El cuerpo basal: base, transportador y gobernador de la rotación

El cuerpo basal es la primera estructura en ensamblarse, además de ser el cimiento o base del rotor, que lo ancla a la envoltura celular, está involucrado activamente en el transporte de los componentes axiales del flagelo, así como en la rotación y en el cambio de dirección.

El cuerpo basal está compuesto por el eje que es un tubo que recorre la envoltura celular y al que se añaden una serie de anillos. El primero de ellos es el anillo C que se encuentra en el citoplasma de la bacteria, seguido por el anillo MS, embebido en la MI, y los anillos P y L, localizados a la altura del periplasma y de la ME respectivamente. Finalmente, en el citoplasma dentro del anillo C se localiza el sistema de secreción tipo 3 flagelar (fT3SS). Este último formado por una compuerta, embebida en la MI y con una porción citoplásmica que forma la plataforma de anclaje del último componente del fT3SS, el complejo ATPasa (Figura 1).

La biogénesis flagelar en Salmonella comienza en la MI con el ensamblaje de la compuerta de exportación del fT3SS. El componente transmembranal de la compuerta está formado por cinco subunidades de FliP, cuatro de FliQ, una subunidad de FliR y FlhB, nueve subunidades de FlhA (FliP5Q4R-FlhB-FlhA9) y, FliO. Esta última es indispensable para su ensamblaje, pero no forma parte de la estructura final (^{Fabiani et al., 2017}).

Inicialmente, FliO trabaja como chaperona que facilita la oligomerización del pentámero de FliP. A este complejo se une una subunidad de FliR formando así un pseudo hexámero, y en la parte externa de este último complejo se unen 4 subunidades de FliQ (^{Tan et al., 2021}; ^{Fabiani et al., 2017}; ^{Fukumura et al., 2017}). Es en este momento que FlhB se une y da paso a la unión de un anillo formado por 9 subunidades de FlhA. Es entonces cuando FliO se libera y concluye la formación de la compuerta de exportación del f3TSS (^{Milne-Davies, Wimmi & Diepold, 2021}; ^{Kuhlen et al., 2018}).

Posteriormente rodeando a la compuerta del sistema de secreción se ensambla el anillo MS. Este anillo, predominantemente periplásmico, está formado por una única proteína, FliF, que se ancla a la MI mediante dos hélices transmembranales ubicadas en su extremo amino y cerca del carboxilo terminal (^{Ueno, Oosawa & Aizawa, 1992}). FliF, forma un anillo de dos niveles, de simetría interna mixta, lo que en un inicio hizo suponer que el anillo MS estaba formado por dos anillos distintos (^{DePamphilis & Adler, 1971}). Además, también se pensó que FliF tenía una estequiometría de 23 subunidades (^{Ueno et al., 1992}), sin embargo, las observaciones por cryo-ET, revelaron que está formado por un único anillo de dos niveles de 34 subunidades de FliF. Al exportarse, plegarse e insertarse en la MI, FliF ensambla en un inicio, una estructura en forma de anillo conformado por 34 subunidades denominado cuello. A continuación, en la región más proximal a la MI e insertada en ella continúa la formación del anillo MS donde las 34 subunidades se distribuyen formado un anillo de 23 subunidades centrales y 11 subunidades extendidas hacia la cara externa del anillo lo que explica lo observado previamente (^{Mariano et al., 2022}; ^{Johnson et al., 2020}). Es el proceso de plegamiento de FliF lo que permite la formación de este anillo. FliF está formada por tres dominios globulares denominados RBM1, 2 y 3 (dominios de construcción de anillos, RBM) (^{Bergeron, 2016}). El plegamiento del anillo MS comienza con la secreción vía SEC de los dominios RBM1 y 2. La interacción entre ambos dominios mantiene el estado monomérico de FliF. A continuación, el dominio RBM3 se secreta y se pliega formando el cuello del anillo MS con simetría de 34 subunidades. Entonces, RBM 2 se pliega para formar un anillo de simetría de 23 subunidades (^{Johnson et al., 2020}). El plegamiento de RBM2, es dirigido por la oligomerización inicial de RBM3, lo que deja 11 subunidades de estos dominios hacia el exterior, manteniendo una simetría de 34 subunidades en la región de interacción con el anillo C. Los dominios RBM1 y 2 en conjunto se terminan de plegar y aparentan un segundo anillo que contactan con el aparato de secreción. La región carboxilo de FliF contacta directamente con el anillo C (^{Mariano et al., 2022}; ^{Kawamoto et al., 2021}; ^{Takekawa et al., 2021}; ^{Johnson et al., 2020}).

El anillo C controla el cambio de dirección de rotación del flagelo y la generación del torque. Es necesario para la conclusión del ensamblaje y función del f3TSS y participa en el transporte de los componentes axiales del flagelo. En Salmonella este anillo es una estructura cilíndrica citoplásmica de 45nm de diámetro y 15nm de alto (Figura 1). Está formado por 34 subunidades de FliG y FliM, y 102 subunidades de FliN (^{Francis, Sosinsky, Thomas & DeRosier, 1994}). En la biogénesis flagelar el anillo C es el siguiente en ensamblarse, se ancla al anillo MS mediante la interacción del carboxilo terminal de FliF con FliG que se divide en tres regiones: la región amino terminal que se une directamente al anillo MS (^{Xue et al., 2018}; ^{Lynch et al., 2017}); la región media que interactúa con FliM (^{Paul, Brunstetter, Titen & Blair, 2011}); y la región carboxilo terminal que interactúa con el estator (MotA directamente, ver más adelante). A FliM se une FliN en una relación de 1:3, que, a su vez, interactúa con FliH que es parte del complejo ATPasa (ver más adelante) (^{McMurry, Murphy & González-Pedrajo, 2006}).

A continuación, justo por encima del anillo MS se ensambla FliE que forma una zona de transición entre la compuerta del aparato de secreción, el anillo MS y el eje. Seis subunidades de FliE se ensamblan por encima de FliR y FliP. La hélice α1 de FliE se une a la superficie interna del anillo MS, mientras que el dominio D0 de esta misma proteína interactúa con FliP, FliR, FlgB y FlgC promoviendo el ensamblaje de FliE en forma de tubo, lo que resulta indispensable para la apertura eficiente de la puerta de salida de las proteínas del canal de exportación del f3TSS (^{Hendriksen et al., 2021}).

