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Introducción
De las semillas del cafeto se origina la bebida más consumida a nivel mundial denominada café, su origen y diversidad se ubica en las montañas de Etiopía en África (Mishra, 2019). El cafeto se caracteriza por su crecimiento arbustivo, con dos meristemos caulinares opuestos que moldean la arquitectura de las ramas, las hojas son verdes, elípticas y apiculadas, con diferencias en la coloración de los brotes y frutos (IPGRI, 1996; González, 2022). En México el cultivo de café abarca una superficie de 710,897 ha distribuidas en 14 estados, (Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera - SIAP, 2022). De las dos especies comerciales del género Coffea la más cultivada es C. arabica por sus atributos en taza, la cual, actualmente presenta limitantes en la producción al ser altamente susceptible a enfermedades y plagas, conllevando a la exploración de nuevos genotipos resistentes. La generación de nuevos cultivares de café utilizando el mejoramiento convencional, requiere la evaluación de siete ciclos de autopolinización de semilla a semilla, en un tiempo de 30 años (Loyola et al., 2016), además, la estrecha diversidad genética del cafeto y su comportamiento perenne, requieren de procesos que reduzcan el tiempo de los protocolos de mejoramiento genético (Cui et al., 2020).
La mutagénesis in vitro mediante agentes químicos se ha convertido en un instrumento útil para incrementar la variabilidad genética con aplicación en fitomejoramiento y genómica funcional (Suprasanna et al., 2015). El metanosulfonato de etilo (EMS) es el agente mutagénico de uso común en plantas para generar cambios bioquímicos, fisiológicos y morfológicos dependientes de la dosis de exposición. Los rasgos morfológicos y bioquímicos permiten la diferenciación fenotípica entre plantas silvestres y mutantes, además, han sido, los primeros marcadores de selección de plantas de utilidad en la agricultura (Purente et al., 2020). Serrat et al. (2014) reportan que molecularmente EMS alquila la base nitrogenada guanina en el oxígeno seis, ocupando uno de los puentes de hidrógeno de la unión con la base citosina generando una transición de G:C por A:T, por consiguiente, ocurre cambio en la secuencia de aminoácidos que conforman proteínas y en patrones de expresión. Al respecto, en Agave americana el tratamiento con EMS incrementó la actividad de la fenilalanina amonio liasa (PAL) y el contenido de metabolitos secundarios (Reyes et al., 2019). La PAL inicia la ruta de biosíntesis del ácido cafeico y ácidos clorogénicos, metabolitos presentes en el cafeto que son utilizados por la planta como defensa frente a patógenos (Luján-Hidalgo et al., 2020). El enanismo es un efecto característico después de la mutación en muchos cultivares, generando entrenudos cortos y reducción de algunas estructuras vegetativas (Rime et al., 2019; Chen et al., 2023), que pueden ser de utilidad agronómica en muchos cultivares. A la fecha no se han generado variedades de C. arabica usando EMS, que proporcionen nuevos rasgos bioquímicos y fenotípicos importantes para el mejoramiento genético del cafeto. El objetivo de la presente investigación fue determinar los cambios en la morfología y producción de metabolitos secundarios en plantas de cafeto generadas a partir de callos tratados con EMS.
Materiales y métodos
Material vegetal
Se utilizaron callos inducidos a partir de hojas de Coffea arabica cv., Borbón, cultivados en recipientes de vidrio según Joya-Dávila et al. (2023). La composición del medio de cultivo fue 2.2 g L-1 de medio Murashige y Skoog (1962) [MS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE. UU.] suplementado con 30 g L-1 de sacarosa, 0.2 g L-1 de ácido cítrico y 0.2 g L-1 de ácido ascórbico (Sigma Aldrich®), 7.25 µM de 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-D) y 4.4 µM de 6-bencilaminopurina (BAP), el pH del medio se ajustó a 5.7 y se solidificó con PhytagelTM (Sigma®, 2.5 g L-1). Las condiciones de cultivo correspondieron a oscuridad total en cámara bioclimática a 25 ± 1°C, por un periodo de 12 semanas con tres subcultivos.
