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Introducción
El rápido desarrollo de la nanotecnología ha captado el interés de la comunidad científica mundial debido a las propiedades únicas de las nanopartículas como son el tamaño reducido, mayor área superficial, cristalinidad, entre otras; además de haber demostrado aplicaciones como agentes antimicrobianos, antioxidantes y catalíticos (Abinaya et al., 2018). La diversidad de aplicaciones de las nanopartículas metálicas en diversos campos ha resultado muy atractiva para el sector alimentario, el cual constantemente requiere de innovación y mejora en sus productos. Las nanopartículas de ZnO se han convertido en una de las nanopartículas de óxido metálico más novedosas en aplicaciones biológicas, así como, en recubrimientos, pigmentos y aditivos alimentarios, además, por su excelente biocompatibilidad y baja toxicidad (Bajpai et al., 2018). La funcionalidad de las nanopartículas depende en gran medida de sus características, las cuáles son adquiridas o mejoradas a través del control de propiedades como el tamaño, química superficial y distribución. Es por ello que, los métodos de síntesis son determinantes para obtener nanopartículas con características deseables y homogéneas (Jo et al., 2015). La síntesis verde a base de extractos vegetales se ha destacado sobre el uso de otros agentes reductores, debido a la fácil disposición del material vegetal, alto contenido de compuestos reductores y su bajo costo. Sin embargo, tiene la desventaja de producir nanopartículas polidispersas, lo anterior como consecuencia de la amplia diversidad de compuestos fitoquímicos, lo cual limita principalmente su aplicación biológica (Salunke et al., 2014). Por ello, los agentes reductores de origen microbiano están recibiendo un especial interés y de forma particular, los exopolisacáridos bacterianos. Dichas matrices poliméricas (exopolisacáridos) confieren mejores propiedades físicas y químicas a las nanopartículas metálicas ya que tienen una composición estructural homogénea, dado que se producen bajo condiciones controladas (Ates, 2015). Los exopolisacáridos producidos por bacterias ácido-lácticas (BAL) reconocidos como seguros (GRAS), representan un potencial biotecnológico. Además, destacan por sus propiedades funcionales sobresalientes como agentes estabilizantes, emulsionantes, floculantes, por su capacidad de retención de agua, así como, por su actividad antioxidante y antimicrobiana, y en conjunto, con las propiedades sobresalientes de las nanopartículas de ZnO, podrían potencializar su funcionalidad. Las cepas del género Lactiplantibacillus son reconocidas por ser productoras de exopólisacaridos (Silva et al., 2019). Previamente, se ha reportado el aislamiento de la cepa de Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG, una cepa aislada de una bebida autoctóna del estado de Chiapas en México, que ha presentado propiedades de intéres como resistencia a antibióticos, supervivencia en condiciones gastrointestinales simuladas, además de una destacada producción de EPS (Ramírez-Pérez et al., 2022). Por ello, en la presente investigación se planteó, sintetizar nanopartículas de ZnO empleando exopolisacáridos producidos por Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG como agente reductor y estabilizador, para evaluar las características estructurales y funcionales de las nanopartículas.
Materiales y métodos
Materiales y reactivos
Las cepas de Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG y S. aureus fueron obtenidas del cepario del Tecnológico Nacional de México campus Tuxtla Gutiérrez (Tuxtla Gutiérrez, Chiapas, México). Todos los reactivos y estándares usados fueron grados analíticos obtenidos de Sigma Aldrich. Los medios de cultivo empleados fueron adquiridos de DifcoTM. El kit para la determinación de hemoglobina glicada (Ref. TK43090) fue adquirido de SPINREACT. Los aceites comerciales fueron adquiridos en un supermercado local.
