Introducción

En México, en el 2014 se sembraron 9966 ha con fresa (Fragaria×ananassa Duch.) y la producción de los estados de Michoacán (259 000 Mg), Baja California (146 000 Mg) y Guanajuato (29 000 Mg) fue el 94 % de la producción nacional. En ese año, el valor de la producción de esa fruta en Guanajuato fue de 124 millones de pesos (US$ 9.3 millones) (^{Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera, 2015}). En dicho estado, el cultivo es susceptible a enfermedades fúngicas en raíz y corona, por lo cual la superficie sembrada disminuye cada año. La secadera de la fresa es la enfermedad más frecuente y genera la muerte gradual de la planta (^{Castro y Dávalos, 1990}).

En la región central de México Fusarium oxysporum causa la enfermedad y es el hongo más frecuente porque se presenta desde etapas tempranas del cultivo y causa pérdidas mayores al 50 %, equivalente a 7.5 Mg ha^-1 (^{Dávalos et al., 1992}). Además de esta especie, F. solani, F. moniliforme (sin. F. verticillioides), Phytophthora fragariae, Rhizoctonia solani, R. fragariae, Alternaria spp., Pythium aphanidermatum, Verticillium alboatrum, Colletotrichum spp., Cylindrocladium spp., y Ramularia spp., también se identifican como parte del problema y causan pérdidas significativas según las condiciones ambientales, manejo del cultivo y textura del suelo (^{Castro y Dávalos, 1990}; ^{Ceja et al., 2008}).

En el Laboratorio de Fitopatología del INIFAP-CEBAJ, en los análisis de plantas con síntomas típicos de secadera de la fresa se observaron diferencias culturales y morfológicas en aislados de Fusarium lo cual sugiere que más de una especie o una especie diferente a las reportadas está presente y causa la enfermedad. También se aisló al hongo Alternaria spp., en una frecuencia más alta que la de otros hongos de mayor importancia como Verticillium spp., y Rhizoctonia spp., pero no está identificado a nivel de especie (Mariscal, 2015^[1]). Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue conocer la presencia actual de los hongos asociados con la enfermedad, calcular su frecuencia e identificarlos mediante características culturales, morfológicas y secuenciación de las ITS, e identificar otras especies asociadas con este problema fitosanitario en Guanajuato. La hipótesis fue que hay otras especies de hongos diferentes a las reportadas que causan la secadera de la fresa.

Materiales y Métodos

Durante el ciclo agrícola primavera-verano 2014 (PV/2014) y 2015 (PV/2015) se recolectaron plantas de los cultivares ‘Camino Real’, ‘Festival’, ‘Albión’, ‘Portales’ ‘Camarosa’ y ‘San Andres’ con síntomas característicos de secadera de la fresa (marchitez, enanismo y clorosis) en parcelas comerciales de 34 localidades de tres municipios en Guanajuato. De las 170 muestras, 160 fueron del municipio de Irapuato, cinco de Abasolo y cinco de Salamanca. Los hongos aislados se purificaron mediante la técnica de cultivos monospóricos y por punta de hifa en medio Papa-Dextrosa-Agar (PDA, BD Bioxon®), 39 g L^-1 agua destilada adicionando 0.25 % de ácido láctico. De cada planta se obtuvieron ocho aislados puros, cuatro de tejido de raíz y cuatro de la corona.

La primera identificación se realizó de 511 aislados puros obtenidos del ciclo PV/2014 y 833 del ciclo PV/2015. Para la clasificación del género Fusarium se observó el crecimiento micelial y la pigmentación del medio de cultivo; y mediante preparaciones temporales, la caracterización de microconidos, macroconidios y clamidosporas. Las características culturales y morfológicas se compararon con las descripciones de ^{Nelson et al. (1983)} y ^{Leslie y Summerell (2006)}. Para los otros géneros de hongos se observó el tipo de crecimiento, color del micelio y la forma y tamaño de los conidios comparándolos con las descripciones de ^{University of California (1994)} y ^{Anaya y Romero (2011)}. Debido a la cantidad alta de aislados clasificados dentro del género Fusarium, se seleccionó un aislado de cada localidad y se sembró en medio Hoja de Clavel-Agar (CLA) (HYCEL®), 20 g L^-1 agua destilada. Para una mejor comparación se sembró la cepa certificada F. oxysporum f. sp. fragariae [IFO 31180 (8)] (ATCC®) en PDA y CLA.

