodo, así como cultivo con cara abaxial en contacto con el medio de cultivo.
| Desinfección | Medio de cultivo | Orientación | Luz/Oscuridad | Desinfección | Peso fresco del callo | Peso seco del callo | % de humedad del callo fresco |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| HD1 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 21/04/2021 | 0.0514 ± 0.0276ª, b, c |
0.0063 ± 0.0005a, b |
84.9000 ± 7.4958ª, b |
| HD1 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 26/06/2021 | 0.0232 ± 0.0073c, d, e |
0.0036 ± 0.0006b, c, d |
83.4100 ± 2.6000ª, b, c |
| HD2 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 22/04/2021 | 0.0810 ± 0.0121a |
0.0073 ± 0.0007a |
90.3000 ± 1.5279a |
| Velbistin | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 26/04/2021 | 0.0746 ± 0.0466a, b |
0.0067 ± 0.0027a |
88.5366 ± 5.5176a |
| Ultralite | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 27/05/2021, 30/05/2021, 03/06/2021 |
0.0186 ± 0.0068c, d, e |
0.0031 ± 0.0009c, d |
81.9466 ± 3.0978ª, b, c, d |
| HD4 | Estándar | Adaxial | Oscuridad | 26/04/2021 | 0.0317 ± 0.0172c, d, e |
0.0069 ± 0.0035a |
75.9066 ± 3.0978a, b, c, d, e |
| Ultralite | CA | Adaxial | Oscuridad | 16/06/2021 | 0.0000 ± 0.0000e |
0.0000 ± 0.0000e |
0.0000 ± 0.0000f |
| Ultralite | AgNO3 | Adaxial | Oscuridad | 01/06/2021, 30/05/2021 |
0.0102 ± 0.0018e |
0.0025 ± 0.0004c, d, e |
73.7066 ± 4.1282d, e |
| Velbistin | Glucosa | Adaxial | Oscuridad | 18/05/2021, 07/06/2021 |
0.0102 ± 0.0015e |
0.0018 ± 0.0005d, e |
81.1566 ± 5.4095ª, b, c, d |
| Ultralite | Glucosa | Adaxial | Oscuridad | 27/05/2021, 09/06/2021 |
0.0041 ± 0.0011e |
0.0010 ± 0.0002d, e |
74.2900 ± 8.7200c, d, e |
| Velbistin | Maltosa | Adaxial | Oscuridad | 07/05/2021, 18/05/2021 |
0.0108 ± 0.0048e |
0.0019 ± 0.0007d, e |
77.3100 ± 6.9247b, c, d |
| Velbistin | MS+ | Adaxial | Oscuridad | 18/05/2021 | 0.0125 ± 0.0011d, e |
0.0016 ± 0.0005d, e |
86.9266 ± 3.0842ª |
| Velbistin | MS+ | Adaxial | Oscuridad | 21/05/2021 | 0.0459 ± 0.0373b, c, d |
0.0052 ± 0.0035ª, b, c |
87.2466 ± 2.2990ª |
| Fotoperiodo | Estándar | Adaxial | Luz | 27/05/2021 | 0.0000 ± 0.0000e |
0.0000 ± 0.0000e |
0.0000 ± 0.0000f |
| Velbistin | Estándar | Abaxial | Oscuridad | 04/05/2021 | 0.0063 ± 0.0022e |
0.0017 ± 0.0004d, e |
67.6853 ± 8.3582e |
Los datos son los promedios del peso fresco y seco, así como del porcentaje de humedad de los callos frescos, observados en 3 réplicas de 5 callos cada una. ± señala la desviación estándar de n=5. Los distintos superíndices indican diferencias significativas entre medias de la misma columna, según la prueba de Duncan (ANOVA de una vía, P<0.05)
Discusión
Desinfección de explantes
El menor porcentaje de explantes contaminados se observó en el tratamiento de desinfección que incluyó inmersión en procloraz. En otra investigación también se comprobó que procloraz puede ser más efectivo que carbendazim en la eliminación de hongos. En dicho estudio, se probó el efecto inhibidor de la combinación de tres pares diferentes de fungicidas, y 7 fungicidas individuales, en tres concentraciones distintas (1 ppm, 10 ppm, 100 ppm) sobre Fusarium acutatum y Fusarium oxysporum. Se observó que tanto carbendazim como procloraz inhibieron significativamente el crecimiento de la colonia de Fusarium acutatum, sin embargo, procloraz tuvo un efecto inhibidor significativamente superior al de carbendazim, y al de la mayoría de los tratamientos probados. Además, en las pruebas contra Fusarium oxysporum, procloraz fue el único fungicida que logró inhibir por completo el crecimiento de la colonia del hongo (Degani & Kalman, 2021).