El eje es una estructura tubular, recta y rígida que se forma en el espacio periplásmico y atraviesa la pared de peptidoglicanos y la ME. La región proximal del eje se ensambla de forma secuencial por FlgB, FlgC y FlgF, con una estequiometría de 5:6:5. En la región distal se incorporan progresivamente 24 subunidades de FlgG que presentan tres estados conformacionales distintos (^{Tan et al., 2021}; ^{Johnson et al., 2021}).

Actuando como rodamientos, para disminuir la fricción de rotación del eje se encuentran los anillos P y L, que se ensamblan de forma simultánea y sincronizada con la síntesis del eje en el periplasma, atravesando la pared de peptidoglicanos y la ME respectivamente (Figura 1). A diferencia de los componentes axiales, las proteínas necesarias para la formación de estos anillos se secretan vía el sistema SEC de la bacteria (^{Jones, Momma & Macnab, 1989}).

Los anillos P y L están formados, cada uno, por 26 subunidades de las proteínas FlgI y FlgH respectivamente. Las visualizaciones, por cryo-EM, de estos anillos sugieren que la función de disminución de la fricción, cuando rota el eje, se da por dos acciones: la primera, por el anillo P y su interacción mediante puentes de hidrógeno con regiones conservadas de FlgF y FlgG que centran y estabilizan al eje con respecto al rodamiento, la segunda, gracias a la zona de repulsión electrostática entre el anillo L y el eje distal, que permite la rotación a altas velocidades y la eficiente transmisión del torque (^{Tan et al., 2021}). Para la correcta posición y ensamblaje el anillo P requiere de la chaperona FlgA (^{Nambu & Kutsukake, 2000}), mientras que el anillo L depende de la correcta formación de éste último anillo y de la proteína FlgJ. FlgJ es una proteína de dos dominios funcionales: el extremo N-terminal actúa como una proteína de andamiaje esencial para el ensamblaje del eje y el dominio C-terminal tiene función de muraminidasa que degrada la pared de peptidoglicanos para permitir su paso (^{Zaloba, Bailey-Elkin, Derksen & Mark, 2016}).

FlgJ con FlgH y FlgG, forman parte del mecanismo de control que permite la continuidad del proceso de ensamblaje del flagelo a nivel de la transición eje-gancho, sincronizando la formación del poro en la ME, en el lugar donde se encuentra creciendo el eje, con su paso a través de la ME y el cambio en la especificidad de sustratos exportados por el fT3SS, cambiando de FlgG, proteína distal del eje, a las proteínas que forman el gancho. Es indispensable la correcta formación del anillo L (FlgH) para permitir el paso del eje (FlgG) a través del poro en la ME. Sin embargo, no es hasta que FlgG y su chaperona FlgJ, son capaces de contactar con FlgH, que, por un mecanismo aún no descrito del todo, se libera a FlgJ al espacio extracelular y esto permite que la proteína FlgD (proteína de andamiaje) se ensamble e inicie la formación del gancho (^{Cohen & Hughes, 2014}).

Exportación

El transporte activo de los componentes que forman el eje, el gancho y el filamento a través de la envoltura celular requiere tanto del ATP, como de la fuerza protón motriz del potencial de la membrana (FPM) (^{Minamino & Namba, 2008}; ^{Paul. Erhardt, Hirano, Blair & Hughes, 2008}).

La compuerta transmembranal del fT3SS formada, por FlhAB-FliPQR, como se mencionó, utiliza la FPM como fuente de energía para desdoblar y translocar a los sustratos a través de la membrana citoplasmática (^{Paul et al., 2008}). El último componente de la compuerta del aparato de secreción en ensamblarse es FlhA cuya porción citoplásmica constituye la plataforma de unión del complejo ATPasa que se ensambla dentro del anillo C y constituye la región citoplásmica del fT3SS. Anclado a los extremos C-terminal de FlhA y FlhB se asocia el complejo ATPasa. Este complejo está formado por un anillo hexamérico de FliI (la ATPasa), una subunidad de FliJ y doce subunidades de FliH. La asociación de FliH con las proteínas FliN del anillo C mantienen al anillo de FliI en la base del aparato de exportación y a la proteína FliJ, localizada en el centro del anillo de FliI, en forma de tallo, interactuando con FlhA (^{Minamino Kinoshita & Namba, 2022a}; ^{Minamino, Kinoshita, Inoue, Kitao &Namba, 2022b}). La interacción entre FliJ y FlhA es indispensable para la activación de la compuerta de exportación (^{Minamino, Morimoto, Hara & Namba, 2011}).

Los sustratos transportados a través del f3TSS se dividen en dos clases: tempranos, los que forman al eje y al gancho (FliE, FlgBCFG y FlgE), y tardíos, requeridos para la formación del filamento (FlgKL, FliC y FliD). Los primeros no necesitan de chaperonas específicas, mientras que los segundos sí (^{Minamino et al., 2022b}). Las proteínas FlgN, FliS y FliT, chaperonas de FlgK-FlgL, FliC y FliD respectivamente (ver más adelante) actúan de forma sustrato-específico, no sólo para proteger al sustrato de la degradación y de la agregación en el citoplasma, sino también para la transferencia eficiente de sus sustratos al fT3SS y su posterior transporte en conformación extendida por el estrecho poro de la compuerta de exportación de tan solo 2nm de diámetro (^{Minamino et al., 2022b}).

En un inicio los complejos chaperona-sustrato se anclan a FliI (ATPasa) para posteriormente interactuar con FlhA, momento en el que la chaperona se libera y la subunidad entregada se despliega para ser transportada, proceso que requiere de la hidrólisis de ATP (^{Bange et al., 2010}).