Obtención de los exopolisacáridos de Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG
Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG se obtuvo del cepario del Laboratorio de Investigación del Tecnológico Nacional de México campus Tuxtla Gutiérrez. La cepa fue reactivada realizando un inóculo del cultivo (10 % v/v) en caldo MRS (BD DifcoTM, EUA), seguido de una incubación a 36 °C (IEC- 42c Lumistell, MX), con agitación constante a 200 rpm (Max Q200 Thermo Scientific™, EUA). Una vez reactivada la cepa, se realizó el cultivo en biorreactor de tanque agitado (Z611000310 Applikon, Holanda) bajo condiciones controladas (pH 6 ± 0.1, 36 °C, 200 rpm) por 8 h en caldo MRS (Gutiérrez-Sarmiento et al., 2020). Posteriormente, el caldo obtenido fue centrifugado (Z-236K Hermle, Alemania) a 4500 rpm durante 30 min a 4 °C para separar la biomasa. El sobrenadante con EPS fue tratado con etanol absoluto en una relación 3:5 (v/v) y se dejó reposar durante 12 h a 4 °C. Para separar los EPS, la mezcla fue centrifugada (4500 rpm, 30 min, 4 °C) y el precipitado obtenido fue dispersado en 40 mL de agua destilada, se adicionó etanol en una relación 1:1 (v/v) y se dejó reposar por 12 h a 4 °C. La solución fue centrifugada (4500 rpm, 30 min a 4 °C) y los EPS precipitados se dispersaron en agua destilada de acuerdo con las condiciones antes descritas. Posteriormente, ácido tricloroacético al 80 % (v/v) fue adicionado en una relación 10 % (v/v) a la solución de EPS y se dejó reposar durante 4 h a 4 °C. La solución final fue centrifugada (4500 rpm, 30 min, 4 °C) y el sobrenadante con EPS se ajustó a pH 7 con NaOH 3 M, para después añadir 2 volúmenes de etanol absoluto y se dejó reposar por 12 h a 4 °C. La solución final se centrifugó (4500 rpm, 30 min, 4 °C) y los EPS se congelaron y liofilizaron para análisis posteriores (Yilmaz y Simsek, 2020).
Caracterización estructural de los exopolisacáridos de Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG Contenido de monosacáridos por HPLC
La composición de monosacáridos de los EPS se cuantificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (Serie 200 Perkin Elmer, EUA) con detector de índice de refracción (HPLC-IR) siguiendo la metodología reportada por Seedevi et al. (2015) con algunas modificaciones. Se dispersaron 50 mg de EPS en 1 mL de agua destilada al cual se le adicionaron 1 mL de ácido trifluoracético (TFA) 4 M. La mezcla se calentó (Cimarec™ Thermo Scientific™, EUA) durante 3 h a 100 °C. Posteriormente, la mezcla se secó (Cimarec™ Thermo Scientific™, EUA) a 50 °C para eliminar el TFA. La muestra hidrolizada se resuspendió en 1 mL de agua destilada grado HPLC y s inyectaron 20 μL al HPLC. Se empleó una columna amino kromasil 100-5-NH2. La fase móvil fue una mezcla de acetonitrilo:agua (90:10 v/v) a un flujo de 1 mL/min en modo isocrático durante 60 min a 40 °C. La identificación de los azúcares se realizó por comparación de los tiempos de retención con estándares de ramnosa, glucosa, fructosa, xilosa, manosa y galactosa (Sigma Aldrich, EUA).
Determinación del peso molecular de los EPS
El peso molecular de los EPS fue calculado mediante la determinación de la viscosidad intrínseca [n] según Azim et al. (2018). Para lo cual se preparó una solución estándar de EPS (0.1 % p/v) en NaCl (0.1 M). A partir de la solución estándar se prepararon diluciones entre 0.01 - 1.00 (mg/mL) a las cuales se les determinó la viscosidad empleando un reómetro (HR-2 TA Instruments Discovery, EUA) de geometría de plato paralelo (40 mm de diámetro) con espacio (gap) de 1000 μm a 25 °C y a una velocidad constante de 62.1 s-1. La viscosidad relativa n(rel) se calculó con la Ecuación 1, la viscosidad específica n(sp) con la Ecuación 2 y la viscosidad reducida n(red) con la Ecuación 3.
Resonancia magnética nuclear de 1H y FT-IR
Para determinar la configuración de los enlaces glucosídicos presentes en la estructura del EPS de Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG, el análisis por resonancia magnética nuclear de 1H se realizó de acuerdo con la metodología propuesta por Murru (2021), para lo cual se utilizó un equipo de resonancia magnética nuclear (DD2 Agilent, EUA) de 500 MHz. El análisis se realizó a 25 °C usando como disolvente cloroformo deuterado (CDCl3). Así mismo, la técnica de Espectroscopia Infrarroja por Transformada de Fourier (FT-IR) se empleó para identificar los grupos funcionales presentes en la molécula del EPS.