Por si fuera poco, en la presente investigación, no hubo diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de explantes con callo según el método de desinfección, pero procloraz fue el único fungicida que permitió la callogénesis en el 100% de los explantes tratados.
Por otra parte, los foliolos desinfectados en abril, sin la aplicación de fungicidas, dieron mejores resultados de callogénesis y de contaminación microbiana, que los foliolos desinfectados en mayo, junio y agosto, con o sin aplicación de fungicidas. Teniendo en consideración que C. illinoinensis es un árbol caducifolio (Benucci et al., 2012), y que sus hojas comienzan a formarse a mediados de marzo, es posible que el tratamiento de desinfección planteado haya sido altamente efectivo en abril debido a que las hojas tratadas eran jóvenes, y habían estado menos expuestas a precipitaciones y otras fuentes de contaminación. Se sabe que el agua de lluvia puede recolectarse en la superficie de las plantas y propiciar un ambiente ideal para el desarrollo de microorganismos (Babaei et al., 2013).
Por otra parte, la humedad atmosférica generalmente es el factor ambiental más determinante para la severidad de la contaminación fúngica en las plantas. Los hongos que son transmitidos a través del aire, infectan las plantas con mayor facilidad cuando la temperatura ambiental es de 15-40 °C. Asimismo, el crecimiento de hongos se ve favorecido por la humedad elevada y temperaturas moderadas, por otra parte, la baja humedad, así como las temperaturas extremas, inhiben el crecimiento del hongo y la germinación de esporas (Talley et al., 2002).
En la presente investigación, los foliolos desinfectados en agosto, fueron los más afectados por la presencia de contaminación fúngica. Esta situación puede deberse a que agosto es el mes más cálido y húmedo del verano. Por ejemplo, en la primavera y verano de 2015, en el Valle del Yaqui, se registraron los siguientes promedios de temperatura diurna y temperatura nocturna: 29 °C y 17 °C en abril, 33 °C y 19 °C en mayo, 35 °C y 27 °C en junio, y 35 °C y 29 °C en julio y agosto. Asimismo, se reportaron los siguientes promedios de porcentaje de humedad relativa diurna y humedad relativa nocturna: 35 y 75 en abril, 20 y 57 en mayo, 35 y 62 en junio, 45 y 67 en julio, y 55 y 77 en agosto (Leyva Corona et al., 2015).
Se puede afirmar que, conforme avanza la temporada, se reduce el potencial de los foliolos como fuente de explantes, y se desaconseja desinfectar foliolos de nogal pecanero adulto en agosto porque el tejido presenta oscurecimiento oxidativo desde el momento de su recolección, el cual se intensifica drásticamente tras la desinfección, con o sin aplicación de fungicida, dejando la totalidad de la superficie del foliolo severamente oscurecida e inviable.
Concentración de sales de Murashige y Skoog
Los resultados del presente estudio indican que el oscurecimiento en los explantes de hoja de nogal pecanero no aumenta al triplicar la concentración de sales de Murashige y Skoog, aun comparando explantes sembrados en abril (el mes en el que las hojas se encuentran más vigorosas) en medio adicionado con 1.46 g/L de sales MS, contra explantes sembrados en mayo en medio adicionado con 4.4 g/L de sales MS.
En otras investigaciones, sí se ha observado un cambio significativo en el oscurecimiento del tejido al alterar la concentración de sales MS en el medio de cultivo. Por ejemplo, Elmaataoui et al. (2020) cultivaron explantes de yemas adventicias de palma datilera en medios adicionados con 1/2 de la concentración basal de sales MS, y 1/3 de la concentración basal de sales MS, y comprobaron que los medios preparados con 1/2 de la concentración basal de sales MS provocaron un mayor porcentaje de tejido oscurecido.