La especificidad del sustrato del fT3SS se da gracias a FlhA y FlhB. FlhA es una proteína compuesta por dos dominios: el amino terminal embebido en la MI rodeando a la compuerta de exportación del sistema de secreción, y un dominio carboxilo terminal citoplásmico que forma la plataforma de anclaje de la ATPasa. Estos dos dominios están unidos por una porción flexible (linker) que interactúa con FliJ y activa el canal iónico de la región transmembranal de FlhA lo que permite que la compuerta de exportación acople el flujo de iones con la translocación de los sustratos a través de la membrana, y suma a la FPM al proceso de exportación (^{Abrusci et al., 2013}). El motivo GYXLI de FlhA permite el paso de complejo cerrado a complejo abierto para un mecanismo eficiente y robusto de emparejamiento de energía del sistema de secreción (^{Minamino et al., 2022a}). FlhB funciona como el interruptor del cambio de especificidad en el sustrato reconocido por el fT3SS, al sufrir un corte autocatalítico entre Asn269 y Pro270, localizados en el motivo NPTH indispensable para este procesamiento. Cuando el gancho llega a la longitud específica de 55nm, el aparato de secreción, mediante la interacción entre FliK con FlgD, FlgE y FlhB, termina la exportación de los componentes del gancho para comenzar a exportar los componentes del filamento. La interacción entre FliK y la forma proteolizada de FlhB inducen un cambio estructural en FlhA que da lugar al cambio de especificidad del fT3SS (^{Inoue et al., 2019}).

Además de su papel en el transporte de las proteínas, el cuerpo basal también se relaciona con la rotación y el cambio de dirección del motor flagelar, que será discutido con detalle en la sección del estator. La rotación del flagelo se da gracias a la interacción de FliG con el asa citoplásmica de MotA, lo que permite la traducción del FPM en fuerza mecánica generando así la rotación del rotor.

El gancho, la junta universal transmisora del torque

Justo por encima del eje, se ensambla el gancho, también denominada, junta universal. El gancho tiene dos grandes funciones, une y transmite la rotación del cuerpo basal al filamento. Es una estructura tubular curva y helicoidal, que es flexible cuando se dobla, pero rígida ante las fuerzas de torsión. Estas características mecánicas permiten la transmisión del torque generado por el motor y la formación de la trenza de los filamentos en las bacterias peritricas como Salmonella y E. coli (^{Nord et al., 2022}; ^{Samatey et al., 2004}).

El gancho, de 15nm de ancho y 55 de largo, está formado por 120 subunidades de la proteína FlgE (Figura 1) (^{Jones, Macnab, Okino & Aizawa, 1990}) que se ensamblan en 11 protofilamentos.

FlgE de Salmonella consta de cuatro dominios D0, D1, D2 y Dc, este último conecta los dominios D0 y D1. Los dominios D0 y D1 se ensamblan formando el canal interno del gancho y el dominio D2 queda expuesto en la cara externa de esta estructura. Este último dominio es el de mayor variabilidad entre las bacterias. El dominio de conexión está involucrado en las interacciones intramoleculares que estabilizan la estructura tubular del gancho al mismo tiempo que mantienen su flexibilidad. Se ha planteado que la diferencia de la rigidez entre el gancho y el eje reside en el cambio de tamaño que este dominio presenta en las proteínas FlgG y FlgE (^{Horváth, Kato Miyata & Namba, 2019}).

El ensamblaje de FlgE sucede una vez que se concluye el del eje distal (FlgG) y el del anillo L (FlgH), con la ayuda de FlgJ. Para el ensamblaje del gancho es indispensable la presencia de FlgD, que es su proteína de andamiaje, la cual dirige el ensamblaje de FlgE en la punta creciente del gancho, una subunidad a la vez (^{Ohnishi, Ohto, Aizawa, Macnab & Iino, 1994}). El tamaño del gancho está fina y estrictamente regulado por un mecanismo dependiente de FliK y de la autoproteólisis de FlhB, que aún no está descrito del todo y en el cual existe cierta controversia. Durante el ensamblaje del gancho, FliK se secreta, ocasionalmente, para medir la longitud ensamblada del gancho hasta ese momento, actuando como una regla molecular, mecanismo que permite la regulación estricta de su longitud (^{Hirano, Yamaguchi, Oosawa & Aizawa, 1994}). Cuando el gancho llega al tamaño específico (55 nm), la autoproteólisis de FlhB en el motivo NPTH, cambia la especificidad de los sustratos secretados por el fT3SS. Este deja de exportar componentes del gancho para secretar los del filamento (^{Minamino, Inoue, Kinoshita & Namba, 2019}). Se reemplaza a FlgD por las proteínas asociadas al gancho, HAP, HAP1 (FlgK) y HAP3 (FlgL) y posteriormente la proteína de andamiaje de la flagelina, FliD (HAP2) (^{Ikeda, Homma, Iino, Asakura & Kamiya, 1987}). Justo debajo de FliD se comienza a ensamblar el filamento. FlgK y FlgL forman una zona de transición entre el gancho y el filamento que es posible detectar en las micrografías como una zona adelgazada (Ikeda et al., 1987). Se ha demostrado que HAP3 es la proteína que se encuentra en contacto directo con la flagelina y es importante para controlar las transiciones polimórficas del filamento generadas por la rotación (^{Fahrner, Block, Krishnaswamy, Parkinson & Berg, 1994}). Esta evidencia hace pensar que la estabilidad mecánica del filamento depende, en parte, de la estructura de las proteínas con las que se encuentra anclada.

El filamento, más que una propela

El último elemento del rotor que se ensambla es el filamento, la subestructura más axial del motor flagelar. Puede llegar a medir hasta 15μm de largo y está formado por miles de subunidades (~30,000) de una sola proteína, la flagelina.