Síntesis de nanopartículas de ZnO-EPS
Para la síntesis de las nanopartículas de ZnO-EPS (NpZnO-EPS) se emplearon como agentes reductores los EPS extraídos evaluando su efecto a tres concentraciones diferentes (1, 3 y 6 mg/mL) en las características físicas de las nanopartículas (NPs) y en sus propiedades funcionales. Para lo cual se preparó una solución de ZnSO4 0.1 M y se mezcló con el agente reductor en una relación 35:15 v/v. La solución obtenida se ajustó a pH 9 con NaOH 3 M agitando vigorosamente durante 10 min y se esterilizó en autoclave (CV 300 AESA, MX) durante 1 h a 15 lb/in2. Posteriormente, la solución se centrifugó (4500 rpm, 20 min, 4 °C) y las nanopartículas precipitadas se lavaron 2 veces con etanol absoluto (50 mL) y con agua destilada (50 mL), centrifugando después de cada lavada. Las nanopartículas precipitadas se resuspendieron en agua destilada y se secaron a 40 °C (Sathiyanarayanan et al., 2017).
Caracterización de las NpZnO-EPS
La síntesis de las NpZnO-EPS se confirmó realizando un barrido espectral (200-800 nm) en un espectrofotómetro UV-Vis (DU-730 Beckman Coulter, EUA) según Estudillo-Díaz et al. (2023). El análisis espectral FT-IR se registró a una resolución de 500 a 4000 cm-1 utilizando un espectrómetro FT-IR (Nicolet iS10 Thermo Scientific, EUA), para identificar la vibración del enlace Zn-O. El tamaño hidrodinámico de las partículas y el índice de polidispersidad (PDI) se determinaron mediante la técnica de Dispersión Dinámica de Luz (DLS) (Abinaya et al., 2018).
Funcionalidad de las NpZnO-EPS Capacidad de retención de agua (CRA) de las NPZnO-EPS
La CRA se evaluó siguiendo la metodología reportada por Jiang et al. (2021) con algunas modificaciones. 75 mg de NpZnO-EPS se disolvieron en 1.5 mL de agua tridestilada. Posteriormente, las muestras se agitaron vigorosamente durante 10 min y fueron centrifugadas (10000 rpm, 15 min, 4 °C). El sobrenadante se separó y se pesó el precipitado de muestra húmeda. La CRA se calculó de acuerdo con la Ecuación 4:
Actividad floculante (AF) de las NPZnO-EPS
La AF de las NpZnO-EPS se determinó preparando soluciones de NpsZnO-EPS y del EPS libre a 1 mg/mL ajustando a pH 8 con NaOH 1 M. Cada mezcla fue sonicada (08855-10 Cole-Parmer, EUA) por 30 min a temperatura ambiente y frecuencia de 40 Hz. Posteriormente, se agregaron 0.5 mL de cada solución de NpZnO-EPS, 0.5 mL de CaCl2 (0.007 M) y 8 mL de carbón activado (6 mg/mL). La mezcla se agitó durante 2 min y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. La absorbancia a 550 nm del sobrenadante se determinó según Patil et al. (2011). La calibración del espectrofotómetro (DU-730 Beckman Coulter, EUA) se realizó usando una solución 1:1 (v/v) de CaCl2 y H2O destilada a pH 8 ajustado con NaOH 1 M. Como blanco se usó una mezcla de 0.5 mL de CaCl2, 8 mL de carbón activado y 0.5 mL de H2O destilada. Los resultados se reportaron como porcentaje de floculación (Ecuación 5).