Los aislados seleccionados se usaron para la identificación molecular mediante la amplificación y secuenciación de la región espaciadora transcrita (ITS). La extracción de ADN de cada aislado se realizó adaptando el protocolo de ^{Lievens et al. (2003)}. Para la PCR se usó el oligonucleótido sentido ITS1-F (5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’) (^{Gardes y Bruns, 1993}) y el oligonucleótido antisentido ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (^{White et al., 1990}) que delimitan al ITS1, la región 5.8 S y el ITS2 del hongo. La mezcla de reacción fue 25 ng de ADN, 1x regulador de PCR (SENNA®), 0.2 mM de cada dNTP, 0.5 µM del oligonucleótido sentido, 1.0 µM del oligonucleótido antisentido y 1 U Taq ADN Polimerasa de Alta Fidelidad (SENNA®) en un volumen de 25 µL. La amplificación se hizo en un termociclador T100™ (Bio-Rad®) con el programa: 1 ciclo 94 °C, 2 min; 35 ciclos 94 °C, 45 s; 59 °C, 45 s; 72 °C, 90 s; 1 ciclo 72 °C, 10 min. Los productos se purificaron con el kit Freeze ‘N Squeeze™ DNA Gel Extraction Spin Columns (Bio-Rad®), según el protocolo del fabricante. Los productos purificados se secuenciaron en el Departamento de Servicios Genómicos LANGEBIO, CINVESTAV-Campus Guanajuato con el método de Sanger. Las secuencias obtenidas se compararon y alinearon con las de la base de datos del Gen Bank del NCBI, USA, mediante Nucleotide BLAST (^{National Center for Biotechnology Information, 2015}).

La frecuencia de aislamiento de los géneros de hongos por ciclo agrícola se calculó con la ecuación: Frecuencia (%)=(No. de aislados del género identificado / total de aislados analizados por ciclo)*100 (^{Juber et al., 2014}).

Resultados y Discusión

Los resultados de la identificación de hongos y su aislamiento desde tejido infectado de raíz y corona de plantas de fresa revelaron la presencia de tres géneros importantes ya reportados por ^{Castro y Dávalos (1990)} y ^{Ceja et al. (2008)}. El género más frecuente fue Fusarium aislado de todas las plantas de todas las localidades en ambos ciclos agrícolas. La frecuencia de este género fue de 54 % en PV/2014 y 60 % en PV/2015 (Figura 1), resultados que coinciden con las frecuencias altas reportadas por ^{Castro y Dávalos (1990)} y ^{Ceja et al. (2008)}, quienes aislaron a Fusarium spp., en 47 y 83 %, respectivamente. En PDA, este microorganismo mostró diferentes características culturales tales como pigmentaciones de color blanco, rosa, salmón, rojo, magenta y violeta, las cuales se tornaron más oscuras con la edad, y en algunos casos, abundante micelio algodonoso y esparcido en la caja Petri. En CLA no se produjeron pigmentaciones en ningún aislado pero se presentaron esporodoquios color amarillo, amarillo cremoso y naranja pálido sobre las hojas de clavel. Mediante el análisis microscópico se observaron microconidos abundantes, hialinos, ovoides a elipsoidales con 0-1 septa (Figura 2J) de 1.8-3.8×2.06-12.0 µm. Se observaron al menos cuatro tipos de macroconidos de 1.68-4.0×12.4-41.5 µm con 3-4 septas (Figura 2B-I). La mayoría de los macroconidios fueron hialinos, curvos con una célula apical curva y una célula basal en forma de pie (Figura 2E), algunos con características similares a los macroconidios de F. oxysporum f. sp. fragariae [IFO 31180 (8)] (ATCC®) de 1.68-2.60×17.70-30.60 µm (Figura 2A). Algunos aislados produjeron abundantes clamidosporas de forma terminal o intercaladas en el micelio, solitarias o en cadenas de 3-7 células con paredes rugosas y verrugosas (Figura 2K, L). Estas características culturales y morfológicas coincidieron con las descritas por ^{Nelson et al. (1983)} y ^{Leslie y Summerell (2006)} para especies de este género y en algunos aislados para la especie F. oxysporum.

Figura 1 Frecuencia en porcentaje de Fusarium spp., Alternaria spp., y Rhizoctonia spp., en 511 aislados de tejido infectado de raíz y corona de fresa en el ciclo agrícola primavera-verano 2014 y 833 aislados en el ciclo primavera-verano 2014. 

El género Alternaria fue el segundo más frecuente en ambos ciclos: 36 % en PV/2014 y 29 % en PV/2015 (Figura 1). Estas frecuencias coincidieron en parte con las reportadas por ^{Castro y Dávalos (1990)} donde Alternaria spp. se aisló en 5-12 % y fue el tercer hongo más frecuente después de Fusarium spp., y Verticillium spp. En PDA, los aislados mostraron un crecimiento micelial algodonoso color blanco que se tornó gris y café oscuro con la edad. Se observaron dos tipos de conidios, los primeros fueron cortos, en cadenas de 3-5 células, a menudo con tres septas, ovoides, color café claro, con paredes lisas y una célula apical cónica corta (Figura 2 N). Los segundos fueron conidios más largos, en cadenas de 6-8 células, a menudo con seis septas, color café claro, con paredes lisas y con una célula apical cónica (Figura 2 O), de 4.0-8.8×9.6-22.5 µm. Las características de los primeros conidios (Figura 2N) fueron similares a las descritas por ^{Simmons (2007)} para la especie A. alternata. En otros estudios se aisló Alternaria spp., de raíces y coronas infectadas, pero esta especie no causó infección en estas partes de la planta.

