Recolección de biomasa y acondicionamiento

Se recolectó la biomasa senescente (hojas y tallos) de pimiento morrón (BPM), tipo blocky, variedad Thames F1, sembrado a cielo abierto, en Culiacán, Sinaloa. También se colectó la biomasa de maíz criollo (BMC) raza chapolote, sembrado a cielo abierto y la biomasa de maíz amarillo híbrido (BMH) SYN307 ambas de predios ubicados en Navolato, Sinaloa. La biomasa se deshidrató en un horno de secado por aire forzado marca Excalibur, durante 12 h a 60 °C. Una vez seca se procesó en un pulverizador semi industrial marca Pulvex® modelo 300 y se almacenó en bolsas de polipropileno a -20 °C.

Extracción tradicional (extractos acuosos)

Para la extracción se pesaron 90 g de BPM, y se dejaron macerar en 950 mL de agua destilada. Se pesaron 45 g de BMC y de BMH y se dejaron en maceración en 1 L de agua destilada. Las muestras estuvieron en agitación constante a 800 rpm, durante 24 h a 30 °C. Se separó el sobrenadante del pellet mediante una filtración con papel Whatman No. 1, los sobrenadantes se liofilizaron y conservaron a -20 °C hasta su uso.

Síntesis de Disolventes Eutécticos Profundos (DES) y extracción de los fitoquímicos

Se sintetizaron los DES con el método descrito por ^{Dai, van Spronsen, Witkamp, Verpoorte & Choi (2013)}. Se utilizó cloruro de colina (ChCl) (99 % Sigma Aldrich) como aceptor de enlaces de hidrógeno, por sus siglas en inglés (HBA) y ácido láctico (85 % Sigma Aldrich) como donador de enlaces de hidrógeno (HBD), en relación 1:4 molar (DES1). Para el DES2 se usó ChCl y 1,2-butanediol (99 % Sigma Aldrich) 1:2 molar. La síntesis consistió en calentar la mezcla de ambos compuestos a 80 °C con agitación constante, durante 1 h, al final a cada DES se le añadió 30 % de agua (p/p).

Para la obtención de los fitoquímicos se pesaron 30 mg de las biomasas (BPM, BMC, BMH) y se hicieron extracciones de ellas añadiendo 1 mL de los DES por cada 30 mg de material vegetal. La extracción fue en un baño ultrasónico durante 45 min a 45 °C. Se recuperó el sobrenadante por centrifugación y se almacenó a -20 °C hasta su uso.

Condiciones de la fermentación para la extracción de los fitoquímicos

Se pesaron 45 g de cada biomasa y se adicionaron a un fermentador tipo batch, con una solución de melaza de caña a 4 °Brix en agua destilada. Se esterilizó la mezcla en una autoclave a 121 °C durante 15 min. Se inocularon los fermentados con 1 mL de una concentración correspondiente a la escala número 3 de McFarland (9 ×10⁸) de L. plantarum CDBB-B-1115. Se fermentó en una incubadora durante 72 h a 37 °C. Se recuperó el sobrenadante por centrifugación, se liofilizó y almacenó a -20 °C hasta su uso.

Cuantificación de los ácidos fenólicos por UPLC-qTOF-MS²

Los ácidos fenólicos presentes en las biomasas se cuantificaron utilizando un equipo UPLC Acquity H Waters con analizador de masas G2-XS qTof (cuadrupolo y tiempo de vuelo), con un capilar 1.5 KV y cono de muestreo 30 v, con solvatación de 800 (L/h) a una temperatura de 500 °C. La fuente de ionización fue por electrospray (ESI). Se usó una columna Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm, 2.1 × 100 mm, a 40 °C. Las fases móviles utilizadas fueron: A) agua acidificada al 0.1 % con ácido fórmico y B) acetonitrilo, con una elución en gradiente de 95 % de A y 5 % de B con un flujo de 0.3 mL/min y un volumen de inyección de 1 µL (^{Purushothaman & Pemiah, 2014}).