Tratamiento con EMS
Callos de 200 mg (n = 20) fueron expuestos a nueve concentraciones EMS (0, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200 y 220 mM) (Sigma®-Aldrich), durante dos horas, con agitación manual cada 10 min (Bolívar et al., 2018 con modificaciones). Se realizó la inactivación del EMS con 100 mM de tiosulfato de sodio durante cinco minutos, seguido de tres lavados con agua estéril. Posteriormente, los callos fueron trasferidos a medio MS (Sigma®, 4.3 g L-1) líquido durante una hora en agitación, se secaron en papel absorbente estéril por cinco minutos. Seguidamente, se cultivaron en medio MS (2.2 g L-1) suplementado con 0.5 g L-1 de carbón activado, 30 g L-1 de sacarosa y 2.5 g L-1 de PhytagelTM, el pH se ajustó a 5.7, los cultivos permanecieron en oscuridad a 25 ± 1 °C.
Treinta días después fueron transferidos a medio de inducción de callo embriogénico reportado por Joya-Dávila et al. (2023), conformado por medio MS (Sigma®, 4.3 g L-1), suplementado con sacarosa (30 g L-1), 17.6 µM de BAP, 1.8 µM de 2,4-D, 30 µM de AgNO3 y se solidificó con PhytagelTM (Sigma®, 2.5 g L-1), el pH se ajustó a 5.7. Las condiciones de cultivo correspondieron a oscuridad total en cámara bioclimática a 25 ± 1 °C. Después de 25 d se evaluó el incremento de masa fresca (IMF) según la ecuación [1], el porcentaje de supervivencia y la dosis letal media (DL50) se calculó mediante regresión lineal.
Regeneración de plantas
Para las siguientes determinaciones fueron considerados los tratamientos 0, 140 y 160 mM de EMS, por presentar la cantidad de biomasa embriogénica requerida. Los callos embriogénicos fueron transferidos a medios de cultivo para la maduración de embriones, conformado por medio MS (Sigma®, 4.3 g L-1), suplementado con vitaminas (piridoxina 4.86 µM, ácido nicotínico 8.12 µM, tiamina 29.65 µM y myo-inositol 554 µM), sacarosa 30 g L-1, L-Cisteína 0.04 g L-1, extracto de malta 0.8 g L-1, caseína 0.2 g L-1, 4.44 µM de BAP, carbón activado 2 g L-1 y 2.8 g L-1 PhytagelTM, el pH se ajustó a 5.6. Posteriormente, embriones somáticos cotiledonares se transfirieron a medio de germinación conformado por MS (Sigma®, 4.3 g L-1) suplementado con vitaminas (piridoxina 4.86 µM, ácido nicotínico 8.12 µM, tiamina 29.65 µM y myo-inositol 554 µM), sacarosa 30 g L-1, GA3 (Sigma®, 2.89 µM) y PhytagelTM (Sigma®, 2.8 g L-1), pH 5.6 (Sanglard et al., 2019).
Determinación de parámetros morfométricos
Un grupo de 50 embriones somáticos cotiledonares seleccionados al azar por tratamiento (0, 140 y 160 mM de EMS) fueron distribuidos en cinco grupos (n = 10). Después de cuatro semanas de cultivo en medio de germinación fueron transferidos a medio MS (Sigma®, 4.3 g L-1) suplementado con sacarosa 30 g L-1 y 2.8 g L-1 PhytagelTM, el pH se ajustó a 5.6 (se realizaron dos subcultivos). Transcurridas 16 semanas de cultivo se evaluó el porcentaje de supervivencia de plantas y los parámetros morfológicos, número de hojas, altura de plantas, dimensiones de la hoja, forma y tipo de ápice, adicionalmente, se registraron cambios estructurales observados con respecto a los callos no tratados con EMS (0 mM). Las determinaciones se realizaron con base en el catálogo global de café arábica de world coffee research (2019) y descriptores morfométricos reportados para Chiapas por González (2022).
