Materia prima

El bagazo de sorgo [Sorghum bicolor (L.) Moench.], variedad RB-Paloma fue donado por el Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Río Bravo, Tamaulipas, México. El bagazo se cortó en trozos de 5 cm de largo, se secó en estufa con aireación a 60 °C por 24 h, se molió y tamizó para obtener partículas con diámetro aproximado de 500 mm.

Estudios preliminares

Dado que el pretratamiento más utilizado para la hidrólisis ácida es la molienda para obtener una mayor superficie de contacto, se determinó la factibilidad de usar una harina fina (tamaño de partícula ≤0.05 µm) y una más gruesa (≥500 mm, producto del tamizado), o usar una mezcla de ambas harinas en proporción 1:1 para aprovechar todo el residuo. Una hidrólisis se realizó en las siguientes condiciones: ácido sulfúrico al 4 % por 80 min a 120 °C, con una relación sólido-líquido de 1:6 con los tres tratamientos; estas condiciones se seleccionaron de acuerdo con los estudios de ^{Aguilar et al. (2002)}, ^{Téllez-Luis et al. (2002)} y ^{Sepúlveda-Huerta et al. (2006)}.

Hidrólisis y detoxificación

La hidrólisis se realizó con ácido sulfúrico, en las siguientes condiciones: ácido 2, 4 y 6 %; relación sólido/líquido de 1:6, 1:8 y 1:10. El tiempo de reacción y temperatura fueron constantes, 80 min y 120 °C, respectivamente; y nueve tratamientos de hidrólisis de harina de bagazo de sorgo (Cuadro 1).

Después, se seleccionaron las mejores condiciones de hidrólisis, los jarabes obtenidos fueron divididos en dos partes iguales, y una fue tratada con carbón activado para eliminar compuestos inhibidores, furfural y ácido acético. Las condiciones de detoxificación fueron las siguientes: pH 5, con un tiempo de 45 min y carga de carbón activado al 1.5. La otra parte de los jarabes no fue detoxificada, con la finalidad de evaluar el crecimiento de la levadura en presencia de furfural y ácido acético. Luego se ajustó el pH de los hidrolizados con carbón activo y de los no tratados; se adicionó carbonato de calcio (CaCO₃) seguido por una filtración al vacío y se midió con un potenciómetro (Ultra Basic UB-10 Denver Instrument). Una muestra de 50 g de la mezcla jarabe-carbón activado se puso en matraces de 250 mL, se agitaron a 150 rpm y 45 °C en una incubadora. Después las muestras se centrifugaron a 10 000 rpm por 10 min, y se analizó la concentración de xilosa, ácido acético, furfural, antes y después de la adición de carbón activado. La concentración de xilosa y ácido acético se determinaron mediante Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC HP-1100) utilizando una columna Transgenomic ION-300, con una temperatura de horno de 45 ºC, y elución isocrática de 0.4 mL min^-1 de flujo de fase móvil (H₂SO₄ 0,0025 M). La concentración de furural se midió mediante espectrofotometría de UV-vis (UV-1800 Shimadzu) a una longitud de onda de 270 nm.

Microorganismo y medio de cultivo

La cepa liofilizada de D. hansenii NRRL Y-7426 se reactivó en matraces Erlenmeyer con 100 mL de medio con xilosa (30 g L^-1), peptona (5 g L^-1) y extracto de levadura (3 g L^-1), se ajustó el pH a 5.5, se incubó a 28 °C, con agitación a 150 rpm por 48 h. Después se evaluó la producción de xilitol en los medios a base de xilosa producto del hidrolizado ácido de bagazo de sorgo.

Producción de xilitol

La producción de xilitol por D. hansenii se evaluó en medios con hidrolizados detoxificados y sin detoxificar con 30, 40 y 50 g L^-1 de xilosa, a 30 y 35 °C y una velocidad de agitación de 120 y 200 rpm, la concentración de xilitol se midió desde el tiempo cero hasta 96 h de fermentación, cada 12 h. Las variables determinadas fueron el rendimiento o factor de conversión (Y_P/S, g xilitol producido por g xilosa consumida) y productividad volumétrica (Qp, g xilitol producido por L de medio en 1 h). La concentración de xilitol fue medida por HPLC utilizando las mismas condiciones que las mencionadas para xilosa.

Con los datos se realizó ANDEVA multifactorial para determinar el efecto de las variables independientes sobre la composición del hidrolizado y producción de xilitol. Las diferencias entre los tratamientos se evaluaron con un análisis de comparación de medias de Fisher (p≤0.05).

