Aceites esenciales

Los aceites esenciales utilizados fueron Melaleuca viridiflora Gaertn (Myrtales: Myrtaceae) obtenido del comercio local de la marca Soria natural distribuidos por la casa Herbofarm Madrid, España; Eucalyptus camaldulensis Dehnhardt (Myrtales: Myrtaceae) obtenido de hoja recolectada de árboles ubicados a 29° 00´ 44” N y 111° 08´ 02” O; y orégano Lippia palmeri Watson (Verbena: Verbenaceae) en 29º 02’ 52’’ N y 110° 50’ 16’’ O.

Extracción de los aceites esenciales en hoja

El aceite esencial fue extraído mediante el proceso de destilación por arrastre de vapor de agua siguiendo el Método Oficial de la A.O.A.C. 6.006 (^{Association of Official Analytical Chemists 1975}), para lo cual se utilizó un destilador tipo Clevenger de capacidad de 2 L donde se colocaron 100 gramos de hojas de las plantas que fueron recolectadas de E. camaldulensis y L. palmeri, cortadas a mano en partículas pequeñas de 2 cm. Una vez obtenidos los aceites se almacenaron en viales color ámbar a 4 °C para su conservación.

Mortalidad de R. dominica

Se realizaron pruebas in vitro por saturación atmosférica para lo cual se añadieron 10 adultos de R. dominica de edades estandarizadas (10 días) con 5 g de trigo y se impregnaron discos de papel filtro de 2 cm de circunferencia con concentraciones de 5, 10 y 15 μL/kg para cada aceite esencial y a tres tiempos de exposición (24 48 y 72 h), en cajas Petri selladas con parafilm para prevenir la fuga de gases, así como un tratamiento sin añadir aceites esenciales como testigo. Se consideró como insecto muerto a todos los que no mostraron movimientos ante la punción con aguja de disección entomológica. Los resultados de mortalidad se calcularon mediante la fórmula de ^{Abbott (1925)}.

Índice de repelencia (IR) de R. dominica

Para evaluar la efectividad de los aleloquímicos vegetales volátiles (toxicidad, repelencia, concentraciones efectivas, tiempo de exposición u otros tipos de estímulos), se realizaron bioensayos con los tres tipos de aceites esenciales sobre R. dominica, utilizando un olfatómetro, adaptados a una técnica en común. Dos recipientes de plástico de 250 mL cada uno, se conectaron mediante un tubo de plástico de 15 x 1 cm de diámetro en los que se abrió una pequeña ventana de 1 x 1 cm equidistante a los dos recipientes. En uno de los recipientes se colocó 10 g de grano entero tratado con la fracción de aceite esencial y en el otro recipiente se colocó 10 g de grano entero sin tratar como control. Sobre esa dieta fueron aplicados los aceites con una concentración de 5, 10 y 15 μL/kg con los respectivos testigos en blanco. Los envases se cerraron herméticamente quedando apoyados por una de sus caras para evitar movimientos y asegurar la estabilidad de la estructura. Luego de aplicado el aceite, se incorporaron 20 adultos de R. dominica edades estandarizadas (10 días) en el centro del tubo a través del hueco central, que posteriormente fue sellado con parafilm.

Se registró el número de insectos en cada recipiente luego de 24, 48 y 72 horas para determinar repelencia y mortalidad respectivamente. Mediante esta evaluación olfatométrica se pueden discriminar dos conductas: individuos que eligen la fuente aromática (atracción) y los que se alejan de ella (repelencia) dirigiéndose hacia los granos sin tratar. Para cada tratamiento se registró el número de insectos presentes en los envases, transformándolo en porcentaje de repelencia y/o mortalidad. Permitiendo calcular el índice de repelencia (IR) según lo descrito por ^{Mazzonetto (2002)}, donde el tratamiento se clasifica como neutro si el índice es igual a 1, atrayente si es mayor a 1 y repelente si es menor a 1. El cálculo será por la siguiente fórmula:

Dónde: IR: Índice de repelencia

G: Porcentaje de insectos en el tratamiento

P: Porcentaje de insectos en el testigo

Emergencia de progenies (F1) de R. dominica

Para la estimar la emergencia se tomó una muestra representativa de 50 gramos con 20 ejemplares insectos de edades estandarizadas (10 días) para cada tratamiento con los tres aceites esenciales, donde se aplicaron las dosis de 5, 10 y 15 µL/kg a intervalos de exposición de 24, 48 y 72 h. Una vez transcurrido el período de exposición los insectos adultos y los granos fueron colocados en un frasco de vidrio y dejados en una cámara climática con las condiciones de temperatura de 27 ± 2 °C y una humedad relativa del 70 ± 5%, por un periodo de 45 a 50 días para obtener la progenie (F1) del insecto R. dominica.