El filamento es una estructura rígida, de forma helicoidal, que al rotar desplaza el líquido permitiendo el desplazamiento de la célula. Esta hélice es capaz de pasar por transiciones polimórficas inducidas por la fuerza de giro aplicada por la base del motor. Una característica de la flagelina es su capacidad de autoensamblarse in vitro, formando una estructura tubular que consta de 11 protofilamentos que forman el filamento (^{Yonekura, Maki-Yonekura & Namba, 2003}; ^{Namba, Yamashita & Vonderviszt, 1989}). La flagelina posee 4 dominios y dos regiones de alta conservación en el N-terminal y el C-terminal que abarcan aproximadamente 250 aminoácidos (^{Beatson, Minamino & Pallen, 2006}). Estas dos regiones forman los dominios D0 y D1 que se ensamblan formando el poro interno del filamento, y presumiblemente son los responsables de conferirle la capacidad de autoensamblaje al filamento. También se sabe que ahí residen los residuos importantes para las transiciones polimórficas. Los siguientes dos dominios, D2 y D3, se encuentran en la cara externa del filamento.

El estator, nuevo paradigma de funcionamiento y diversidad

El estator en E. coli y Salmonella es la última estructura del motor flagelar en ensamblarse y es el responsable de generar la fuerza de rotación del rotor. Recientemente fue posible visualizar los estatores, por medio de cryo-EM y cryo-ET, que han revelado los detalles estructurales de los complejos estatores y de los mecanismos que dan lugar a la generación del torque y del trabajo dinámico que en conjunto permiten la rotación del flagelo. Esto ha llevado al campo a un cambio de paradigma en el entendimiento de la función del rotor.

La fuerza de rotación o torque del motor flagelar es generada por el potencial electroquímico de iones específicos en su paso a través de la membrana citoplasmática. El complejo responsable de la generación del torque está formado por las proteínas MotA y MotB. MotA es una proteína con cuatro HTM y un asa citoplásmica grande entre los cruces 2 y 3. Por otro lado, MotB posee una HTM y en su región periplásmica tiene una región que funciona como tapón molecular (Plug), una región flexible (linker) y un dominio de unión a la pared de peptidoglicano. En conjunto MotA y MotB forman una unidad de estator, que, ahora se sabe, forman complejos con estequiometría 5:2 que se agrupan alrededor del cuerpo basal para generar la fuerza de rotación (^{Deme et al., 2020}; ^{Santiveri et al., 2020}). Estos complejos estatores difunden libremente en la MI de la bacteria. Para ser reclutados y activados en la base del rotor se requiere que el dominio de unión a la pared de peptidoglicanos de MotB se anclen a ella. De esta forma, los complejos pueden funcionar como estatores del motor al estar anclados a la envoltura celular (^{Mot & Vanderleyden, 1994}; ^{Chun & Parkinson, 1988}). En E. coli la región del plug de MotB está formada por una hélice anfipática que sirve como una puerta que regula el paso de los protones a través de los canales del estator según se encuentre cerca de la MI o desplegada hacia el periplasma (^{Hosking, Vogt, Bakker & Manson, 2006}). Los estatores acoplan el paso de los iones a través de la membrana con la rotación del motor (^{Zhou, Lloyd & Blair, 1998}). La fuerza es generada por el paso de los protones a través de un canal formado por las HTM 3 y 4 de MotA y la HTM de MotB. Cada complejo estator tiene dos canales por los que se pueden transportar los iones. El aminoácido Asp33 de la HTM de MotB media la unión de protones en su paso por el canal. Este paso induce un cambio conformacional en el asa citoplasmática de MotA, que mantiene interacciones electrostáticas con una región de FliG, componente del anillo C. La dinámica de estas interacciones provee la fuerza que hace girar al motor. El complejo de 5 subunidades de MotA rodea al dímero de MotB y gira con respecto a este y a su vez la rotación de MotA hace girar al anillo C, de manera similar a los engranajes de un reloj (^{Deme et al., 2020}; ^{Santiveri et al., 2020}). El cambio de dirección de la rotación se da cuando FliG cambia de conformación, haciendo que, en lugar de contactar al cono de MotA por la parte interna del anillo C, esta interacción se dé por la parte externa (^{Chang, Carroll & Liu, 2021a}). Así ahora sabemos que el motor flagelar rota gracias a una serie de engranes rotatorios más pequeños que lo rodean.

Estudios de restitución de los motores flagelares, donde las células ancladas por el filamento eran depletadas de estatores, para a continuación inducir la expresión de novo poco a poco de estos, mostraron que la rotación del motor se da mediante una serie de incrementos precisos en la velocidad de rotación. Esto llevó a la conclusión de que cada complejo MotAB da una cantidad fija de torque al rotor y que los incrementos precisos en la velocidad de rotación están dados por el número de estatores funcionales unidos al flagelo, por lo tanto, la fuerza de rotación máxima del flagelo es generada por el número total de complejos asociados al rotor (^{Block & Berg, 1984}). Los primeros análisis de microscopía electrónica por fractura de congelación de flagelos embebidos en la membrana plasmática en Salmonella mostraron que los estatores se encuentran acomodados alrededor del cuerpo basal en números de entre 11 y 12 en cada motor (^{Khan, Dapice & Reese, 1988}). Los estatores inactivos se encuentran en la membrana plasmática en conformación cerrada, como poza de reserva, y entran y salen de la base del flagelo según se requiera una mayor fuerza de torque, como cuando aumenta la viscosidad del medio. Al reclutarse hacia al cuerpo basal, los complejos estatores se asocian al rotor, se fijan a la pared de peptidoglicanos y abren los canales para el paso de los iones, para lo que requieren, en parte, de su interacción con el anillo P (^{Homma & Kojima, 2022}). Visualizaciones más recientes de los motores flagelares de estas mismas bacterias por cryo-EM no mostraron la localización de los complejos estatores en la base del flagelo, a diferencia de lo observado para otras especies (ver más adelante), por lo que se estableció la hipótesis de que esto podría ser por la alta tasa de movilidad de estos complejos.

Ausencia y sustitución de los anillos L y P

Como se mencionó, los anillos L y P disminuyen la fricción de rotación del eje flagelar (Figura 2A). Aunque en las bacterias Gram-positivas como B. subtilis, que carecen de ME, estos anillos no están presentes, y no ha sido descrita ninguna otra estructura que cumpla con esta función, tal vez debido a que la fricción en la pared no sea tan elevada como en el periplasma y la ME (Figura 2B) (^{Depamphilis & Adler, 1971}).