Hidrólisis ácida de bagazo de sorgo RB-Paloma y detoxificación

El tratamiento TH3 (H₂SO₄ al 6 %, 120 °C por 80 min y relación sólido/líquido 1:6) produjo la mayor concentración de xilosa (63.82 ± 0.78 g L^-1), mientras que la concentración más baja se obtuvo en el TH7 con 23.09 ± 4.56 g L^-1, con 2 % de H₂SO₄ a 120 °C por 80 min en relación 1:10 (Cuadro 3). Esta cantidad de xilosa es similar a la reportada por Téllez-Luis et al. (2001) con una concentración de 16 g L^-1 de xilosa con la hidrólisis ácida de paja de sorgo rojo con H₂SO₄ al 6 %, por 60 min y 120 °C. ^{Herazo et al. (2009)} hidrolizaron cascarilla de arroz con H₂SO₄ al 2 % por 30 min y obtuvieron 32.5 g L^-1 de azúcares reductores y 9.9 g L^-1 de xilosa.

Para el crecimiento de D. hansennii y producción de xilitol se usaron las condiciones de hidrólisis del tratamiento TH9 porque produjo menor cantidad de furfural y ácido acético. Estos compuestos resultan de la degradación de lignina y actúan como inhibidores del crecimiento microbiano al reducir el metabolismo (^{Mussatto y Roberto, 2004}; ^{Oliva et al., 2006}; ^{Pereira et al., 2011}); en consecuencia es importante tener valores bajos de estos compuestos tóxicos. Las fermentaciones se realizaron en medios detoxificados y sin detoxificar, con el propósito de evaluar el crecimiento de la levadura en presencia de compuestos inhibidores, y así disminuir costos y tiempo de producción.

Detoxificación

Con el proceso de detoxificación con carbón activado, el ácido acético y furfural disminuyeron en 72 y 65.5 %, respectivamente (Cuadro 4). Kamal et al. (2011) realizaron hidrólisis ácida de tronco de palma, después los jarabes obtenidos se detoxificaron con 1 y 2.5 % de carbón activado, y se encontró una reducción máxima de 58 % de furfural con 2.5% de carbón activado. ^{Villarreal et al. (2006)} efectuaron realizaron hidrólisis ácida de residuos de eucalipto y reportaron una reducción de 100 y 10.6 % de furfural y ácido acético, respectivamente, utilizando 5 % de carbón activado a un pH de 5.5.

Con el objetivo de evaluar cual de los dos factores (concentración de ácido, relación sólido/líquido o ambos) tenían mayor efecto sobre la concentración de xilosa obtenida, se realizó un ANDEVA de dos vías con 95 % de confianza. El resultado mostró que el porcentaje de ácido fue el factor principal en las hidrólisis realizadas (p≤0.05), y en el presente estudio la relación sólido/líquido no muestra diferencia significativa (p>0.05) entre tratamientos (Cuadro 5).

Producción de xilitol en medios detoxificados y sin detoxificar

La mayor concentración de xilitol en los medios detoxificados con carbón activado se obtuvo en el TH8 (40 g xilosa, 35 °C, 200 rpm) con 28.8 g L^-1 a las 48 h de fermentación; mientras que en los medios no detoxificados, el TH11 (30 g xilosa, 35 °C, 150 rpm) produjo una concentración máxima de 29.23 g L^-1 a las 48 h. La concentración de xilitol fue similar en los medios con hidrolizados no detoxificados y detoxificados. Aunque ^{Carvalheiro et al. (2005)} mencionan que la producción de xilitol es favorecida por altas concentraciones de xilosa, en nuestro estudio la menor concentración de xilitol fue en el medio con 50 g L^-1 de la fuente de carbono. ^{Carvalheiro et al. (2005)} realizaron tratamientos de detoxificación en hidrolizados ácidos de cascarilla de arroz, y encontraron que el uso de resina de intercambio iónico eliminaba la mayor concentración de furfural, pero los medios diseñados con estos hidrolizados detoxificados tuvieron bajo rendimiento de xilitol (0.51 g g^-1). Esto puede deberse a que estos procesos eliminan compuestos inhibidores, pero también otros compuestos, como minerales, que pueden servir como factores de crecimiento para la levadura.