Extracción y cuantificación de metabolitos secundarios
La extracción se realizó utilizando ultrasonido con una frecuencia de 20 kHz, potencia de 130 W, a 35 °C por 20 min. Empleando 250 mg de hojas deshidratadas y pulverizadas (Horno a 35 °C; hasta peso constante) en 10 mL de metanol al 80 %. Posteriormente, se centrifugó a 4000 rpm por 15 min para separar sólidos, se filtró al vacío usando papel Whatman número dos, al final se lavó con 5 mL de metanol al 100 %, este proceso se realizó dos veces. Por medio de rotaevaporación a 65 °C y vacío de -9.82 PSI, fue separado el disolvente y el agua restante se eliminó por liofilización a - 39 °C y 0.47 mBar. Los extractos se almacenaron a - 20 °C hasta las determinaciones cromatográficas. Todo el procedimiento se realizó en cuarto oscuro con luz difusa y protegiendo los extractos con una cubierta de aluminio. Se utilizó un procesador de sonda ultrasónica GEX130PB (Sonics and Materials Inc) y un liofilizador LABCONCO FreeZone 4.5 Plus (Adaptado de Luján-Hidalgo et al., 2020).
La cuantificación de ácido cafeico (AC), cafeína (CF), ácido clorogénico (CL) y ácido gálico (AG), se efectuó mediante cromatografía líquida de alta resolución [PerkinElmer Series 200 HPLC Systems, Shelton, CT, USA.] conectado a un detector de arreglo de diodos. Las muestras liofilizadas fueron resuspendidas en agua tridestilada (5 mg mL-1) y se filtraron con una membrana de 0.22 μm. Se empleó una columna Kromasil 100-5-C18 (4.6 x 150 mm, 5 μm, 100A -SUPELCO, Bellefonte, CA, USA). Como fase móvil se utilizó acetonitrilo/ácido fórmico al 0.1 % (80:20 v v-1) (FASE A) y ácido fórmico al 1 % (v v-1) (FASE B) en una relación 10:90 con un flujo constante de 1 mL por minuto en modo isocrático. La cuantificación se realizó a 280 nm para CF y AG, a 320 nm para AC y CL. Se inyectaron 10 μL de muestra. Las curvas de calibración se realizaron con estándares Sigma-Aldrich® de CL, AG, AC y CF (50, 100, 200, 300, 400 y 500 ppm) disueltos en agua tridestilada. Los metabolitos fueron expresados en μg por g-1 de hoja seca
Análisis estadístico de los datos
Todos los ensayos se establecieron en un diseño completamente al azar, cada tratamiento estuvo conformado por cuatro repeticiones. Para cada variable se realizó un análisis de varianza y la prueba de comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05), en el paquete estadístico SAS® OnDemand (2022).
Resultados y discusiones
Se observó una correlación negativa entre la supervivencia de callos y la dosis de EMS (Figura 1). La supervivencia celular disminuyó con el aumento de la concentración de EMS, con diferencias estadísticas significativas con respecto al control a partir de la dosis de 140 mM, llegando a ser letales a dosis superiores de 180 mM. Los callos no viables se caracterizaron por una coloración marrón y compactos. En esta investigación la dosis letal media calculada (148.8 mM; 60 min) y la dosis letal (200 mM; 60 min), fueron bajas con respecto a las reportadas por Bolívar et al. (2018) para la variedad Catuaí, con una DL50 de 185.2 mM y dosis letal de 555.7 mM con exposición de 60 min. Lo que podría interpretarse como una respuesta diferencial entre varietales de cafeto al tratamiento con EMS, situación que también fue observada por Chen et al. (2023) en tres variedades de Arachis hypogaea. Estos resultados indican que es necesario determinar la dosis óptima de EMS previo a la inducción de mutaciones, que permita obtener células totipotenciales y alta frecuencia de mutaciones (Mba et al. 2010).
Con respecto al tratamiento control sin EMS, la masa fresca del callo disminuyó significativamente 81 y 56 % con 80 y 100 mM de EMS respectivamente. Concentraciones posteriores presentaron un incremento estadísticamente similar al control hasta 140 mM, dosis posteriores inhibieron el crecimiento (160 mM, 78 %; 180 mM, 100 %) (Figura 2). Los resultados encontrados pueden deberse a un efecto hormético de EMS en el crecimiento celular, al respecto, se ha reportado que la cepa TA100 de Salmonella typhimurium (auxótrofa para el aminoácido histidina) presentan diversas respuestas a la exposición con mutágenos químicos, altas concentraciones son letales, mientras que concentraciones por debajo de la DL50 aumentan el número de colonias que mediante un mecanismos de adaptación/reparación pueden crecer en medios carentes de histidina por la inducción de mutaciones (Calabresea et al., 2011).