Pérdida de peso del grano de trigo

El grano del ensayo anterior para cada tratamiento fue utilizado para determinar la pérdida de peso. Esta evaluación se realizó siguiendo la técnica propuesta por ^{Adams y Schulten, 1976}, en el que se compara el peso promedio del grano sano y daños de la muestra. Este método requiere el cálculo de la proporción en peso del grano dañado por el insecto y el porcentaje de grano no dañado y es calculado mediante la siguiente fórmula:

Donde S= peso de grano sano

D = peso de grano dañado

Ns = números de granos sanos

Nd = números de granos dañados

El porcentaje de grano dañado será calculado mediante la siguiente formula

Grano dañado (%) = Peso de granos dañados/peso original del grano x100

Análisis estadístico

El experimento se llevó a cabo en un arreglo factorial, donde el factor A son los aceites esenciales, factor B dosis (5, 10 y 15 μL/kg) y el factor C tiempos (24, 48 y 72 h) y cinco repeticiones por tratamiento y testigo.

Los datos obtenidos de la mortalidad, el índice de repelencia, la emergencia de insectos adultos y la pérdida de peso en el grano se sometieron a un análisis de varianza de dos vías (ANDEVA). Todos los datos se compararon con Tukey a un nivel de significancia de 0.05. El análisis estadístico se realizó utilizando un paquete computacional JMP versión 8.

Mortalidad de R. dominica

La mortalidad en el tratamiento control fue cero, en el cual no existió una respuesta de muerte natural del insecto adulto en los periodos evaluados. Los tres tipos de aceite esencial mostraron una fuerte actividad contra R. dominica, obteniendo diferentes porcentajes de mortalidad entre los tratamiento y tiempos de exposición (Tabla 1). Además, su efectividad fue mayor al incrementar el tiempo de exposición y la dosis, existiendo una interacción entre los factores probados (Tabla 2). El aceite esencial de M. viridiflora fue el tratamiento que obtuvo una mayor efectividad sobre R. dominica alcanzando el 100% de mortalidad a las 24 h de exposición en todas las dosis probadas; el aceite de E. camaldulensis presentó un efecto intermedio sobre el insecto y obteniendo una mortalidad completa en un periodo de 24 h para las dosis de 10 y 15 µL/kg; el aceite de L. palmeri fue el tratamiento con menor incidencia sobre la plaga obteniendo una mortalidad de 82% con una dosis de 15 µL/kg a las 72 h (Tabla 1 y 2). Sin embargo, la mortalidad obtenida en los tratamientos de L. palmeri a las dosis probadas de 5 y 10 µL/kg se encontraron por debajo del límite establecido del 50% de mortalidad para el uso de productos de origen botánico (^{Lagunes, 1994}).

El uso de los aceites esenciales como alternativas de control en el manejo de plagas depende de la dosis y del período de exposición. Se han demostrado que al incrementar la dosis de los aceites esenciales aumenta la eficiencia sobre los adultos de R. dominica, reportando mortalidades totales de este insecto a las 24 h de exposición utilizando dosis de hasta 129.03 µL/L(aire) de los aceites esenciales de Mentha puligeum L. (Lamiales: Lamiaceae), Lavanda stoechas L. (Lamiales: lamiaceae) y Ruta chalepensis L. (Sapindales: Rutaceae) (^{Ncibi et al., 2020}). Además, se han reportado que al incrementar el tiempo de exposición la efectividad de los aceites de Eucalyptus globulus L. (Myrtales: Myrtaceae) y L. stoechas aumenta sobre el insecto R. dominica (^{Ebadollahi et al., 2010}; ^{Chandel et al., 2019}). Estos resultados comparados con los datos obtenidos en el estudio nos permiten subrayar la presencia de insecticidas potenciales contra R. dominica.

Índice de Repelencia (IR) de R. dominica

Los tres aceites esenciales registraron una actividad repelente sobre los adultos de R. dominica, obteniendo un IR menor de 1 en cada dosis y tiempos de exposición probado, lo cual los clasifica como repelentes. (Figura 1).