Actividad antioxidante de las NPZnO-EPS
La capacidad de captación de radicales DPPH de las NpZnO-EPS se determinó de acuerdo con Li et al. (2014) para lo cual se prepararon soluciones de nanopartículas de ZnO-EPS y de EPS libre (1 mg/mL) las cuales se ajustaron a pH 2 con HCl 1 M. Una alícuota de 1 mL de solución de DPPH metanólico (5×10-5 M) se mezclaron con 2 mL de las soluciones de NpZnO-EPS y EPS libre. Las soluciones se mezclaron (VORTEX 3 IKA, CHN) vigorosamente y se incubaron por 30 min en oscuridad a temperatura ambiente. La absorbancia de cada muestra se determinó por espectrofotometría a 517 nm. Los resultados fueron calculados con la Ecuación 6:
Dónde:
Abs muestra: 1 mL de DPPH + 2 mL de la solución de NPZnO-EPS
Abs blanco: 2 mL de la solución de EPS + 2 mL de metanol
Abs control: 1 mL de DPPH + 2 mL de metanol
Actividad antimicrobiana de las NPZnO-EPS
La actividad antimicrobiana de las NpZnO-EPS se determinó de acuerdo con la metodología reportada por Solorzano-Toalá et al. (2020) con algunas modificaciones. Cultivos microbianos de S. aureus ATCC 35556 y Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG fueron resembrados en agar nutritivo (BD DifcoTM, EUA) y Agar MRS (BD DifcoTM, EUA), respectivamente. Tras el crecimiento, se tomaron asadas de las colonias microbianas para resuspenderlas en agua peptonada, se tomaron alícuotas de 0.1 mL de cada cultivo y se inocularon masivamente en cajas Petri con agar nutritivo y agar MRS, respectivamente. Posteriormente, se colocaron discos de papel filtro estériles de 10 mm de diámetro y se agregaron 0.02 mL de solución de EPS libre, ZnSO4 y NpZnO-EPS a concentraciones de 0.5, 0.75, 1 y 1.5 mg/mL a pH 4.5 (ajustado con HCl 1 M) para mejorar la dispersión de las nanopartículas. Las cajas petri fueron incubadas durante 48 h a 36 °C. La actividad antimicrobiana se evaluó midiendo las zonas de inhibición (mm).
Actividad emulsionante (AE) de las NPZnO-EPS
Para determinar la AE de las NpZnO-EPS, diversos aceites comerciales grado alimenticio con composiciones variantes de ácidos grasos fueron empleados. Se prepararon soluciones de NpZnO-EPS al 1.5 % (p/v) y se adicionaron 2 mL de cada aceite. Posteriormente, las suspensiones fueron agitadas en un vórtex (VORTEX 3 IKA, China) durante 5 min. La AE se calculó a la 1, 24 y 48 h (Kavitake et al., 2020) lo que permitió determinar la estabilidad de la emulsión. Los resultados fueron calculados de acuerdo con la siguiente Ecuación 7:
A las 24 y 48 h se tomó una alícuota (0.1 mL) de la emulsión y fue observada al microscopio óptico con la lente de objetivo 40x.
Citotoxicidad de las NPZnO-EPS
La citotoxicidad de las NpsZnO-EPS se determinó evaluando el porcentaje de hemólisis en muestras de sangre humana (Khan et al., 2015). El ensayo hemolítico fue realizado con un kit comercial (Spinreact, España) para determinación de hemoglobina glicada (HbA1c). Una muestra de 5 mL de sangre fue utilizada para cada ensayo al cual se le adicionó 1.5 mg de EDTA/mL de sangre para su estabilización y conservación. Una solución de nanopartículas resuspendidas (0.03, 0.15, 0.3 mg/mL), ZnSO4 (0.15 mg/mL) y EPS libre (0.3 mg/mL) fueron puestas en contacto con la muestra de acuerdo con las instrucciones del kit comercial y se determinó la absorbancia a 660 nm. Los resultados se expresaron en porcentaje de hemólisis (Ecuación 8):
Diseño experimental y análisis estadístico
El diseño experimental fue completamente al azar y los resultados se analizaron mediante un análisis de varianza (ANDEVA) utilizando el software Statgraphics Centurion XVI. La prueba de Tukey se utilizó para evaluar la diferencia entre tratamientos (p ≤ 0.05).
Resultados y discusión
Caracterización de los exopolisacaridos producidos por Lpb. Fabifermentans
El rendimiento de exopolisacáridos producidos por Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG fue 375.64 ± 0.025 mg/L. Como es reportado, la producción y composición del EPS son influenciadas fuertemente por las condiciones de cultivo: como temperatura, pH y la composición del medio de cultivo en términos de fuente de carbono, nitrógeno, minerales y vitaminas (Zisu y Sha, 2003). El rendimiento de exopolisacáridos para diversas especies de Lpb. plantarum se ha reportado en el rango de 31 a 859 mg/L producidos en medio de cultivo MRS (Jurasková et al., 2021). Sin embargo, optimizando las condiciones de cultivo, empleando caldo MRS suplementado con sacarosa (23 g/L), pH de 7.4 y tiempos de cultivo de 48 a 50 h se han reportado rendimientos de hasta 1380 ± 0.06 mg/L y 1070 ± 0.01 mg/L para Lpb. plantarum YO175 y OF101 respectivamente (Adesulu-Dahunsi et al., 2018). Por lo que, es posible obtener mejores rendimientos para Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG optimizando las condiciones de cultivo.