Figura 2 Variaciones sobre la estructura Flagelar. Modelos estructurales de los flagelos de las especies bacterianas descritas en esta revisión que muestran las diferencias entre ellos: A) E coli, estructura del núcleo estructural flagelar conservado (NEFC); B) B. subtilis , señala ausencia de la membrana externa, una pared de peptidoglicanos más robusta y la ausencia de los anillos L y P; C) V. alginolyticus , se resalta la presencia de los anillos H y T cubriendo a los anillos P y L; D) C. jejuni , que muestra la localización del disco basal formado por los discos distal, medial y proximal, aumento en el diámetro del anillo C e incremento en el ancho del gancho; E) B. burgdorferi , donde se indica la localización de la estructura del cuello que rodea al eje, el aumento en el diámetro del anillo C y el recubrimiento del filamento; F) R. sphaeroides , donde se observa el gancho recto, la protuberancia en la zona entre el gancho y el filamento y la localización del anillo H. Se indican las proteínas que forman las estructuras, el signo de interrogación (?) significa la posibilidad de que estas estructuras estén formadas por más proteínas que las descritas en la actualidad. Se muestran las medidas de las variaciones que presentan las estructuras en los diversos modelos bacterianos. 

En las espiroquetas como B. burgdorferi, que tienen flagelos periplásmicos, sólo se encuentra presente el anillo P y su ensamblaje no es esencial para la rotación flagelar (^{Liu et al., 2009}). En este caso, la reducción de la fricción podría atribuirse a la estructura llamada cuello que cubre la región del eje y parte del anillo P, no obstante, en estas bacterias el papel del cuello no solo es necesario para reclutar a los estatores, sino también para mantener la orientación de los flagelos en el periplasma y el control de la morfología de las células (^{Chang, Motaleb & Liu, 2021b}) (Figura 2E).

Aumento en el diámetro del anillo C

El análisis de ε-proteobacterias como C. jejuni, por cryo-ET muestra un aumento del diámetro del anillo C hasta los 60 nm en comparación con los 45 nm que presenta el de Salmonella (^{Beeby et al., 2016}; ^{Francis et al., 1994}). De acuerdo con lo descrito, FliN es indispensable para la unión de FliH. En bacterias como B. subtilis, FliY sustituye a FliN en el anillo C y son mutuamente excluyentes (^{Ward et al., 2018}). Sin embargo, en C. jejuni y otras ε-proteobacterias, ambas proteínas se conservan y se ensamblan en el anillo C lo que aumenta su diámetro (Figura 2D). Este aumento, da lugar a un área de anclaje mayor para los estatores que se traduce en el incremento del torque producido por la rotación flagelar en las ε-proteobacterias (^{Henderson et al., 2020}).

El aumento en el diámetro del anillo C también se ha descrito para espiroquetas como B. burgdorferi donde el anillo C mide 54 nm (Figura 2E) (^{Chen et al., 2011}). La razón molecular de ésta variación no se ha descrito hasta el momento, pero se sabe que la carga del motor en las espiroquetas es muy alta por lo que el aumento en el diámetro del anillo C puede estar relacionado con la fuerza que el motor soporta para su mejor desempeño.

Ensamblaje entre el eje y el gancho

Otra función de los anillos L y P es facilitar la biogénesis flagelar al dirigir el paso del eje a través de las diferentes capas de la envoltura celular. Datos que apoyan esta hipótesis muestran la importancia de FlgH y FlgJ como punto de control del paso de ensamblaje entre el eje y el gancho en las bacterias Gram-negativas, como antes se presentó. El arreglo de dos dominios de FlgJ descrito en Salmonella resulta ser poco usual entre las bacterias flageladas. El trabajo de ^{Pallen et al. (2005)} sobre la conservación de las proteínas flagelares en diversos phyla indica que lo más común entre bacterias flageladas es la separación de ambos dominios en proteínas distintas.

Por ejemplo, en R. sphaeroides FlgJ sólo presenta el dominio de chaperona y requiere de la transglicosilasa lítica SltF para la formación del eje en su paso por la pared de peptidoglicanos. Ambas proteínas están codificadas dentro del cluster flagelar lo cual sincroniza su expresión con la biogénesis. La interacción de SltF con FlgJ y las proteínas del eje, dirigen a SltF al lugar específico de la síntesis del flagelo donde la hidrólisis de la pared es requerida (^{García-Ramos, Mora, Ballado, Camarena & Dreyfus, 2021}; ^{Mora, Ballado, González-Pedrajo, Camarena & Dreyfus, 2007}; ^{González-Pedrajo, Mora, Ballado, Camarena & Dreyfus, 2002}). También en B. burgdorferi, recientemente se describió la glucosaminidasa específica indispensable para la biogénesis de su motor flagelar, LTasaBb, sin la cual la progresión eje-gancho no sucede (^{Xu, Hu, Flesher, Liu & Motaleb, 2021}). La variabilidad en la composición de la pared de las bacterias entre phyla podría explicar la separación de las funciones dada la necesidad de diferentes enzimas capaces de degradar la pared de peptidoglicanos dependiendo de la especie. De hecho, un análisis filogenético de FlgJ ha mostrado que la hipótesis más plausible es que en E. coli y en Salmonella se hayan fusionado ambos dominios dando lugar a FlgJ (^{Pallen et al., 2005}).

Tamaño, forma y características físicas del gancho

En las espiroquetas como B. burgdorferi o Treponema denticola, los ganchos están formados por subunidades de FlgE unidas covalentemente (Figura 2E). Esto es gracias a la presencia de un dominio autocatalítico codificado dentro de la secuencia de FlgE, que añade estabilidad a esta estructura (^{Miller et al., 2016}). Los motores flagelares de las espiroquetas son enteramente periplásmicos y se enrollan en el cuerpo de la bacteria uniéndose entre sí, lo que les confiere una morfología característica en espiral. La alta torsión del gancho, así como la fuerza para mover y cambiar la forma del cuerpo de la bacteria, hace que los ganchos de las espiroquetas estén sujetos a una fuerza de torque mayor que otras especies.