La concentración máxima de xilitol fue 29.23 g L^-1 (Cuadro 6) y se obtuvo con hidrolizado sin detoxificar, aunque el proceso de detoxificación mejora la capacidad de fermentación de los microorganismos en medios a base de hidrolizados lignocelulósicos (^{Alriksson et al., 2011}; ^{Cavka y Jönsson, 2013}). Los tratamientos 1 al 8 corresponden a fermentaciones en medios con hidrolizados detoxificados, mientras que del 9 a 19 corresponden a los no detoxificados. Una vez alcanzada la máxima producción de xilitol la concentración de xilosa disminuye debido a la conversión de este a xilitol, ya que este último es un metabolito primario, lo cual significa que está relacionado con el crecimiento de la levadura; es decir, D. hansenii utiliza xilosa como fuente de carbono para poder crecer y por ello la relación xilosa-crecimiento es inversamente proporcional. Por tanto, es importante establecer el tiempo de fermentación óptimo, porque cuando el microorganismo entra a fase estacionaria desciende la concentración del metabolito.

Dentro de los métodos más comunes de detoxificación está el ajuste de pH con carbonato de calcio, seguido de adsorción con carbón activado (^{Carvalheiro et al., 2005}). ^{Greetham et al. (2016)} mencionan que una concentración baja de ácido acético ejerce un efecto antagónico contra furfural, lo cual permite que la levadura crezca bajo estas condiciones de estrés.

^{Villarreal et al. (2006)} realizaron una hidrólisis con residuo hemicelulósico de eucalipto (Eucalyptus grandis) y usaron una cepa de Candida guilliermondii encargada de la conversión de xilosa; la máxima concentración de xilitol alcanzada fue 32.7 g L^-1 a las 48 h de fermentación, con un rendimiento de 0.57 g g^-1 y Qp de 0.68 g L^-1 h^-1. Mussatto y Roberto (2001) hidrolizaron paja de arroz con 0.1 M H₂SO₄ a 121 °C por 20 min y una relación sólido/líquido 1:10, y para la conversión de xilosa por C. guilliermondii FTI 20037 usaron 20 g L^-1 de xilosa en los medios de cultivo y obtuvieron 0.72 g g^-1 y productividad volumétrica de 0.61 g L^-1 h^-1.

Carvalheiro et al. (2006) evaluaron la producción de xilitol por D. hansenii en medios a base de hidrolizados ácidos de granos de cervecería, procesaron hidrolizados detoxificados con carbón activado y no detoxificados, y los valores para Y_P/S obtenidos fueron 0.51 y 0.5 g g^-1 y para Qp 0.29 y 0.33 g L^-1 h^-1 en medios detoxificados y no detoxificados, respectivamente. Esas cantidades son menores a las de nuestro estudio: máximos de 1.16 g g^-1 y 1.13 g L^-1 h^-1 para Y_P/S y Qp respectivamente, a las 24 h de fermentación en medio sin detoxificar; en hidrolizado detoxificado los valores de Y_P/S y Qp máximos fueron 1.18 g g^-1 y 0.79 g L^-1 h^-1. La tendencia en ambos estudios fue similar en cuanto a mayor productividad volumétrica de xilitol desde medios no detoxificados. ^{Huang et al. (2011)} aislaron la cepa de C. tropicalis JH030 desde lodos residuales de una planta productora de bioetanol, evaluaron su crecimiento y producción de xilitol en medios no detoxificados de paja de arroz y reportaron un Y_P/S= 0.71 g g-1. En nuestro estudio los medios a base de bagazo de sorgo blanco variedad RB-Paloma, aún sin detoxifcar, son fuente considerable de carbono para el proceso de crecimiento de D. hansenii y su conversión de xilosa a xilitol debido a un buen rendimiento y productividad volumétrica, que es superior a lo reportado en otros estudios con materiales lignocelulósicos.

^{Wang et al. (2011)} emplearon hidrolizados de mazorca de maíz y realizaron fermentaciones a 150 y 200 rpm con 140 g L^-1 de xilosa y temperatura de 30 °C; la mayor cantidad de xilitol se obtuvo con 200 rpm, y una Qp de 2.12 g L^-1 h^-1 a las 24 h de fermentación. Aunque la productividad volumétrica es el doble de la obtenida en nuestro estudio, la concentración de xilosa empleada es casi cinco veces mayor, lo cual aumenta los costos de producción.

Por último, con las concentraciones máximas de cada tratamiento de fermentación se realizó un ANDEVA multifactorial con 95 % de confianza y no se encontraron diferencias significativas (Cuadro 7). Así, con estos resultados se estima que no existe diferencia entre utilizar hidrolizados detoxificados o no detoxificados, lo cual significa un aumento potencial en la producción de xilitol con reducción de tiempo, costo y materiales al eliminar el proceso de detoxificación en los hidrolizados.