La mayor formación de callo embriogénico posterior al tratamiento con EMS se observó en el control y las concentraciones de 140 y 160 mM (dosis cercanas a la DL50), dosis superiores inhibieron la formación embriogénica. En cuanto a las características morfológicas fueron similares en los tres casos (Figura 3 a-c). Con respecto al número de embriones somáticos recuperados (n = 4) fue significativamente menor con el incremento de la dosis (47, 21 y 8 embriones cotiledonares respectivamente). Resultado que puede atribuirse al efecto genotóxico generado por EMS sobre la plasticidad y totipotencia de las células embriogénicas (Behera et al., 2012). De acuerdo con Castro et al. (2006) una célula es viable si tiene la capacidad de crecer y desarrollarse, por lo que, los callos tratados con EMS que no presentaron incremento de biomasa y formación de embriones fueron determinados como no viables, mismos que en posteriores subcultivos presentaron necrosis y deshidratación, sin respuesta a medios de multiplicación celular.
Las plantas desarrolladas de callos expuestos a EMS presentaron aspecto similar con las plantas control (Figura 3 d-f), con diferencias estadísticas en las dimensiones estructurales (Tabla 1). El EMS generó enanismo y por consiguiente acortamiento de entrenudos como se observa en la Figura 4 (d). La altura del tallo se redujo entre 46 y 51 %, la disminución del tamaño de las hojas estuvo acompañado de cambios en la forma, en plantas control la forma fue elíptica y las variantes EMS presentaron formas ovada, irregular y lanceolada. La supervivencia de plántulas disminuyó a la par con el incremento de las dosis de EMS, los embriones que no lograron desarrollarse se caracterizaron por una morfología de tallo y hoja cotiledonar deforme, que con el tiempo presentaron oxidación de forma ascendente hasta generar necrosis general, comportamiento similar observado en callos y células en suspensión de C. arabica (Bolívar et al., 2018). En cuanto al número de hojas, solo se observó diferencias significativas entre el control y la concentración más alta evaluada, relacionado con la disminución en la velocidad de crecimiento. Estos cambios morfométricos son efectos característicos de la exposición de EMS en células vegetales, como se ha reportado en varios modelos de estudio, entre ellos Agave americana (Reyes et al., 2019), mango cv., Arka Puneet (Rime et al., 2019) y mandarina (Mallick et al., 2016).
Tabla 1 Parámetros morfométricos modificados por EMS en plantas de Coffea arabica.
| EMS (mM)1 | Altura | LH3 | AH4 | Número de hojas | Supervivencia de plantas |
| _____________ mm ____________ | % | ||||
| 0 | 45.6 ± 4.6a* | 2.7 ± 0.24a | 1.5 ± 0.1a | 9.6 ± 0.4a | 72 ± 12a |
| 140 | 23.2 ± 5.2b | 1.7 ± 0.54b | 1.0 ± 0.5b | 8.8 ± 1.2ab | 52 ± 8 b |
| 160 | 21.0 ± 9.4b | 1.9 ± 0.60b | 0.86 ± 0.3b | 8.0 ± 0b | 26 ± 14c |
| DMS2 | 8.3 | 0.58 | 0.47 | 1.37 | 16.0 |
Algunas variantes somaclonales EMS (160 mM) presentaron distintas formas de ápice (puntiagudo, obtuso y tridentado) y cambios en la coloración de la hoja, entre ellos, clorosis, albinismo y mosaicos (Figura 4 d-e). Anteriormente, ya se ha reportado que EMS ocasiona cambios en el contenido y distribución de la clorofila en las hojas, relacionados con la biosíntesis de esta macromolécula (Joya-Dávila y Gutiérrez, 2020; Pawar et al., 2010); en condiciones in vitro este tipo de mutantes pueden desarrollarse al suplementar los medios de cultivo con fuentes de carbono, pero agronómicamente no tienen utilidad.