El género menos frecuente fue Rhizoctonia con 11 % en ambos ciclos agrícolas (Figura 1); ^{Castro y Dávalos (1990)} y ^{Ceja et al. (2008)} reportaron también este género como el menos frecuente con 2-15 % y 2-10 %, respectivamente, lo cual coincide con las frecuencias bajas calculadas en nuestro estudio. En PDA, los aislados mostraron un crecimiento micelial ligeramente anillado con un color de micelio blanco a café claro. El hongo produjo hifas típicas con ramificaciones en ángulo recto (90 °C), con una ligera constricción de la hifa al inicio de la ramificación y las dos septas distintivas, una en la hifa principal y la otra en la ramificación (Figura 2 P). La tinción de hifas con safranina indicó la presencia de hifas multinucleadas que corresponde con la especie R. solani (Figura 2 Q) (^{UC, 1994}; ^{Anaya y Romero, 2011}).

Figura 2 Micrografias de Fusarium spp.; diferentes tipos de macroconidios (A-I); microconidios (J); clamidosporas (K-L); microconidios en cadenas largas (M); Alternaria spp., con dos tipos de conidios (N-O), y Rhizoctonia spp., con hifas en ángulo de 90° (P) y multiples núcleos (flechas) (Q). 

Los amplicones obtenidos con el oligonucleótido sentido ITS1-F y el oligonucleótido antisentido ITS4, a partir de ADN de los aislados seleccionados de Fusarium, tuvieron un tamaño aproximado de 600 a 850 pb (Figura 3). La secuencia de 34 ITS de los aislados seleccionados fue obtenida. Por su tamaño (>200 pb), solo 15 secuencias fueron almacenadas en el Gen Bank; nueve de ellas (números de acceso: KT183399, KT183401, KT183402, KT183404, KT183405, KT183406, KT183408, KT183409 y KT1834-10) tuvieron una homología de 99-100 % con la mayoría de las secuencias de F. oxysporum, y la secuencia KT183403 tuvo una homología de 100 % con la especie F. oxysporum y F. oxysporum f. sp. ciceris. Las últimas cinco secuencias (KT183400, KT183407, KT183411, KT183412 y KT183413) tuvieron porcentajes de homología con F. verticillioides (100 %), F. pseudonygamai (100 %), F. fujikuroi (100 %), F. proliferatum (100 %) y F. brachygibbosum (99 %). Por asociación entre las dos técnicas de identificación y las características de los macroconidios de F. oxysporum f. sp. fragariae (Figura 2 A), los macroconidios de la Figura 2B, C, D y E, correspondieron a F. oxysporum. Los macroconidios (Figura 2G) y las cadenas largas de microconidios (Figura 2M) coinciden en características con las de F. verticillioides; y los macroconidios (Figura 2H) y las características culturales del aislamiento de donde se extrajeron coinciden con F. proliferatum (^{Nelson et al., 1983}; ^{Leslie y Summerell, 2006}; ^{Pitt y Hocking, 2009}).

Figura 3 Amplificación de ITS de aislados de Fusarium spp., con el oligonucleótido sentido ITS1-F y el oligonucleótido antisentido ITS4; M=marcador de tamaño 1 kb Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific®); carril 1-13, muestras de Fusarium spp.; los fragmentos amplificados se muestran con una flecha. 

Las especies diferentes de Fusarium identificadas en nuestro estudio indican que la secadera de la fresa es causada por un complejo de especies, de las que se han identificado y aislado de tejido infectado de raíz y corona a F. solani (^{Ceja et al., 2008}), F. verticillioides (^{Téliz et al., 1986}) y F. oxysporum (el más común) (^{Castro y Dávalos, 1990}). Sin embargo, es necesario hacer pruebas de patogenicidad con las otras especies de este género identificadas molecularmente: F. pseudonygamai, F. fujikuroi, F. proliferatum y F. brachygibbosum, que no están reportadas como causantes de esta enfermedad en el cultivo al igual que A. alternata. Las especies F. solani, Cylindrocarpon spp., Pythium aphanidermatum, Phytophthora sp., Verticillium spp., Phoma spp., y Colletotrichum spp., reportadas por ^{Castro y Dávalos (1990)} y ^{Ceja et al. (2008)} en Guanajuato, no se identificaron en nuestro estudio.

Conclusiones

Los géneros más abundantes son Fusarium, Rhizoctonia y Alternaria de los cuales Fusarium con la especie Fusarium oxysporum es el más frecuente. El segundo y tercer género más frecuente fue Alternaria, con la especie A. alternata y Rhizoctonia, identificados con su aislado y morfología. Las diversas características culturales y morfológicas y la comparación e identificación mediante ITS de siete especies de Fusarium sugieren que la secadera de la fresa es causada por un complejo de especies y por otros hongos diferentes no reportados.