C. jejuni posee ganchos de 25 nm de ancho, en comparación con el de Salmonella de 18 nm (Figura 2D) (^{Fujii, Kato & Namba, 2009}). La proteína FlgE de esta bacteria posee dos dominios extras D3 y D4, lo que aumentan su tamaño en cerca de 900 aminoácidos (aa) e incrementa las interacciones entre las subunidades de FlgE que da como resultado ganchos más robustos. Mutantes deficientes en estos dominios producen ganchos frágiles (^{Matsunami, Barker, Yoon, Wolf & Samatey, 2016}; ^{Yoon, Baker, Bulieris, Matsunami & Samatey, 2016}). El torque en C. jejuni es mayor al de Salmonella, y es probable que un gancho con un diámetro mayor le ayude a sobrellevar el aumento de la fuerza de torque.

En el flagelo subpolar de R. sphaeroides se observa que el gancho es recto. La eliminación de una región rica en prolinas cerca del amino terminal de FlgE, resulta en ganchos curvos que reducen la capacidad de nado de esta bacteria (Figura 2F) (^{Ballado, Camarena, González-Pedrajo, Silva-Herzog & Dreyfus, 2001}; ^{González-Pedrajo et al., 1997}). Se sabe que FlgG y FlgE de Salmonella tienen un alto grado de identidad de un 39%, pero las estructuras que forman estas proteínas, el eje y el gancho respectivamente, poseen propiedades mecánicas distintas, el eje es recto y rígido, mientras que el gancho es curvo y flexible al doblarse. Las diferencias mecánicas de estas dos estructuras están dadas tan solo por diferencias sutiles en la orientación y la interacción entre sus subunidades (^{Fujii et al., 2017}). En esta misma bacteria se ha demostrado que en el extremo N-terminal de FlgG, formado por 18 residuos, se localiza el motivo GSS (secuencia específica de FlgG) que se encuentra ausente en FlgE y que al ser introducido a esta proteína produce ganchos rectos (^{Hiraoka et al., 2017}). En el caso de Salmonella, lo mencionado impide la formación de la trenza y reduce la capacidad de nado de la bacteria. En R. sphaeroides, al ser una bacteria monotrica, con un patrón de rotación de giro y paro, la estructura recta favorecería la transmisión de la fuerza en una sola dirección perpendicular al cuerpo de la bacteria. En esta misma bacteria la interfase entre el gancho y el filamento, dada por la proteína FlgK (HAP1), es fácilmente visible, en las micrografías electrónicas, como una protuberancia entre el gancho y el filamento (Figura 2F) (^{Kobayashi et al., 2003}; ^{West & Dreyfus, 1997}). La razón de esta protuberancia se debe a que FlgK es tres veces más grande que la de Salmonella. Las regiones N- y C-terminal de la proteína están conservadas pero la región central tiene una inserción de lo que parecen ser duplicaciones de regiones repetidas. La presencia de esta región es importante para el correcto desplazamiento de las células (^{González-Pedrajo et al., 2002}; ^{Castillo, Ballado, Camarena & Dreyfus, 2009}). Dado que, tanto la curvatura como las interacciones entre los componentes del flagelo son importantes para la transferencia del torque, es posible que las modificaciones que presenta R. sphaeroides a nivel del gancho permitan que sea más eficiente la transmisión de la fuerza del torque al filamento en esta bacteria.

Filamentos diversos en tamaño y función

La flagelina es una proteína que presenta una amplia variabilidad entre especies. Su peso molecular en Salmonella es de 51kDa mientras que en especies como Bermanella marisrubri es de 120kDa (^{Thomson et al., 2018a}). Los dominios D2 y D3 son los que le confieren la alta variabilidad, estos pueden variar en tamaño de muy pequeños como es el caso de B. subtilis (50 aa, aproximadamente) hasta más de 700 aa en el caso de Oleibacter marinus (^{Thomson, Ferreira, Matthews-Palmer, Beeby & Pallen, 2018a}; ^{Thomson, Rossmann, Ferreira, Matthews-Palmer, Beeby & Pallen, 2018b}). En esta y otras γ-proteobacterias marinas se ha descrito una inserción entre los dominios D2 y D3 debida a una duplicación y una posterior inserción de un dominio de función desconocida que da como resultado una flagelina de más de 1000 aa. Estas flagelinas gigantes al incorporarse en el filamento hacen que la estructura sea un 25% más ancha (^{Thomson et al., 2018a}; ^2018b).

Anteriormente se pensó que la variabilidad en el tamaño de las flagelinas sólo confería a la bacteria mejores capacidades físicas, es decir, más resistencia en ambientes altamente viscosos o que permitía la modificación de la curvatura de la hélice para un desplazamiento más eficaz (^{Thomson et al., 2018a}). Sin embargo, un estudio sobre las características de las regiones variables de la flagelina mostró que se encuentran hasta 61 dominios distintos en esta región, entre los que destacan dominios con actividades enzimáticas como peptidasas, colagenasas o metaloproteasas. En específico la secuencia de la flagelina de Clostridum haemolyticum presenta codificada en su región variable una metaloproteasa dependiente de zinc. Esta flagelina se ensambla en el filamento y presenta actividad enzimática de metaloproteasa (^{Eckhard et al., 2017}). Por lo tanto, aunque hay casos en los que el aumento del tamaño de la flagelina confiere mejores propiedades físicas al filamento, hay casos donde estas inserciones confieren al filamento funciones adicionales, tal vez degradando compuestos complejos para su asimilación o como una forma de defensa ante las respuestas inmunológicas de algunos eucariontes (^{Eckhard et al., 2017}).