Por último, en plantas obtenidas de callos tratados con 140 mM de EMS se observó la presencia de dos nervaduras primarias y tres meristemas caulinares por entrenudo (Figura 4 f). A la fecha todas las variedades de Coffea sp., están conformadas por dos meristemos caulinares, esta modificación estructural inducida por EMS pudiese incrementar el área foliar y número de frutos a cosechar. Estos cambios morfométricos pueden corresponder a que la exposición de los callos a EMS modificó los patrones de expresión de genes responsables de la conformación estructural de las plantas (Zhang et al., 2016).
La producción basal de cafeína, ácido cafeico y ácido clorogénico aumentó 15, 6 y 11 % respectivamente en plantas tratadas con 140 mM de EMS; mientras que las plantas tratadas con 160 mM no generaron cambios significativos con respecto a las plantas control, exceptuando el contenido de ácido clorogénico que disminuyó (Tabla 2). En todos los tratamientos las señales analíticas para el ácido gálico no fueron cuantificables. Se ha reportado que el EMS incrementa el contenido de metabolitos secundarios (fructanos) y la actividad de fenilalanina amonio liasa (PAL) en plantas de agave (Reyes et al., 2019). La producción basal de metabolitos secundarios está regulada por la acción enzimática en las rutas de biosíntesis, en el caso de los fenilpropanoides la actividad catalítica de PAL es clave en el inicio de la producción de fenoles (ácido cafeico o clorogénico). La utilidad de estos metabolitos está relacionada con mecanismos de defensa bioquímica relacionados con la biosíntesis de lignina (Campa et al., 2005), que en procesos de infección limitan el crecimiento microbiano o los confina, impidiendo la difusión de toxinas y extracción de nutrientes de la célula (de Melo et al., 2020).
Tabla 2. Efecto de EMS en la concentración de metabolitos secundarios en hojas de Coffea arabica cv., Borbón.
Table 2. Effect of EMS on the concentration of secondary metabolites in leaves of Coffea arabica cv., Borbon.
| EMS (mM)1 | Cafeína | Ácido cafeico | Ácido clorogénico | Ácido gálico |
| _________________ µg/g HS3 __________________ | ||||
| 0 | 8464 ± 210 b* | 1288.3 ± 26 ab | 11681.9 ± 294b | ND |
| 140 | 9577 ± 312 a | 1360.1 ± 46 a | 12960.5 ± 299a | ND |
| 160 | 8191 ± 240 b | 1220.1 ± 11 b | 10397.2 ± 111c | ND |
| DMS2 | 743.7 | 72.4 | 852.7 | - |
1Concentración de EMS evaluada. 2Diferencia mínima significativa. 3Hoja seca. ND = No detectado * Diferente literal entre columnas indica diferencias significativas entre tratamientos (Tukey P < 0.05).
Por otro lado, incrementar el contenido de cafeína en cafetos tiene importancia para la salud. Se ha reportado que el consumo de café disminuye el riesgo de la enfermedad de Parkinson, ya que sus efectos están mediados por la cafeína a través de la acción antagonista del receptor de adenosina (Ishibashi et al., 2022). En agricultura el contenido de cafeína está relacionado con mecanismos de defensa bioquímica a fitopatógenos; en cafeto al momento de la esporulación de Hemileia vastatrix las plantas susceptibles incrementan la síntesis de cafeína (Luján-Hidalgo et al., 2020), posiblemente por su acción antimicrobiana al inhibir estructuras de crecimiento (Cuadrado et al., 2009).
Conclusión
La determinación de la dosis adecuada de EMS permite inducir cambios de importancia en plantas de C. arabica. Dosis superiores a la DL50 generan cambios no deseables y disminuyen la supervivencia celular, dosis inferiores en particular 140 mM, ocasionó cambios estructurales importantes en la morfología caulinar del tallo con utilidad en las labores de recolección y poda, además, incrementó el contenido de metabolitos secundarios de alto valor agronómico en lo referente a la resistencia del cafeto al ataque de fitopatógenos.