Evaluación antibacteriana y antifúngica in vitro

Se evaluó la actividad antibacteriana de los extractos contra las bacterias Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Xanthomonas vesicatoria y Ralstonia solanacearum. Las bacterias se inocularon en cajas Petri, en tres diferentes tipos de medio de cultivo: agar Mueller-Hinton, agar nutritivo y B de King, respectivamente. Se evaluó la actividad antifúngica de los extractos contra los hongos Fusarium oxysporumf. sp.licopersici, Colletotrichum gloeosporioides, Botrytis cinerea y Alternaria solani, los cuales se inocularon en agar papa dextrosa. Una vez desarrollado cada microorganismo, con una asa estéril se tomó parte del mismo y se depositó en un tubo de ensayo con agua estéril. Se usó la escala de McFarland para ajustar las concentraciones bacterianas a 3×10⁹ UFC y una cámara de Neubauer para ajustar las concentraciones de esporas de los hongos a 1×10⁷.

El reto bacteriano y fúngico consistió en sembrar a los microorganismos en cajas Petri de 90 mm de diámetro con los medios de cultivo respectivos para cada bacteria y hongo. Para esto se depositaron en ellas 10 μL de la solución de 3 x 10⁹ UFC y 1×10⁷ esporas, homogeneizando con perlas de vidrio estériles. Posteriormente se aplicaron 5 µL de los extractos de biomasa en 5 puntos equidistantes de las placas. Las concentraciones evaluadas fueron de 30 mg/mL para los extractos obtenidos con los DES (DES1 y DES2), 700 mg/mL fermentados, 600 mg/mL acuosos. Una vez aplicado el extracto se incubaron durante 72 h a 22 °C. Pasado este tiempo (72 h), se midió el diámetro (mm) de inhibición y se reportó el porcentaje (PI) de inhibición con la fórmula: PI (%) = R1-R2/R1100. Donde R1 = crecimiento del hongo y bacteria sin extracto y R2 = crecimiento del hongo y bacteria en presencia de los extractos. Se usó como control negativo agua destilada y el disolvente DES1. Las evaluaciones se realizaron por triplicado con 5 repeticiones. Los resultados se plasmaron como promedios y desviaciones estándar.

Determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC)

Se eligieron los extractos que presentaron actividad en la etapa anterior y los microorganismos susceptibles. Para esto, se eligieron los extractos obtenidos con el DES1 de las tres biomasas, y se evaluaron frente a F. oxysporumf. sp. lycopersici, C. gloeosporioides, A. solani, C. michiganensis subsp. michiganensis, X. vesicatoria y R. solanacearum. Se estudiaron las concentraciones de 0.5, 1.0, 2.0, 25 y 30 mg/mL. El reto antimicrobiano se realizó con la metodología antes descrita. La MIC se estableció con la concentración que no presentó crecimiento microbiano después de 72 h. Los experimentos se realizaron por triplicado con 5 repeticiones. La MIC se expresó en mg de biomasa / mL de extracto.

Evaluación antifúngica en frutos de papaya (Carica papaya) y de tomate (Solanum lycopersicum)

El experimento se basó en la metodología descrita por ^{Pane, Fratianni, Parisi, Nazzaro & Zaccardelli (2016)}, con ligeras modificaciones. Se evaluaron por separado los extractos de las tres biomasas (BPM, BMH, BMC) obtenidos con el DES1. Las concentraciones estudiadas fueron 25 y 30 mg/mL. Para esto se usaron papayas Maradol y tomates tipo bola en estado de madurez comercial sin defectos mecánicos y/o por plagas. Previo al experimento se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio al 1 %. Se determinaron los puntos de aplicación y se les hizo con una asa estéril una incisión superficial no mayor a 2 mm. Se evaluaron suspensiones de esporas de F. oxysporumf. sp. lycopersici, C. gloeosporioides y A. solani a concentraciones de 1×10⁷ . Los experimentos se realizaron por triplicado con 5 repeticiones.

Los tratamientos evaluados fueron:

Aplicación correctiva: aplicación de 5 µL de suspensión de esporas de cada hongo por separado, se dejó reposar por 2 h, y se aplicó 5 µL de cada uno de los extractos por separado.

Aplicación preventiva: aplicación de 5 µL de los extractos por separado, se dejaron actuar por 2 h y se inocularon 5 µL de las suspensiones de esporas de cada hongo por separado.