Figura 1 Índice de repelencia de R. dominica expuestos con tres aceites esenciales a diferentes dosis (A) 5 µL/kg, (B) 10 µL/kg y (C) 15 µL/kg. Valores con diferente letra son significativamente diferentes (Prueba de Tukey, P < 0.05).
Figure 2. Repellency index of R. dominica exposed with three essential oils at different doses A) 5 µL/kg, (B) 10 µL/kg y (C) 15 µL/kg. Values with different letters are significantly different (Tukey’s test, P < 0.05). 

Además, el IR fue significativamente diferente para cada aceite esencial y tiempo de exposición en las diferentes dosis probadas, mostrando una interacción entre estos factores para las dosis de 10 y 15 μL/kg (Tabla 3). El aceite de L. palmeri mostró una mayor actividad repelente sobre los adultos de R. dominica en todas las dosis probadas con respecto a los otros dos aceites esenciales (Figura 1). El aceite de M. viridiflora fue el que obtuvo un IR intermedio y el E. camaldulensis fue el aceite que menor actividad repelente presentó para cada dosis probada (Figura 1 A, B). Sin embargo, al incrementar la dosis a 15 µL/kg no mostró diferencias significativas con respecto al aceite de M. viridiflora (Figura 1 C).

El IR de los aceites esenciales en contra del insecto R. dominica depende de la especie de la planta donde se extrae el aceite esencial y el período de exposición, como es en el caso de E. camaldulensis que al incrementar el tiempo de exposición de 72 horas el IR disminuye, puede ser al que el insecto se va adaptando a los componentes volátiles del aceite esencial. Se ha observado este tipo de comportamientos en R. dominica con los aceites esenciales de E. globulus y E. camaldulensis indicándose que los aceites esenciales ejercen un efecto activador del metabolismo de los insectos para sintetizar una mayor cantidad de enzimas amilolíticas, y así contrarrestar el efecto insecticida permitiendo al insecto, digerir el almidón del grano (^{Reyes-Guzmán et al., 2012}). (Figura 1 B). También se ha reportado que la concentración del aceite esencial influye sobre la actividad repelente, estudios con Eucalyptus globulus en contra de R. dominica encontraron que cuando la dosis se incrementa a 0.16, 0.24 y 0.32 µL/cm2 la actividad repelente tiende aumentar a 43.5, 47.5 y 62.5% respectivamente, después de las 36 horas de exposición (^{Aref y Valizadegan, 2015}). Otros estudios han registrado la repelencia sobre R. dominica con el uso de otros aceites esenciales a una dosis de 70 µL/L aire de las especies de Eucalyptus kruseana, E. floribunda, E. dundasii L. (Myrtales: Myrtaceae) con un índice de repelencia de 0.23, 0.39 y 0.39, respectivamente (^{Aref y Valizadegan, 2015}). Estos valores se encuentran dentro de los rangos observados en nuestros resultados obteniendo un IR máximo de 0.84 y un mínimo de 0.12 para E. camaldulensis y L. palmeri, respectivamente (Figura 1). En base a los resultados obtenidos los aceites esenciales de L. palmeri, M. viridiflora y E. camaldulensis pueden ser considerados candidatos como agentes repelentes de R. dominica.

Emergencia de la progenie (F1) R. dominica

La emergencia de adultos de R. dominica en el tratamiento control fue mayor en comparación con los demás tratamientos con los aceites esenciales obteniendo una media de 41.8 individuos (P < 0.05). Los tres aceites esenciales registraron emergencia de los individuos adultos de R. dominica (Figura 2).

Figura 2 Emergencia de adultos de R. dominica expuestos con tres aceites esenciales a diferentes dosis (A) 5 µL/kg, (B) 10 µL/kg y (C) 15 µL/kg. Valores con diferente letra son significativamente diferentes (Prueba de Tukey, P < 0.05).
Figure 2. Emergency of R. dominica adults exposed with three essential oils at different doses (A) 5 µL/kg, (B) 10 µL/kg y (C) 15 µL/kg. Values with different letter are significantly different (Tukey’s test, P < 0.05). 