Filamentos flagelares formados por más de un tipo de flagelina

Existen bacterias como Vibrio cholerae, Rhizobium lupini, Sinorhizobium meliloti, Caulobacter crescentus, o Agrobacterium tumefaciens, que a diferencia de E. coli, poseen diferentes tipos de flagelina (^{Faulds-Pain et al., 2011}; ^{Scharf, Schuster-Wolff-Buhring, Rachel & Schmitt, 2001}; ^{Deakin et al., 1999}; ^{Klose & Mekalanos, 1998}; ^{Pleier & Schmitt, 1989}). En un principio parecía un hallazgo excepcional pero el análisis de 607 genomas bacterianos muestra que al menos el 45% de las bacterias con potencial para ensamblar un filamento funcional codifican para más de una flagelina (^{Faulds-Pain et al., 2011}). Por ejemplo, C. crescentus posee 6 genes que codifican para flagelina. Todas ellas forman parte estructural del filamento y son ensambladas en un orden específico. La pérdida de alguna de ellas produce filamentos cortos o que presentan hélices alteradas, estas modificaciones tienen un efecto negativo sobre la velocidad de desplazamiento de la bacteria (^{Faulds-Pain et al., 2011}; ^{Ely, Ely, Crymes & Minnich, 2000}). Es decir, cada flagelina juega un papel específico dentro de la estructura y sólo el conjunto de todas produce filamentos completamente funcionales. Este es el caso para muchos de los ejemplos en los que el filamento está formado por más de dos tipos de flagelinas distintas, incluso existen casos, como la misma C. crescentus, en los que cada flagelina se transcribe de forma independiente a las otras (^{Deakin et al., 1999}; ^{Pleier & Schmitt, 1991}). Otro ejemplo es el filamento del endoflagelo periplásmico de la espiroqueta Brachyspira hydrodysenteriae, que posee 3 flagelinas homólogas a FliC denominadas FlaB1-FlaB3 y una flagelina no relacionada, denominada FlaA. Las flagelinas FlaB1-FlaB3 se exportan y se insertan en el filamento vía el fT3SS, en cambio, FlaA se exporta por el sistema de secreción tipo SEC y se ensambla envolviendo al filamento (Figura 2E). La falta de FlaA impide la rotación y altera la forma de las células, ya que modifica la longitud de onda del filamento. Al modificar los parámetros de la hélice y el diámetro, la incorporación de FlaA al filamento permite que las espiroquetas sean capaces de desplazarse por medios tipo gel en los que la mayoría de las bacterias flageladas no podrían. (^{Li, Wolgemuth, Marko, Morgan & Charon, 2008}; ^{Motaleb, Sal & Charon, 2004}). En otra espiroqueta, Leptospira, visualizaciones por cryo-ET del filamento muestran que la modificación en la curvatura del filamento también puede estar dada por proteínas asociadas a la flagelina. Las proteínas FcpA y FcpB, se unen sólo en una cara del filamento para generar filamentos más curvos y menos sensibles a las transiciones polimórficas, lo que ayuda a la modificación de la forma de la célula para su mejor desplazamiento (^{Gibson et al., 2020}).

Anillos y discos

En V. alginolyticus se ha descrito la presencia de dos estructuras que mejoran el rendimiento del estator flagelar, estos son los anillos T y H (Figura 2C) (^{Terashima, Koike, Kojima & Homma, 2010}). El anillo T sólo se ha descrito en Vibrionaceae y está formado por las proteínas MotX y MotY que son indispensables para la rotación flagelar. MotY ancla el anillo T al anillo P, y MotX es la responsable de unirse al homólogo de MotB (^{Zhu et al., 2019}). En el caso de las Vibronacea a este homólogo se le conoce como PomB, y junto con el homólogo de MotA, PomA, acoplan el flujo de iones de sodio a la rotación flagelar. En general la estructura y funcionamiento de estos homólogos son similares a los reportados para MotAB. Sin embargo, en la región periplásmica de PomB, el dominio de anclaje (linker) es de mayor tamaño que el de MotB. Por encima del anillo T, cubriendo al anillo P, se forma el anillo H. Este anillo se encuentra debajo de la ME y en V. alginolyticus se sabe que está compuesto por FlgT, FlgP y FlgO (Figura 2C) (^{Zhu et al., 2019}; ^{Terashima et al., 2010}; ^{Martínez, Dharmasena, Kirn & Taylor, 2009}). FlgO es la proteína más distal del anillo H, con respecto al anillo P, seguido por FlgP y en la parte interna se encuentra FlgT (^{Zhu et al., 2019}). Se sabe que FlgT interactúa con MotY, aunque la formación del anillo H es independiente del anillo T, pero no al contrario (^{Terashima, Fukuoka, Yakushi, Kojima & Homma, 2006}). La presencia del anillo H es indispensable para la rotación flagelar y en el caso de Vibrio cholerae para el mejor anclaje del filamento al cuerpo celular (^{Martínez, Jude, Kirn, Skorupski & Taylor, 2010}; ^{Martínez et al., 2009}). También en las Vibrionaceae se detecta la presencia del anillo O, del que no se conocen las proteínas que lo conforman, pero se cree que su función es la de ayudar a doblar la ME para que esta recubra al filamento (^{Zhu, Nishikino, Kojima, Homma & Liu, 2018}).

También se ha descrito la presencia del anillo H en el flagelo subpolar de R. sphaeroides (Figura 2F). En la formación del anillo H de R. sphaeroides también interviene la proteína FlgT, pero a diferencia de lo descrito para las Vibronaceae, no existe un anillo T, ni homólogos de MotXY en su genoma. La presencia de FlgT permite la formación de un anillo debajo de la ME de 65 nm de diámetro. Este anillo es indispensable para la rotación del flagelo y permite la localización de otros componentes que por sí solos también son importantes para la rotación, como MotF y FliL (^{Fabela et al., 2013}).

En R. sphaeroides además no existe el homólogo de flgO y el papel de FlgP parece estar más relacionado con la transición eje-gancho, ya que mutantes en esta proteína no son capaces de ensamblar el gancho. FlgP interactúa con FlgH, proteína del anillo L, y con FlgT, pero en ausencia de FlgP no ensamblan el anillo H lo que aparenta ser una característica que comparte con Vibrio alginolyticus donde se ha descrito el papel del anillo H como facilitador de la penetración de la ME (Figura 2F) (^{Pérez-González et al., 2018}; ^{Zhu et al., 2018}).

R. sphaeroides y C. jejuni comparten el papel de FlgP, ya que en las mutantes de esta no se ensambla el flagelo. Sin embargo, las estructuras que se forman alrededor del cuerpo basal de estas bacterias son muy diferentes.