El análisis de la composición de monosacáridos realizado por HPLC indicó que el EPS de Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG es un heteropolisacárido compuesto por fracciones de manosa, glucosa, xilosa, ramnosa y fructosa. Dicha composición está determinada por la variación genética, la actividad enzimática que cataliza la biosíntesis, así como, por las condiciones de cultivo según lo reportaron Zisu y Sha (2003). Los heteropolisacáridos de bacterias ácido-lácticas en general comparten unidades repetitivas de monosacáridos, principalmente manosa y glucosa como se evidencia en cada una de las especies reportadas comparadas con el EPS de Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG.
En el espectro FT-IR del exopolisacárido de Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG (Figura 1), se observaron bandas características a 3282 y 2936 cm-1, asociadas a las vibraciones de estiramiento de los enlaces O-H y C-H respectivamente. La banda de absorción a 1661 cm-1 se atribuye a la vibración de estiramiento del grupo C=O. La banda a 1338 cm-1 se asocia a la vibración del ángulo variable del enlace C-H (Zhang et al., 2021). En la zona de huella dactilar la región comprendida de 1200 a 900 cm-1 se asocia a vibraciones de enlaces glucosídicos (-COC enlace glucosídico éter, -CO alcohol primario, C1-H carbono anomérico), especialmente de α-piranósidos (Leonia et al., 2013). En la región anomérica (950-700 cm-1) el pico de absorción a 828 cm-1 está relacionado con enlaces β-glucosídicos que se asocia con la presencia de β-D-glucanos y las bandas de absorción cercanos a 804 cm-1 también sugieren la presencia de manosa (Zhang et al., 2021). La presencia de dichos grupos funcionales confirma la presencia de monosacárido con poder reductor para la síntesis de las nanoparticulas.
El espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H sugiere la posible configuración de los enlaces glucosídicos presentes en los EPS producidos por Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG. En la Figura 2 se observan señales de protones anoméricos en la región de desplazamiento químico (δ) entre 4.4-5.25 ppm, confirmando la presencia de polisacáridos (Zhang et al., 2021). Se ha reportado, que la configuración α generalmente aparece a (δ) 4.8-5.6 ppm y la configuración β en δ 4.4-4.8 ppm (Senturk et al., 2019). Para especies de L. plantarum se ha reportado que los desplazamientos químicos en 4.9, 5.07 y 5.2 ppm se asocian a enlaces α-1,6, α-1,3 y α-1,4 respectivamente (Senturk et al., 2019), lo que sugiere la posible presencia de estos enlaces en la estructura del EPS de Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG. Por otro lado, el desplazamiento químico comprendido entre 4.4-4.5 ppm del espectro de Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG, puede asociarse a enlaces β-glucosídicos o grupos oximetilo. Alvarado (2015) reportó que en el espectro de 1H-RMN para β-glucanos, los desplazamientos químicos de 3.3-4.5 ppm corresponden a enlaces β-1,6, por lo que las señales entre (δ) 4.4-4.5 ppm del espectro de Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG podrían ser más afines a enlaces β-glucosídicos. La señal intensa que se presenta entre 4.6 y 4.8 pmm en el espectro de 1H-RMN se debe al disolvente empleado CDCl3 (Alvarado, 2015).
Finalmente, el peso molecular promedio (Mw) determinado de manera indirecta por la viscosidad aparente [n] medida experimentalmente (1.3 ± 0.7), dio como resultado un peso molecular promedio de 2.7 ± 0.57 MDa, el cual se encuentra dentro del intervalo reportado para bacterias acido lácticas que van desde pesos moleculares de 104 a 106 Da y clasificándose como un EPS de alto peso molecular (Ismail y Nampoothiri, 2014).