Aplicación simultánea: aplicación de 5 µL de una mezcla 1:1 v/v de la suspensión de esporas de los hongos por separado y de los extractos por separado, en concentraciones de 30 mg/mL.

Los frutos se dejaron a humedad relativa de un 80 % y a 25 °C durante 5 d. Se midió el grado de efectividad y progresión del daño cada 24 h. Las observaciones se basaron en el daño causado externa e internamente en ambos tipos de frutos. Se usó como control negativo agua estéril. Los experimentos se realizaron por triplicado con 5 repeticiones.

Evaluación bactericida en plantas de tomate

La evaluación bactericida in vivo se llevó a cabo en plantas de tomate bola variedad Floradade obtenidas a partir de semillas susceptibles a las bacterias mencionadas. Las plántulas se trasplantaron a macetas con tierra estéril. Durante el experimento se fertilizaron vía foliar cada tercer día con urea al 1 % en agua.

Después de 15 d de acondicionamiento en las macetas, se llevó a cabo la inoculación con una suspensión bacteriana a una concentración de 9 ×10⁸ UFC de las bacterias C. michiganensis subsp. michiganensis, X. vesicatoria y R. solanacearum. Previo a la inoculación, con una asa estéril se hicieron incisiones en las axilas de las plantas, no mayores a 2 mm para depositar en ellas 5 µL de la suspensión bacteriana. En el caso de X. vesicatoria, la suspensión se asperjó en la parte área de las plantas, al igual que el extracto y se cubrieron durante 24 h con una bolsa de polietileno de baja densidad, para aumentar la humedad relativa.

El experimento se evaluó mediante una escala de infección-daño, durante 15 y 30 d. Los tratamientos fueron semejantes a los descritos en los incisos 1 (aplicación correctiva), 2 (aplicación preventiva) y 3 (aplicación simultánea). Se usó como control plantas sanas sin extractos y sin bacterias y plantas con bacterias de cada una por separado, sin extractos. Los experimentos se efectuaron por triplicado con 5 repeticiones.

Diseño estadístico

Todos los experimentos se realizaron por triplicado con 5 repeticiones. Las mediciones de la etapa preliminar se contrastaron con un ANOVA y prueba de Tukey al 0.5 %.

Perfil fitoquímico mediante UPLC-qTOF/MS²

Las biomasas de maíz presentaron un contenido significativo de ácidos fenólicos (Figura 1) principalmente de cumárico (236 µg/g de biomasa peso seco). Estos resultados son superiores a los extractos de ensilado de maíz fermentado con Trametes versicolor (ácido ferúlico 3.8 µg/g, ácido caféico 55.7 y ácido siríngico 29.2 µg/g de biomasa peso seco) (^{Bucić-Kojić, Šelo, Zelić, Planinić & Tišma, 2017}). ^{Vázquez-Olivo, López-Martínez, Contreras-Angulo & Heredia (2019)}, identificaron a los ácidos fenólicos cumárico y ferúlico en la biomasa de maíz híbrido. ^{Provan, Scobbie & Chesson (1994)}, extrajeron ácidos hidroxicinámicos de los tallos de maíz, esto mediante extracción asistida de microondas. ^{Đorđević, Sarić & Gajić (2019)}, lograron la extracción de ácido cinámico, p-cumárico y ferúlico de rastrojo de maíz por fermentación; de forma similar ^{Bucić-Kojić et al. (2017)}, extrajeron ácido siríngico, vanílico, p-hidroxibenzóico y ácido cafeico de ensilado de maíz por fermentación en estado sólido.

Figura 1 Estructuras moleculares de los principales ácidos fenólicos identificados en los extractos de las biomasas agrícolas de pimiento morrón ( Capsicum annuum) y maíz (Zea mays). A) ácido clorogénico, b) ácido ferúlico y c) ácido cumárico. 