Por otra parte, no hubo un cambio significativo en el porcentaje de explantes con callogénesis al triplicar la concentración de sales MS. Sin embargo, no se probaron las dos concentraciones de sales MS en el cultivo de foliolos recolectados el mismo mes.
Fuente de carbono
En el presente trabajo, el uso de glucosa como fuente de carbono en el medio de cultivo redujo significativamente el oscurecimiento de los explantes de hoja, pero también ocasionó un porcentaje de callogénesis significativamente inferior, en comparación con el de los explantes cultivados en medio suplementado con sacarosa o maltosa. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Martinez et al. (2021). Ellos observaron que un mayor número explantes de hipocotilo, raíz primaria, hoja y tallo de Taraxacum officinale L. produjeron callo cuando fueron cultivados en medio adicionado con 32 g/L de sacarosa, que cuando fueron cultivados en medio suplementado con la misma concentración de glucosa, registrando callogénesis de 98.2±3.7% en los explantes en sacarosa, y 83.2± 3.1% de callogénesis en los explantes en glucosa.
Además, los resultados de oxidación y callogénesis en los explantes inoculados en medio adicionado con sacarosa y maltosa no presentaron diferencias estadísticamente significativas.
Posición del explante sobre el medio de cultivo
En estudios preliminares, se observó que los explantes de nogal pecanero que incluían una parte de la nervadura principal del foliolo sufrían un severo y progresivo oscurecimiento oxidativo, por ello, en la presente investigación, los explantes fueron recortados evitando tomar parte de esa gruesa nervadura. De igual modo, en experimentos de cultivo in vitro de hojas de Erigeron breviscapus, se ha aconsejado evitar tomar explantes que contengan parte de la nervadura principal (Xing et al., 2010). Aunque en otras especies vegetales se han obtenido resultados positivos al tomar explantes a partir de la zona de la nervadura central. Por ejemplo, en un estudio sobre la inducción de la callogénesis en hojas de Sapindus mukorossi Gaertn, se observó que era indispensable conservar un fragmento de la nervadura principal en el explante, de lo contrario, el tejido era incapaz de producir callo (Singh et al., 2015).
En lo que respecta a la posición de siembra del explante de hoja, en el presente trabajo, se comprobó que al colocar la cara adaxial en contacto directo con el medio de cultivo, un mayor porcentaje de explantes producía callo, con un peso fresco y seco, así como un porcentaje de humedad superiores.
Nuestros resultados concuerdan con los de Gamage & Nakanishi (2000), quienes indujeron la producción de brotes adventicios en explantes de hoja de manzano (Malus x domestica Borkh.), y observaron una mayor generación, no sólo de brotes, sino que también de callos, en los explantes sembrados con el envés hacia arriba, en comparación con lo manifestado en explantes inoculados con el haz hacia arriba. De igual modo, en experimentos de cultivo in vitro de hojas de Fragaria vesca, el porcentaje de explantes con callo fue significativamente superior cuando éstos fueron inoculados en el medio de cultivo con la cara abaxial hacia arriba, en comparación con el resultado de sembrarlos en la posición opuesta (Sarker et al., 2020).
Sin embargo, existen muchos estudios donde se revela que cultivar los explantes de hoja con el envés en contacto con el medio de cultivo, promueve mejores resultados. Por ejemplo, se ha comprobado que la posición de los explantes de cotiledón de tomate, sobre el medio de cultivo, influye en su respuesta organogénica ante un tratamiento hormonal. Después de tres semanas de incubación, se observó que sembrar los cotiledones en orientación abaxial, es decir, con el envés hacia abajo, dio mejores resultados que sembrar los explantes en orientación adaxial, o sea, con el haz hacia abajo. Colocar los cotiledones con el envés en contacto con el medio de cultivo permitió que un mayor porcentaje de explantes presentara brotes adventicios, que se formaran brotes más largos y que cada explante produjera un mayor número de brotes (Bhatia et al., 2005).
En otra investigación, se probó el efecto de la inducción de callogénesis en explantes de hoja de Moringa oleifera sembrados en dirección abaxial y adaxial. En dicho estudio, los callos formados en los explantes sembrados en dirección adaxial tuvieron un volumen significativamente menor que los callos sembrados en dirección abaxial (Förster et al., 2013).