Caracterización de las nanopartículas Zno-EPS
La síntesis verde de NpZnO-EPS se evidenció mediante la aparición de una suspensión coloidal de color blanco (Abinaya et al., 2018). El barrido espectral UV-Vis de la solución coloidal confirmó la formación de las NpZnO-EPS observándose el desplazamiento de las bandas de absorción en un rango de 315 - 440 nm con un máximo de absorción a 375 nm, lo cual es consistente con las bandas de absorción características para las nanopartículas de ZnO (Figura 3) (Jayachandran y Nair, 2021). Estas bandas se han atribuido al efecto de resonancia de plasmón superficial, ya que las nanopartículas metálicas tienen electrones libres que producen una banda de absorción generada por la vibración mutua de los electrones de las nanopartículas en resonancia con la onda de luz. El pico de absorción del EPS libre se observó a 295 nm y se asocia con transiciones electrónicas n−σ* y/o π−π*, que se encuentran en los grupos funcionales como carboxilo, carbonilo y éster asociados a los grupos funcionales de los EPS (Trabelsi et al., 2019).
Por otra parte, los óxidos metálicos generalmente exhiben bandas de absorción en la región IR por debajo de 1000 cm-1 (Mahamuni et al., 2019). Las vibraciones de estiramiento del enlace Zn-O de las NPs sintetizadas con EPS de Lpb. fabifermentas mostraron vibraciones de estiramiento a 596, 601 y 600 cm-1 correspondientes a las nanopartículas sintetizas con 1, 3 y 6 mg/mL de EPS, respectivamente. Las diferencias en el número de onda y frecuencia pueden deberse a los tamaños de las nanopartículas según lo reportaron Chithra et al. (2015).
El efecto de la concentración del EPS como agente reductor y estabilizador en la síntesis de NpZnO-EPS, se reflejó en el tamaño hidrodinámico de las NPs, así como, en el índice de polidispersidad (PDI). El PDI disminuyó significativamente conforme aumentó la concentración de EPS en la síntesis de las partículas de ZnO (Tabla 1), obteniendose una distribución de tamaños homogénea (Figura 4). Los resultados indican, que las concentraciones de EPS (3 y 6 mg/mL) formaron micropartículas (MpZnO-EPS). Por otro lado, el aumento en el diámetro hidrodinámico de escala nano a micropartículas podría atribuirse a la adsorción de macromoléculas (EPS) sobre la superficie de las partículas que tienden a aumentar el tamaño hidrodinámico aparente (RH) de las partículas. Este aumento podría estar asociado al espesor de las macromoléculas adsorbidas (Lim et al., 2013).
Table 1. Hydrodynamic diameter and polydispersity index (PDI) of ZnO-EPS particles.
| Tratamiento | Muestra (%) | Diámetro hidrodinámico (μm) | PDI |
| NpZnO-EPS (1 mg/mL) | 65 | 0.00962 ± 0.00264 | 2.630a ± 1.68 |
| MpZnO-EPS (3 mg/mL) | 100 | 1.92 ± 0.397 | 0.053b ± 0.009 |
| MpZnO-EPS (6 mg/mL) | 100 | 1.43 ± 0.235 | 0.050b ± 0.003 |
Letras diferentes por columna tienen diferencia estadística significativa (p≤ 0.05).
Capacidad de retención de agua (CRA) de las NpZnO-EPS
La CRA es considerada una de las propiedades funcionales esenciales en el procesamiento de alimentos, ya que está directamente relacionada con la textura a través de las interacciones entre los componentes, incluidos el agua y el aceite. De acuerdo con los resultados obtenidos, conforme aumenta la concentración de EPS (1, 3 y 6 mg/mL) como agente reductor de las NPZnO-EPS, incrementa significativamente la CRA (Tabla 2) comparado con la CRA del EPS estructura libre. Los resultados mostraron que conforme va disminuyendo el PDI en las nanopartículas, la dispersión de tamaños se vuelve más controlada y las partículas se vuelven mucho más activas debido al crecimiento del área de superficie total con ello el número de centros activos y su funcionalidad (Suchomel et al., 2018). Los resultados muestran que las micro y nanopartículas de ZnO tienen mejor CRA, comparado con la pectina comercial, goma arábiga y almidón de trigo (1.38, 0.28 y 0.74 g H2O/ g de muestra) respectivamente (Soua et al., 2020).
Tabla 2. Capacidad de retención de agua (CRA), actividad floculante (AF) y actividad antioxidante (AA) de las nano y micropartículas de ZnO-EPS.