La emergencia de los adultos de R. dominica fue significativamente diferente para cada aceite esencial y tiempo de exposición probados, mostrando una interacción entre estos dos factores para cada dosis tratada (Tabla 4). El aceite de M. viridiflora presentó un mayor efecto sobre la emergencia de R. dominica con respecto a los otros dos aceites esenciales, donde solamente lograron emerger una media de 1.2 individuos en la dosis de 15 µL/kg a las 24 h de exposición (Figura 2 C). El aceite de E. camaldulensis fue el que mostró una emergencia intermedia en general del insecto en todas las dosis probadas (Figura 2). El aceite L. palmeri a una dosis de 5 µL/kg a un tiempo de exposición de 72 h fue el que obtuvo un menor efecto sobre la emergencia de R. dominica con una media de 21 adultos emergidos (Figura 1 A).

Otros estudios han reportado una inhibición total de la progenie F1 de R. dominica en dosis de 10 y 15 μL/kg del aceite esencial de Eucalyptus globulus a un tiempo de exposición 72 h, pero con el aceite de E. camaldulensis se tiene una emergencia máxima de 29.3 individuos por un tiempo de exposición de 72 h y una mínima de 14 individuos a un periodo de 48 h, ambas con la dosis de 15 μL/kg (^{Reyes-Guzmán et al., 2012}). Estos resultados con el aceite E. camaldulensis son similares a los obtenidos en nuestro estudio, teniendo el mismo comportamiento que ha medida incrementa el período de exposición aumenta el número de adultos emergidos de R. dominica. ^{Batish et al. (2008)}, reportó que impregnando al grano con el aceite esencial de Eucalyptus spp. se endurece la capa externa del huevo y previene su desarrollo por la falta de oxígeno. Sin embargo, en este estudio se obtuvo un efecto de estrés sobre el insecto adulto mediante la saturación de la atmosfera con los diferentes tipos aceite esencial utilizados y aumentando la dosis aplicada.

Pérdida de peso del grano de trigo

La pérdida de peso producido por R. dominica en el tratamiento control fue mayor en comparación con los tratamientos de los aceites esenciales obteniendo una media de 11% (P < 0.05), además los tres aceites esenciales influyeron sobre la alimentación del insecto (Tabla 5). La pérdida de peso obtenido fue significativamente diferente para cada aceite esencial y el tiempo de exposición, así como su interacción para los tratamientos de 5 y 10 µL/kg, para la dosis de 15 µL/kg la interacción de los factores aceite esencial y tiempo de exposición no fue significativo (Tabla 4). El aceite de M. viridiflora fue el tratamiento que obtuvo una menor pérdida de peso registrando una mínima de un 0.22% con una dosis de 15 µL/kg a las 24 h de exposición, mientras que el aceite E. camaldulensis presentó una mayor pérdida de hasta un 4.61% con una dosis de 5 µL/kg a las 72 h de exposición (Tabla 5).

La pérdida de peso para cada aceite esencial fue variando a medida que se trataban con diferentes dosis, en la dosis de 5 µL/kg los aceites que obtuvieron una menor pérdida de peso fueron E. camaldulensis y L. palmeri, para la dosis de 10 µL/kg fueron M. viridiflora y L. palmeri, y finalmente en la dosis de 15 µL/kg fue M. viridiflora. Estos datos fueron registrados a las 24 h de exposición, sugiriendo que al incrementar el periodo de exposición con los aceites esenciales el insecto suele adaptarse a ellos y aumenta su actividad metabólica. La actividad metabólica de R. dominica depende de sus enzimas digestivas que le permiten alimentarse de los granos y están conformadas por isoamilasas que hidrolizan el almidón y enzimas del tipo serina proteasas (^{Zhu-Salzman et al., 2003}; ^{Cinco-Moroyoqui et al., 2008}; ^{Osuna-Amarillas et al., 2012}).

Otros estudios han registrado alteraciones en la fisiología nutricional con Sitophilus oryzae L. (Coleoptera: Curculionidae) utilizando el aceite esencial de hojas y frutos de Schinus molle L. (Magnoliopsida: Anacardiaceae), además, el aceite de frutos produjo efecto inhibitorio de la alimentación con un índice fagodisuasivo de 62% (^{Benzi et al., 2009}). En nuestro estudio la pérdida de peso del trigo fue menor en los tratamientos con los aceites esenciales con respecto al control debido a que la emergencia de la nueva generación F1 fue relativamente baja. Además, se sugiere que los estados larvarios (etapa con mayor apetito del insecto) fueron afectados por estar expuestos a los aceites esenciales alterando su alimentación, ya que los componentes de los aceites esenciales por lo general son desfavorables para el insecto, produciendo una inhibición de su alimentación u ovoposición (^{Cruzat et al., 2009}).