En experimentos con hojas de Achyranthes aspera, se probaron diez dosis diferentes de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, que iban de 0.1 a 4 mg/L, y se observó que, en general, inocular los explantes con la cara abaxial en contacto con el medio de cultivo, permitía que un mayor porcentaje de explantes produjera callos; especialmente ante la dosis de 1 mg/L, que fue la dosis probada en el presente estudio. En el caso de A. aspera, el 75% de los explantes que fueron sembrados con el envés en contacto con el medio adicionado con 1 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, produjeron callo, mientras que ninguno de los explantes que fueron sembrados en la posición opuesta produjeron callo (Naz & Khatoon, 2014).
Estudiando la inducción de callos embriogénicos en explantes de hoja de Sapindus mukorossi Gaertn, se observó que todos los explantes produjeron callos cuando fueron sembrados con la cara abaxial en contacto con el medio de cultivo, mientras que sólo el 25% de los explantes presentaron formación de callo cuando se colocaron con la cara adaxial en contacto con el medio. Asimismo, se comprobó que sembrar los explantes con la cara adaxial hacia arriba aumentó de manera significativa la formación de embriones somáticos, en comparación con sembrarlos en la posición inversa (Singh et al., 2015).
En otro estudio, la producción de brotes adventicios en explantes de hoja de manzano salvaje (Malus sieversii) fue más efectiva cuando los segmentos de hoja se inocularon con la cara abaxial en contacto con el medio de cultivo que cuando fueron sembrados al revés (Zhang et al., 2020).
En experimentos realizados con explantes de hoja de pera blanca (Pyrus bretschneideri), se vio que el número promedio de brotes adventicios formados por explante fue mayor cuando la cara abaxial estaba en contacto con el medio de cultivo, en comparación con el promedio observado en los explantes colocados con la cara adaxial en contacto con el medio de cultivo (Sun et al., 2003).
Asimismo, los explantes de hoja de algunas especies vegetales pueden responder de manera indistinta al ser sembrados en diferente posición. Tal y como lo comprobaron Konate et al. (2013), al realizar el cultivo in vitro de cotiledones de Vigna subterranea (L.). Ellos observaron que la callogénesis es semejante cuando explante era inoculado en diferente posición, observándose que el 59.24% de los explantes producían callo cuando eran sembrados con el envés en contacto con el medio, y un 52.22% formaban callo si se les inoculaba con el haz en contacto con el medio. De manera similar, se ha comprobado que se pueden inducir brotes adventicios en hojas de pera japonesa (Pyrus pyrifolia), consiguiendo resultados semejantes al sembrar los explantes en posición abaxial o adaxial (Lane et al., 1998). Y lo mismo ocurrió en experimentos realizados con hojas de arándano. En la investigación aludida, se explicó que las hojas de este arbusto están curveadas en dirección a la cara abaxial, razón por la cual, los explantes sembrados con la cara adaxial hacia abajo, tuvieron una mayor área en contacto con el medio, en comparación con los explantes sembrados con la cara abaxial hacia abajo. Sin embargo, en este caso, la posición del explante (abaxial o adaxial) no tuvo un efecto significativo sobre la inducción de brotes adventicios (Qu et al., 2000).
Tratamiento luminoso
Se sabe que la luz influye sobre la tasa de división celular, y la evolución del etileno, lo cual a su vez puede influir sobre la callogénesis. Por lo tanto, el fotoperiodo puede influir de manera significativa en los procesos morfogénicos que se manifiestan en el explante (Jaramillo & Summers, 1991).
En el presente estudio se observó que exponer los explantes de foliolo de nogal a un fotoperiodo, desde el inicio de su incubación, impidió la producción de callo. Mientras que la incubación en ausencia de luz permitió que, en la mayoría de los tratamientos, más del 80% de los explantes produjeran callo.
Estos resultados concuerdan con los de múltiples investigaciones en las que se han comprobado los beneficios de incubar los explantes en la oscuridad. Esto ha ocurrido al inducir la callogénesis en explantes de hipocotilo de Ajuga bracteosa. Con el objetivo de incrementar la biomasa de los callos iniciados, éstos fueron expuestos a tres diferentes tratamientos: (1) oscuridad continua, (2) fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 de oscuridad, y (3) iluminación continua. Al término del experimento, se observó que los callos crecieron más cuando fueron incubados en oscuridad continua (Ali et al., 2018).