Table 2. Water holding capacity, flocculating activity and antioxidant activity, of ZnO-EPS nano and microparticles.
| Tratamiento | CRA (g H2O / g muestra) | AF (%) | AA (%) |
| EPS | 1.74d ± 0.01 | 30.38d ± 1.06 | 23.93d ± 1.13 |
| NpZnO-EPS (1 mg/mL) | 2.46c ± 0.01 | 47.24c ± 1.04 | 36.92c ± 0.87 |
| MpZnO-EPS (3 mg/mL) | 2.96b ± 0.02 | 61.89b ± 0.32 | 46.93b ± 1.73 |
| MpZnO-EPS (6 mg/mL) | 3.06a ±0.02 | 69.07a ± 1.74 | 80.25a ± 1.56 |
Letras diferentes por columna tienen diferencia estadística significativa (p ≤ 0.05).
Actividad floculante (AF) de las NpZnO-EPS
La AF incrementó de manera dependiente respecto a la concentración de EPS en la síntesis de las nanopartículas. La máxima AF fue 69.07 % para las MpZnO-EPS sintetizadas con 6.0 mg/L de EPS, existiendo diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos (Tabla2). Esto puede estar asociado a que las nanopartículas tienen una alta relación superficie-volumen y a la presencia de los EPS a escala micrométrica y nanométrica, los cuales pueden sufrir un reordenamiento molecular, con nuevas propiedades estructurales y mayor disposición de grupos funcionales activos (Dlamini et al., 2019). Aunado a ello, la carga superficial puede afectar directamente el efecto de floculación (Li et al., 2020). Los EPS libre tuvieron una actividad máxima del 30.38 %, coincidiendo con la actividad floculante reportada para los EPS de Bacillus cereus SK (31.22 %) (Busi et al., 2016). El peso molecular del EPS (Mw = 2.7 MDa) puede también influir, ya que se ha reportado que los polisacáridos con alto peso molecular favorecen las interacciones intramoleculares entre los segmentos del polímero a través de enlaces de hidrógeno, y generan un impedimento estérico debido al gran volumen excluido de la molécula que conduce a la agregación disminuyendo las interacciones con los grupos funcionales del EPS en comparación con las nano y mícro partículas de ZnO-EPS (Guo et al., 2016).
Actividad antioxidante (AA) de las NpZnO-EPS
Las nano y micropartículas son altamente sensibles al pH, pudiendo generar dos fenómenos diferentes: la protonación/ionización de grupos funcionales y la degradación o escisión de enlaces lábiles (Yan y Ding, 2020). De esta manera, es posible que a pH 2 se promoviera una disociación parcial de los enlaces covalentes dativos de las NpZnO-EPS, con ello una liberación o mayor disposición de los electrones para la estabilización de radicales libres, como el DPPH (Hayat et al., 2022). Los resultados de la evaluación de la actividad antioxidante (AA) mostraron un aumento en la capacidad de eliminación de radicales libres proporcional a la concentración de EPS empleados para la síntesis (Tabla 2). De acuerdo con los resultados se obtuvo el 80.25 % de actividad antioxidante con las MpZnO-EPS (6 mg/mL). Para el ácido ascórbico (antioxidante comercial) se ha reportado una actividad antioxidante de 90.59 y 94.40 % a 1 y 1.5 (mg/mL) respectivamente (Njus et al., 2020) por lo que, estos resultados sugieren que las MpZnO-EPS (6 mg/mL) podrían funcionar como un antioxidante comercial competitivo.
Actividad y estabilidad emulsionante de las NpZnO-EPS
Los tratamientos con nano y micropartículas de ZnO-EPS mostraron estabilidad en la AE respecto al tiempo en presencia de aceites vegetales comerciales. Las emulsiones con los aceites de oliva y canola en presencia de las MpZnO-EPS sintetizadas con 6 mg/mL de EPS, presentaron los porcentajes de emulsión mas altos (Figura 5). Además, las emulsiones se mantuvieron estables durante las 48 h evaluadas, manteniendo la emulsión por encima del 50 % en comparación con las emulsiones obtenidas con los EPS libres, las cuáles sufrieron un decremento en la estabilidad a partir de las 24 h obteniendo emulsiones por debajo del 50 % después 48 h (Figura 6), porcentaje mínimo requerido para considerarse un buen agente emulsificante (De Freitas et al., 2016). La estabilidad de las emulsiones podría estar asociada al área de contacto entre las MpZnO-EPS y los componentes del aceite, ya que los EPS se encuentran más compactados dentro de la partícula formando una estructura similar a una red protectora alrededor de las gotas de aceite, con una rigidez elevada que reduce la tensión superficial. Además, reportes previos indican que los ácidos grasos insaturados tienen la capacidad de mejorar la carga superficial, además de formar una película rígida en las partículas confiriendo una mayor estabilidad en la emulsión, reduciendo de esta manera la aglomeración. Este efecto fue reportado en aceite de soya con un porcentaje elevado de ácidos grasos poliinsaturados (65 %), el cual formó una emulsión con un tamaño de gota estable en un 60 % del volume total (Zheng et al., 2021). De esta manera podrían explicarse los porcentajes de emulsión elevados en los aceites de oliva y canola, en cuya composición se encuentran principalmente ácidos grasos insaturados (86.5 y 91.4 % respectivamente).