Por otro lado, en la biomasa de chile predominó el contenido de ácido clorogénico (37.78 ± 2.4 µg/g de biomasa peso seco). Estos resultados concuerdan con lo reportado por ^{Chen & Kang (2013)}, donde lograron cuantificar ácido clorogénico y p-cumárico (3,820 ± 0.13 y 2,980 ± 0.06 µg/g respectivamente) a partir de los extractos metanólicos de los tallos de chile rojo coreano (variedad no especificada). El extracto de BPM fue el más abundante en ácido clorogénico, ácido ferúlico y ácido quínico, a diferencia de los extractos de BMC y de BMH (Tabla I).Llama a la atención que los ácidos fenólicos en su mayoría están presentes en las partes no comestibles del chile. ^{Acero-Ortega et al. (2005)}, cuantificaron concentraciones mayores en los tallos y en las hojas que en los frutos de distintas variedades de chile. ^{Barrajón-Catalán et al. (2020)}, encontraron en un estudio metabolómico la mayor presencia de ácidos fenólicos en las hojas que en los frutos de pimiento morrón cv. Palermo. ^{Chen & Kang (2013)}, mostraron que los tallos de chile rojo de origen coreano (variedad no especificada), presentaron una mayor cantidad de ácido clorogénico que en el pericarpio y en la placenta.

Actividad antifúngica y antibacterial in vitro

Los extractos acuosos (600 mg/mL) de las tres biomasas no presentaron actividad antifúngica ni antibacterial por lo que se descartaron para la determinación de las MIC. Los extractos obtenidos, de las tres biomasas, con el DES2 (30 mg/mL) solo fueron activos contra R. solanacearum, al inhibir 6 mm. La comparación de medias (p < 0.05 %) indicó que el tipo de biomasas no difiere en cuanto a la inhibición de los microorganismos; sin embargo, el método de extracción (DES, fermentación láctica y extractos acuosos), sí fue significativamente diferente. Los extractos con mayor bioactividad contra los microorganismos evaluados fueron los obtenidos con el DES1, seguido de fermentación y por último el DES2.

Las bacterias fueron las más susceptibles a los extractos de las tres biomasas obtenidos con el DES1 (Tabla II). Estos resultados pueden ser por el contenido de ácidos fenólicos (clorogénico, cumárico, ferúlico) y otros metabolitos que los DES extrajeron como los flavonoides, los alcaloides y los terpenos, entre otros compuestos presentes en las biomasas. También la composición del DES1 pudo influir en la actividad, por el predominio del ácido láctico, que ejerce un amplio espectro bactericida (^{Arena et al., 2018}; ^{Scaffaro, Maio & Nostro, 2020}).

Los extractos fermentados, presentaron una menor actividad bactericida, esto porque la capacidad de extracción de los ácidos fenólicos es menor comparada con los DES, ya que estos últimos se caracterizan por su habilidad para deslignificar, al romper los enlaces entre los fitoquímicos y los polímeros presentes en las biomasas, facilitando su liberación (^{Ji, Yu, Yagoub, Chen & Zhou, 2020}; ^{Li et al., 2021}; ^{Sillero, Prado, Welton & Labidi, 2021}).

Respecto a la actividad antifúngica los extractos de las tres biomasas obtenidos con el DES1 fueron los únicos que presentaron inhibición (Tabla II). Se conoce el potencial fungicida de los ácidos fenólicos principalmente del clorogénico (^{Martínez et al., 2017}), ferúlico (^{Martínez-Fraca, de la Torre-Hernández, Meshoulam-Alamilla & Plasencia, 2022}) y cumárico (^{Morales, Mendoza & Cotoras, 2017}). Otras investigaciones han demostrado la diversidad de los fitoquímicos (terpenos, alcaloides, flavonoides, saponinas y esteroles) presentes en las hojas, los tallos y las raíces de los chiles (^{Anaya-Esparza, Mora, Vázquez-Paulino, Ascencio & Villarruel-López, 2021}; ^{Carvalho Lemos, Reimer & Wormit, 2019}) y de los maíces (^{Rouf Shah, Prasad & Kumar, 2016}; ^{Siyuan, Tong & Liu, 2018}), con actividad antifúngica y bactericida (^{Lengai, Muthomi & Mbega, 2020}).