También se ha realizado el cultivo de anteras de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) para la iniciación de callos. En dicho estudio, los callos desarrollados mediante la incubación en ausencia de luz durante 10 semanas, fueron 3.4 veces más grandes que los callos producidos mediante incubación con un periodo inicial de 5 semanas de oscuridad, seguido por 5 semanas de exposición a la luz. Incluso, se observó que, con cada semana adicional de incubación en la oscuridad, los callos lograron crecer 0.27 mm más (Jaramillo & Summers, 1991).
En otra investigación, se probó el efecto de la luz en explantes de hoja de lavanda (Lavandula vera L.) y zamarilla de los muros (Teucrium chamaedrys L.). Los tratamientos evaluados fueron: (1) oscuridad continua por 6 semanas, (2) 0-5 semanas en oscuridad continua, seguido por fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 de oscuridad. Al finalizar las seis semanas de incubación, se observó que los explantes de hoja de lavanda produjeron más callo al incrementar el periodo de incubación en ausencia de luz; no obstante, la formación de embriones somáticos se redujo conforme se aumentó el tiempo de incubación en la oscuridad. En lo que respecta a los explantes de hoja de zamarilla de los muros, el crecimiento del callo no se vio afectado por la presencia o ausencia de luz durante la incubación, sin embargo, la oscuridad favoreció la embriogénesis en el tejido (Kintzios et al., 2002).
Asimismo, se ha trabajado en la inducción de brotes adventicios en explantes de hoja de Erigeron breviscapus. En este caso, la incubación durante 15 días en ausencia de luz permitió que un porcentaje significativamente mayor de explantes produjera brotes, mientras que la incubación ante un periodo de 16 h ocasionó una severa necrosis en los tejidos. Por otra parte, la incubación en la oscuridad durante un periodo superior a 15 días inhibió el desarrollo de brotes (Xing et al., 2010).
Además, en una serie de experimentos realizados con el propósito de maximizar la callogénesis en explantes de hoja de Moringa oleifera, los explantes inicialmente fueron incubados durante 24 h en un ambiente iluminado y, posteriormente, fueron separados en un grupo que continuó expuesto a un fotoperiodo de 16 h de luz, y otro grupo que permaneció en la oscuridad. Al cabo de cuatro semanas, se evaluó el volumen de los callos, y se observó que los explantes expuestos a la luz desarrollaron callos con un volumen significativamente inferior al de los callos desarrollados mediante incubación en oscuridad continua (Förster et al., 2013).
Por otro lado, también existen casos en los que un fotoperiodo puede ser significativamente beneficioso para el desarrollo del cultivo. Por ejemplo, en una serie de experimentos, se cultivaron explantes de cotiledón de Basella rubra L. Transcurridas 5 semanas, los callos incubados en iluminación continua fueron los que produjeron más biomasa (12.42 g), seguidos por los que estuvieron expuestos al fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 de oscuridad (9.02 g), y por último, los que estuvieron en oscuridad constante (4.28 g) (Kumar et al., 2020).
También se ha investigado el efecto de la luz y la oscuridad en la inducción de callo y regeneración de la planta, a partir de cinco explantes diferentes de tres variedades de tabaco (Nicotiana tabacum L.). En las tres variedades, los cinco diferentes tipos de explantes respondieron mejor al fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 de oscuridad, que al tratamiento de oscuridad constante. En la incubación con fotoperiodo, se observó un mayor número de explantes con callo, una mayor cantidad de plantas regeneradas a partir del callo, un número superior de brotes por callo, e incluso una mayor supervivencia en la rustificación (Siddique & Islam, 2015).
Antioxidantes en el medio de cultivo
En la presente investigación, la dosis de nitrato de plata probada propició, en los explantes de hoja, un índice de oscurecimiento y un porcentaje de callogénesis semejantes a los observados en explantes que fueron colocados en medio de cultivo sin antioxidantes. Dichos resultados demuestran que el nitrato de planta no fue perjudicial para el tejido del explante y sugieren que posiblemente una diferente dosis podría tener un impacto más favorable.