En observaciones por cryo-EM del motor flagelar de C. jejuni es evidente la presencia del denominado complejo disco, que forma una estructura de 100 nm de diámetro debajo de la ME (Figura 2D). El complejo está formado por subestructuras discales: basal, medial y proximal. Para la formación del primero es indispensable la presencia de FlgP, además de FlgQ y tal vez otras proteínas no descritas, aunque no FlgT, ya que esta bacteria no posee homólogos de FlgT (^{Sommerlad, & Hendrixson, 2006}). Debajo se forma el disco medial compuesto por PflA y otras proteínas no descritas. Finalmente se ensambla el disco proximal formado por PflB (Figura 2D) (^{Beeby et al., 2016}). En las microscopías se observan claramente los estatores unidos al disco lo que hace pensar que estos se encuentran fijos y el disco es el encargado de fijarlos.

Es importante señalar que FlgP es la única proteína conservada en R. sphaeroides, Vibrionaceae y C. jejuni involucrada en la formación de las estructuras descritas.

Las espiroquetas no presentan ninguna de las estructuras mencionadas, pero sí cuentan con una estructura denominada cuello que se ancla a la MI y que recubre al eje y al anillo P (Figura 2E) (^{Liu et al., 2009}). Esta estructura parece estar formada por múltiples proteínas, hasta la fecha se han reportado FlbB, FlcA, FlcB y FlcC entre sus componentes. FlbB forma parte de la base del cuello, y FlcABC de la estructura tipo turbina que sirve de andamio del estator. La ausencia de cualquiera de estas proteínas impide la motilidad, aunque sí son capaces de ensamblar flagelos incompletos (^{Chang et al., 202b1}; ^{Xu, He, Liu & Motaleb, 2019}; ^{Moon, Zhao, Xu, Liu & Motaleb, 2018}; ^{Moon et al., 2016}). El cuello juega un papel importante en la formación y en la inmovilización de los estatores en el motor flagelar. Cryo-EM de los motores de B. burgdorferi muestran la presencia de los estatores insertados en el cuello localizados en la periferia del anillo C cerca de la MI en el periplasma (^{Chang et al., 2019}).

En todos estos modelos, se piensa que la función de los anillos además de robustecer a la estructura para hacerla más eficiente en ambientes con requerimiento de mayor torque, aumente el área de asociación de los estatores para elevar su número e incrementar, con ello, la fuerza de rotación. Por ejemplo, sabemos que en Helicobacter pylori se unen al motor flagelar 18 estatores, en C. jejuni 17 estatores, en Vibrio fischeri 13 y en Salmonella 11 (^{Chaban, Coleman & Beeby, 2018}).

La diversidad de estas estructuras y la falta de homología entre sus componentes parecen indicar que el evento de reforzamiento del estator pudo haber aparecido varias veces en la historia evolutiva.

En estos últimos años, se han observado nuevos anillos a los que aún no se les atribuye una función o conocer las proteínas que los forman; que se pueden encontrar en el citoplasma o presentes sólo durante una etapa de la biogénesis del flagelo, lo que muestra que aún hay componentes por descubrir (^{Kaplan et al., 2022}).

MotF

En R. sphaeroides se ha descrito la presencia de la proteína de membrana MotF como indispensable para la rotación del flagelo. Esta proteína no presenta homólogos en otras bacterias. MotF es reclutada por el motor flagelar a la base del flagelo y requiere de la presencia del motor flagelar completo para su reclutamiento. Además, para la estabilización de su localización es necesaria la presencia de la región plug de MotB. La obtención de mutantes secundarias, capaces de nadar en ausencia de MotF, resultan en mutantes en la región del plug de MotB, lo que hace pensar que controla indirectamente la rotación del flagelo de R. sphaeroides a través de la estabilización de MotB (^{Ramírez-Cabrera et al., 2012}; ^{Fabela et al., 2013}).

FliL

A pesar de ser FliL una proteína ubicua en los sistemas flagelares, ha resultado difícil su caracterización por la gran variedad de fenotipos que tiene su deleción.

Fue en R. sphaeroides donde por primera vez se describió la relación directa de FliL con la regulación del estator. FliL es una proteína de MI con una región periplásmica que en R. sphaeroides es indispensable para la rotación del flagelo (^{Suaste-Olmos et al., 2010}). La obtención de mutantes capaces de nadar en ausencia de esta proteína, resulta en la obtención de mutaciones secundarias que alteran la región del plug de MotB. Este fenotipo no se revierte por la reintroducción de FliL lo que hace pensar que el cambio en MotB es el resultado de estatores siempre abiertos (^{Suaste-Olmos et al., 2010}).

Al igual que en R. sphaeroides en otros modelos como V. alginolyticus, la presencia de FliL es requerida para la correcta rotación del flagelo y se ha propuesto que forma un complejo que rodea a los estatores formados por las proteínas PomAB de esta bacteria (^{Takekawa et al., 2019}). La localización de FliL se ha observado, por cryo-EM, en el motor flagelar de C. jejuni ubicada entre los estatores y el cuerpo basal (^{Motaleb, Pitzer, Sultan & Liu, 2011}). Las observaciones realizadas, por cryo-ET, en Helicobacter pylori, muestran a FliL localizada en el motor y dentro de la estructura denominada jaula que contiene al estator en estas bacterias y donde postulan la interacción de FliL con el complejo MotAB como proteína de andamiaje y su posible papel en la estabilización extendida de MotB en interacción con la pared (^{Tachiyama et al., 2022}). En Borrelia se ha podido visualizar la ubicación de FliL en la misma zona y se sabe que su presencia permite la correcta orientación de los flagelos periplásmicos (^{Motaleb et al., 2011}). En esta misma bacteria se ha descrito que, tras el reclutamiento de los complejos estatores al rotor flagelar, FliL se oligomeriza envolviendo a la región linker de MotB estabilizando la conformación abierta del estator, además, favorece la ubicación de los estatores abiertos en la estructura cuello (^{Guo, Xu, Chang, Motaleb & Liu, 2022}). Estos datos han mostrado que el papel de FliL descrito en R. sphaeroides sobre la estabilización de la función del estator parece ser un mecanismo ampliamente utilizado entre las bacterias.