Determinación de la MIC

Las concentraciones de 0.5, 1.0 y 2.0 mg/mL, no inhibieron el crecimiento bacteriano y fúngico. La concentración de 25 mg/mL solo fue efectiva en las bacterias. La concentración de 30 mg/mL inhibió ambos grupos de microorganismos (Tabla III). Sólo se tomaron en cuenta los extractos obtenidos con el DES1, por el efecto observado previamente.

Poco se ha investigado sobre el potencial bioplaguicida de los extractos de los subproductos de chile y de maíz. ^{Games et al. (2013)}, evaluaron los péptidos de la hoja de pimiento morrón contra R. solanacearum y C. michiganensis subsp. michiganensis, A. solani y E. carotovora subsp. carotovora, logrando una disminución de un 40 % con 20 μg de la fracción ultrafiltrada de 10 kDa. Extractos etanólicos ricos en péptidos bioactivos de la raíz de C. annuum mostraron una inhibición del 100 y 44 % contra C. gloesporodioides y C. lindemuthianum respectivamente, esto a una concentración de 1 mg/mL (^{da Silva Pereira et al., 2018}). Los extractos metanólicos de las hojas de C. frutescens inhibieron 17 mm a C. albicans, con una concentración de 5 mg/mL (^{Adepoju, Omotoso, Femi-Adepoju & Karim, 2020}). Los extractos obtenidos con acetona y acetonitrilo de las hojas de C. chinense, inhibieron 13 mm a Aspergillus flavus (^{Gayathri, Gopalakrishnan & Sekar, 2016}). Las saponinas aisladas de las semillas de C. annuum var. acuminatum, evitaron la proliferación de las levaduras (Saccharomyces, Saccharomycoides, Schizosaccharomyces, Kloeckera apiculata) y los hongos (C. albicans, Penicillium expansum, Phoma terrestris, Rhizopus orizea, Trichoderma viride), las MIC menores fueron de 12.5 μg/mL (^{Iorizzi, Lanzotti, Ranalli, De Marino & Zollo, 2002}). Los extractos acuosos de las hojas de chile silvestre (C. annuum) presentaron una inhibición dosis-dependiente de A. alternata, en un 82 % con una dosis de 5 mg/mL. En los extractos de etanol con dosis de 25 mg/mL inhibieron un 53 % la germinación de los conidios (^{Pane et al., 2016}).

Con respecto al uso de los subproductos y/o las biomasas de maíz como bioplaguicidas, se ha observado el efecto inhibitorio de los extractos de estilos y estigmas de maíz indio en A. flavus, A. niger y A. brasiliensis de un 100 % en los tres hongos a una concentración de 0.15 mg/mL (^{Abirami et al., 2021}). Los ácidos fenólicos y sus derivados de los extractos acuosos de las plántulas de maíz, inhibieron el crecimiento de R. solanacearum hasta 22 mm con una concentración de 300 μg/disco, y una MIC de 50 mg/L (^{Guo et al., 2016}). Los extractos acuosos de los tallos de maíz (Pioneer 349), redujeron el crecimiento, en un 45.6 %, de F. monliforme y un 22.5 %, de Gibberella zeae (^{Whitney & Mortimore, 1959}). La zeaoxazolinona que proviene de los extractos metanólicos de las raíces de maíz redujo el crecimiento de A. flavus (31 mm) y de F. oxysporum (21 mm), cantidades superiores al control con clotrimazol, con una dosis de 10 μg/disco (^{Mohamed et al., 2014}). ^{Kalinoski et al. (2020)}, realizaron un estudio de la actividad antimicrobiana de las fracciones lignocelulósicas del rastrojo de maíz, derivadas de una hidrogenólisis de transferencia catalítica en etanol supercrítico catalizado con rutenio C. Las fracciones mostraron actividad antimicrobiana sobre B. subtilis, E. coli, S. cerevisae, S. epidermis y L. amylovorus y el extracto oleoso crudo a una concentración de 4 mg/mL las eliminó un 100 %. Si bien no evaluaron microorganismos fitopatógenos, sí lo hicieron con el rastrojo de maíz como antimicrobiano.