Por su parte, los explantes de hoja de nogal, cultivados en medio adicionado con 1 g/L de carbón activado, sufrieron un oscurecimiento oxidativo significativamente menor que los explantes inoculados en medio sin adición de antioxidantes y que los explantes en medio adicionado con nitrato de planta. No obstante, el carbón activado provocó una severa resequedad en el tejido. Esto puede deberse a que el carbón activado es una sustancia higroscópica, es decir, se trata de una sustancia capaz de absorber la humedad del aire, así como el agua líquida; y su higroscopicidad varía según la temperatura empleada en su fabricación (CIOFU, 2015).
Ávila Treviño et al. (2013) también probaron el efecto del carbón activado en explantes de hoja de nogal pecanero; ellos adicionaron 10 g/L de carbón activado al medio de cultivo y lograron reducir el necrosamiento de manera significativa. Pero, en dicha investigación, no se evaluó la inhibición del oscurecimiento y la inducción de la callogénesis de manera simultánea, por lo que no se comprobó la conservación de la responsividad del explante ante la mencionada dosis de carbón activado.
El efecto perjudicial del carbón activado en el medio de cultivo, también ha sido observado en otros estudios. Como ha ocurrido en experimentos de cultivo in vitro de brotes de Aloe vera. Los resultados de dichos estudios demostraron que los explantes sembrados en medio de cultivo libre de antioxidantes, produjeron un mayor número de brotes que aquellos explantes que fueron sembrados en medio suplementado con 0.5, 1 o 2 g/L de carbón activado. Esto ocurre porque el carbón activado es un poderoso absorbente y, además de absorber las sustancias tóxicas del medio de cultivo, absorbe también algunos nutrientes, y grandes cantidades de fitorreguladores, lo cual puede inhibir el crecimiento in vitro (Das & Srivastav, 2015).
Pese a lo anterior, en muchos otros estudios se han mesurado los beneficios de incluir carbón activado en el medio de cultivo. Por ejemplo, Abdelwahd et al. (2008) trabajaron con explantes de yema cotiledonar, nudo cotiledonar e hipocotilo de Vicia fava L., y observaron que ninguno de los explantes cultivados en medio suplementado con 10 g/L de carbón activado presentaron oxidación, mientras que el 13.46% de los explantes del control sí presentaron oscurecimiento oxidativo.
En otro estudio, se cultivaron embriones cigóticos de palma de aceite en medio suplementado con 2 g/L de carbón activado y en medio sin la adición de este absorbente. Al término del experimento, se observó un porcentaje de supervivencia de explantes significativamente superior en el medio adicionado con carbón activado (Sparjanbabu et al., 2019).
También es posible que la disparidad de resultados sea propiciada, al menos parcialmente, por la calidad del carbón activado utilizado, pues sus propiedades varían de acuerdo al método utilizado para su obtención y el material vegetal de origen (CIOFU, 2015). Además, la efectividad del carbón activado como promotor de la viabilidad y morfogénesis de los explantes depende del resto de los componentes del medio y del tejido vegetal cultivado (Pan & Van Staden, 1999).
Se sabe que el carbón activado promueve la organogénesis en explantes de diversas especies de plantas leñosas. Pero debe tomarse en cuenta que el material de origen del carbón activado, así como las impurezas, pueden influir en las propiedades del carbón. Por ello, en cultivo in vitro de tejidos vegetales, se recomienda utilizar carbón activado lavado en ácido y posteriormente neutralizado (Pan & van Staden, 1998). Aunque existe evidencia de que tanto el carbón activado lavado en ácido como el carbón activado neutralizado, alteran de manera significativamente el pH del medio de cultivo después del autoclavado (Owen et al., 1991).
El pH del medio puede impactar la integridad de las moléculas de sacarosa, ya que la hidrólisis o inversión de la sacarosa es un proceso que puede ser catalizado por ácidos, bases, sales y enzimas (Torres et al., 1994), liberando las moléculas de glucosa y fructosa que constituyen al disacárido (Jin et al., 2015). Asimismo, se ha comprobado que el grado de hidrólisis de la sacarosa es proporcional a la concentración de carbón activado en el medio de cultivo (Pan & Van Staden, 1999).