Figura 6. Microfotografías (40x) de la emulsión de EPS libres (izquierda) y MpZnO-EPS (derecha) después de 48 h.
Letras minúculas indican diferencia estadística significativa entre tratamientos (p ≤ 0.05). Letras mayúsculas indican diferencia estadística significativa de cada tratamiento respecto al tiempo (p < 0.05).
Figure 6. Microphotographs (40x) of free EPS emulsion (left) and MpZnO-EPS (right) after 48 h.
Actividad antimicrobiana de las NpZnO-EPS
La cepa de S. aureus mostró sensibilidad a las nano y micropartículas de ZnO-EPS a concentraciones de 1 y 1.5 mg/mL, mientras que el efecto inhibitorio sobre la cepa de Lpb. fabifermentans BAL-27-ITTG, se observó a partir de 0.5 mg/mL para todos los tratamientos. De acuerdo con los resultados reportados, el efecto bacteriostático sobre S. aureus podría asociarse con la composición de la pared celular, debido a que las bacterias Gram positivas, poseen una capa de peptidoglicano más gruesa con presencia de ácido teitoico y teicurónico unidos de manera covalente, confiriendo mayor resistencia a la célula (Chapot-Chartier y Kulakauskas, 2014). La interacción de las MpZnO-EPS, es posible por procesos como la adhesión a la membrana del microorganismo, causado por fuerzas de Van der Waals, fuerzas hidrofóbicas o interacciones con proteínas, ya que, las partículas de tamaño micrométrico no se internalizan, sino que forman agregados que permanecen adheridos irreversiblemente a la membrana celular, lo que causa inhibición en la capacidad para absorber nutrientes así como también, inhibición de las vías de síntesis de proteínas, lo que lleva a la pérdida de viabilidad (Wel et al., 2017). Las nanopartículas por su parte inducen una respuesta antimicrobiana debido a la interferencia en los procesos metabólicos y la alteración de los sistemas enzimáticos, que se asocia a mecanismos de adsorción, internalización y generación de especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés), lo que da como resultado la pérdida de la integridad celular y un aumento del estrés oxidativo que conduce al daño del ADN y muerte celular (Jin et al., 2019).
Citotoxicidad de las NpZnO-EPS
Con relación a la citotoxicidad, la cuantificación de la hemoglobina glicosilada de las muestras tratadas con nano y micropartículas de ZnO-EPS no mostraron diferencias estadísticas significagtivas entre los tratamientos con respecto a la muestra control sin adición de nano y micropartículas. Lo anterior indica que no existió efecto hemolítico, sugiriendo la posible biocompatibilidad de las partículas con células sanguíneas. Resultados similares fueron reportados para nanopartículas de ZnO evaluadas a una concentración de 0.1 mg/mL en el que se reportó una viabilidad de 97 % de glóbulos rojos, posterior a su tratamiento con nanopartículas (Khan et al., 2015).
Conclusiones
Los EPS producidos por Lpb. fabifermentans tienen capacidad como agente reductor y estabilizador para la síntesis de nano y micropartículas ZnO-EPS, mejorando el índice de polidispersidad y controlando el tamaño de las mismas. Los EPS en forma de micropartículas presentaron una mejor actividad y estabilidad emulsionante, actividad antioxidante, actividad antimicrobiana, actividad floculantes y capacidad de retención de agua en comparación con los EPS de estructura macromolecular libre, sugiriendo hemocompatibilidad para poder ser empleadas en matrices alimentarias.