La extracción de fitoquímicos con los DES es una herramienta novedosa para el desarrollo de bioplaguicidas, sin embargo, poco se ha explorado. ^{Utami et al. (2020)}, optimizaron la obtención de papaína con un DES conformado por ChCl/ácido oxálico 3:2 molar. La papaína presentó propiedades insecticidas contra Spodoptera. ^{Guo et al. (2021)}, extrajeron mediante un DES elaborado con ChCl/ácido oxálico 1:1 molar, aceites esenciales de los frutos de Litsea cubeba, que presentaron inhibición contra F. verticillioides (17. 33 mm), B. cinerea (13.50 mm), F. fijikuroi (14.97 mm), Sclerotinia sclerotiorum (10.50 mm) y F. oxysporum (13.77 mm). ^{Rodríguez-Juan et al. (2021)}, evaluaron el efecto antimicrobiano de los DES con diferentes tipos de donadores de enlaces de hidrógeno (sales cuaternarias, azúcares, dioles y ácidos orgánicos). Los DES con azúcares (fructosa, glucosa y sacarosa) fueron los menos bioactivos contra las levaduras y las bacterias (X. campestris, E. amylovora, E. toletana, C. michiganensis subsp michiganensis, C. michiganensis subsp. insidiosus, R. radibacter, P. syringae y P. savastanoi). Los DES elaborados con ChCl, betaína y dioles tuvieron un efecto superior al control (DMSO). La actividad antimicrobiana de los DES depende de la bacteria (Gram negativa o positiva) y de los sustratos que necesite. La composición de los DES puede aumentar la actividad antimicrobiana; los ácidos orgánicos, ChCl, betaína y dioles son ligeramente más bioactivos que los azúcares empleados como HBD (^{Rodríguez-Juan et al., 2021}).

Actividad antifúngica en los frutos de tomate y de papaya

El tratamiento 3 (mezcla de suspensión bacteriana y extracto) mostró un decrecimiento de la enfermedad y desarrollo de los hongos (Figura 2). Se observó un daño físico a causa del DES, debido la presencia de ácido láctico, por lo que se recomienda diluir la concentración y/o cambiar el HBD. En los tratamientos 1 y 2 se observó el desarrollo de la enfermedad y del crecimiento de los hongos. La efectividad in vivo de los extractos sugiere la aplicación en las etapas tempranas de la infección (síntomas), para mitigar el daño. Sin embargo, es necesario continuar el estudio de los mecanismos de acción de los DES cargados de fitoquímicos con otros modelos y concentraciones.

Figura 2 A) Actividad antifúngica de los extractos de biomasa de pimiento morrón ( C. annuum ) y maíz ( Z. mays ) obtenidos con los DES sobre frutos de tomate inoculados con Fusarium oxysporum, Colletotrichum gloesporoides y Alternaria solani. B) Testigos sin tratamiento 

Actividad bactericida en las plantas de tomate

El tratamiento 3 (mezcla de la suspensión bacteriana con el extracto) disminuyó la enfermedad, tanto en C. michiganensis como en R. solanacearum (Figura 3). Cabe mencionar que, en los puntos de aplicación axilar, el extracto secó por completo la zona, y en la parte foliar, para el control de X. vesicatoria, se marchitó de inmediato y también secó por completo la planta, esto debido a la acidez del extracto <1 pH. Por lo que se recomienda diluir y evaluar concentraciones menores a 30 mg/mL o emplear otro donador de enlaces de hidrógeno en la elaboración del DES, como dioles. Una de las ventajas de trabajar con los DES es su biodegradabilidad e inocuidad, por lo que se pueden emplear los extractos crudos en las plantas y/o en los frutos como recubrimientos (^{Thakur, Gupta, Ghosh & Das, 2022}), para evitar operaciones unitarias futuras (concentración, aislamiento, purificación) en comparación con los extractos obtenidos con disolventes orgánicos. Los DES también solubilizan a las moléculas hidrofílicas y a las hidrofóbicas a la vez, lo que aumenta su aplicación y por ser disolventes de diseño, los convierte en una herramienta útil para el desarrollo de bioplaguicidas (^{Mouden et al., 2017}).

Figura 3 A) Actividad antifúngica de los extractos de biomasa de maíz y de chile obtenidos con DES sobre frutos de papaya inoculados con Fusarium oxysporum, Colletotrichum gloesporoides y Alternaria solani . B) Testigos sin tratamiento.