Lo anterior ocurre por el efecto que tiene el carbón activado sobre el pH del medio. Ya se han hecho pruebas con medio para el cultivo in vitro de tejidos vegetales, ajustando el pH del medio a 5.7, previo al autoclavado, y se ha observado que el medio de cultivo libre de carbón activado puede sufrir una disminución de su pH después de la esterilización, adquiriendo un pH de 4.67, mientras que un medio con la misma composición pero suplementado con 5 g/L de carbón activado puede sufrir una elevación de su pH a 6.08 (Eymar et al., 2000).
En otro estudio, se prepararon medios de cultivo adicionados con 2.5 g/L de diferentes tipos de carbón activado. Además, se incluyó un blanco, que consistió en medio de cultivo sin carbón activado. Tres de los productos probados indicaban haber pasado por un lavado ácido; otro producto indicaba haber sido neutralizado, y los otros tres productos no especificaban su tratamiento. Tras pasar 8 días de almacenaje, se midió el pH de los medios, y se observó que el único medio que sufrió una disminución de su pH tras el almacenaje fue el control. El resto de los medios sufrieron una elevación significativa de su pH, incluyendo el medio que fue adicionado con carbón activado neutralizado (Sáenz et al., 2010).
Cabe señalar que la hidrólisis de la sacarosa a causa del autoclavado, puede favorecer o perjudicar el desarrollo del cultivo, y esto depende de la especie vegetal cultivada, pues hay especies en las que la fructosa inhibe el crecimiento (Pan & van Staden, 1998). Por ejemplo, en un estudio, se probó el efecto de la adición de diferentes fuentes de carbono (fructosa, glucosa, sacarosa y maltosa) al medio de cultivo utilizado para la inducción de la callogénesis en explantes de cotiledón e hipocotilo de algodón. Y se observó que los medios de cultivo suplementados con fructosa provocaron que un menor porcentaje de explantes produjera callo, y que hubiera una mayor secreción de compuestos fenólicos (Ganesan et al., 2015).
Además de alterar el pH del medio y con ello influir sobre la hidrólisis de la sacarosa, el carbón activado ejerce su poder adsorbente sobre la sacarosa y sus componentes de manera particular. A saber, el carbón activado tiene mayor afinidad por los oligosacáridos, es decir, los azúcares de mayor peso molecular, que por los monosacáridos y disacáridos, que son azúcares de menor peso molecular (Kuhn et al., 2014; Nobre et al., 2019).
Textura y color de los callos
En los diferentes tratamientos del presente estudio, se observó la formación de callos blancos, marrones y amarillos. Como se observa en la Tabla 7, los callos blancos tuvieron una textura compacta, y el porcentaje de humedad más bajo (79.58±8.30%). Los callos marrones presentaron una textura friable, y el contenido de agua más alto (89.52±0.87%), mientras que los callos amarillos tuvieron una textura variada con tendencia a la compacidad.
En explantes de hoja de Byrsonima verbascifolia, se han inducido callos friables, con un porcentaje de humedad de 90.14-94.81, y callos compactos con un porcentaje de humedad de 80.33-93.62 (Fonsêca Castro et al., 2016). En dicho caso, el porcentaje de humedad no ha sido una característica distintiva entre callos friables y compactos.
Incluso, se ha descrito la obtención de callos compactos con un mayor porcentaje de humedad que los callos friables. Como explican Osman et al. (2016), quienes trabajaron con explantes de endospermo de Barringtonia racemosa L. y reportaron la obtención de callos friables frescos con un contenido de agua dentro del rango de 69.37-85.78%, y callos compactos con 82.33-92.86% de humedad.
Lo anterior demuestra que el contenido de agua no tiene que estar correlacionada con la friabilidad del callo. Por otra parte, Daffalla et al. (2019) explican que la humedad del callo puede ser aprovechada como un indicador de la viabilidad de las células que lo integran.
Conclusiones
Con la presente investigación se lograron identificar parámetros de recolección de muestras, desinfección y cultivo in vitro, fundamentales para la iniciación de callos en explantes de foliolo de nogal pecanero adulto. Los resultados destacaron el efecto promotor de recolectar el tejido vegetal en abril, y sembrar los explantes en medio adicionado con sacarosa, en ausencia de luz.
