Introducción

Las enfermedades transmitidas por bacterias que contaminan los alimentos son un problema mundial que ocasiona importantes afectaciones en la salud pública (^{Mantzourani et al., 2022}; ^{Pina et al., 2018}; ^{Ritter y Tondo, 2014}; WHO, 2017). La inocuidad de los alimentos es afectada por una gran cantidad de microorganismos, los cuales tienen un metabolismo que se adapta para sobrevivir frente a distintos tipos de estresores, uno de sus mecanismos de resistencia es la capacidad para formar biopelículas. En los últimos años se ha incrementado el interés por el estudio de las biopelículas principalmente por la gran resistencia que presentan frente a diversos tipos de antibióticos (Alejo et al., 2018; ^{Lahiri et al., 2019}; ^{Vasudevan et al., 2014}). Alrededor del 90 % de los microorganismos poseen esta característica microbiológica (^{Ortega-Peña y Cendejas, 2014}). Las biopelículas son una densa población de células bacterianas sésiles que se adhieren a la superficie, formando una matriz compuesta por exopolisacáridos, proteínas y ADN, la cual proporciona estabilidad y nutrientes a las células que se adhieren (^{Friedman et al., 2015}; ^{Kavanaugh y Ribbeck, 2012}; ^{Ortega y Hernández, 2018}). Estas comunidades bacterianas pueden penetrar rápidamente en una amplia variedad de lugares del entorno, incluido el cuerpo humano. De acuerdo con el Instituto Nacional de Salud (NIH) alrededor del 80% de las infecciones de tejidos blandos y duros en humanos son causadas por biopelículas patógenas. Las biopelículas incrementan la resistencia a muchos biocidas, desinfectantes y antibióticos y su tratamiento generalmente se vuelve ineficaz (Amaral et al., 2015; ^{Ortega-Vidal et al., 2021}). Son capaces de desarrollar una tolerancia hasta mil veces mayor que las bacterias que crecen en forma libre (^{Davies, 2003}). En este sentido, una necesidad emergente es desarrollar alternativas eficaces y de menor costo para la prevención y control de biopelículas, tal es el caso de recubrimientos con propiedades biocidas derivados de plata o cobre, y en particular productos derivados de extractos vegetales (^{Trunk et al., 2018}). Diversos estudios han reportado la actividad antimicrobiana de algunas plantas contra distintos patógenos (^{Al-Dhabi et al., 2015}; ^{Elhariry et al., 2014}; ^{Naz et al., 2010}). Incluyendo actividad en la formación y disgregación de biopelículas contra distintas cepas (^{Adukwu et al., 2012}; Bazargani et al., 2015; ^{Pisoschi et al., 2018}; ^{Rudrappa y Bais, 2008}). Sin embargo, a pesar del potencial de los productos naturales en el descubrimiento de fármacos antimicrobianos, un gran número de plantas aún no han sido evaluadas y limitados extractos vegetales se han desarrollado como microbiocidas con actividad antibiopelícula. El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad antimicrobiana y antibiopelícula del sauco (Sambucus canadensis (L.). Esta especie ha sido reportada con actividad antimicrobiana, antiviral, antioxidante, quimiopreventiva, los cuales han sido asociadas a los componentes presentes en la especie tales como triterpenos, taninos y diversos tipos de flavonoides (^{Abdelmigid, 2013}; ^{Lee y Finn, 2007}; ^{Sidor y Gramza, 2014}; ^{Tedesco et al., 2017}). Sin embargo, no se han reportado estudios sobre la actividad antibiopelícula de la especie frente a bacterias que afectan la inocuidad de los alimentos.

Material y métodos

La planta de Sambucus canadensis (L.) Bolli. fue colectada en la zona de la Sierra Negra de Puebla, México. El material vegetal fue identificado por medio de técnicas taxonómicas y un espécimen fue depositado en el Herbario del Jardín Botánico de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla con el ID: 83771. Para obtener el extracto se utilizaron 500 g de hojas secas, fueron maceradas con 4L de etanol al 96% con doble filtrado. Los extractos se filtraron al vacío con papel Whatman Nº 4, el sobrenadante se concentró en un rota vapor Buchi® a presión reducida a 35 ± 15 °C, el extracto etanólico fue evaporado al vacío. Para la identificación cualitativa de los diferentes grupos de metabolitos se realizaron pruebas fitoquímicas: alcaloides prueba de Mayer, Drangendorff y Wagner; para Flavonoides prueba del H₂SO₄FeCl, y Shinoda; para Saponinas prueba de espuma y Rosenthaler; Cumarinas prueba de Baljet; Triterpenos y/o Esteroles prueba de Lieberman-Bouchard; Taninos prueba de Grignard, cada prueba se realizó por triplicado (Carvajal et al., 2009; Patil y Bhise, 2015). Para obtener información sobre grupos funcionales asociados a los compuestos fitoquímicos presentes en la planta se utilizó el espectro en el infrarrojo región media con transformada de Fourier (TFIR) en un espectrómetro marca Bruker de 4000 a 600 cm^-1 con resolución de 4 cm^-1, Los análisis se realizaron en el departamento de Centro de Servicios de Alta Tecnología (CESAT-UPAEP).

Actividad antimicrobiana. El extracto vegetal se analizó inicialmente por el método de difusión en agar y posteriormente fue sometido a la prueba de concentración mínima inhibitoria (CMI). La actividad antimicrobiana del extracto se evaluó con 2 colecciones pertenecientes al laboratorio de Microbiología de los alimentos y del medio ambiente de la Universidad de Jaén; la colección Española de Cultivos Tipo (CECT) y la colección de cepas previamente aisladas a partir de alimentos orgánicos con una alta tolerancia a los biocidas y resistencia a los antibióticos (Tabla 1) (^{Fernández-Fuentes et al., 2012}).

Método estándar de difusión en agar. Se realizaron pruebas preliminares de la actividad antimicrobiana mediante el método de difusión en agar estándar para obtener las concentraciones óptimas del extracto vegetal que posteriormente serian utilizadas en las pruebas de concentración mínima inhibitoria (CMI). Las cepas se cultivaron en caldo Mueller-Hinton, la suspensión microbiana ajustada a 1.0 x 10 unidades formadoras de colonias (UFC)/mL se vertió en placas con 15 mL de medio de agar Mueller-Hinton (MHA) y se dispersó con un rastrillo microbiológico. Las placas se incubaron a 37 °C durante 24 h. El vehículo (DMSO a la misma concentración alcanzada en cada dilución seriada de los compuestos ensayados) se utilizó como control negativo y todas las muestras se analizaron por triplicado. La actividad antimicrobiana se expresó en términos del diámetro promedio de la zona de inhibición en milímetros. Un halo de inhibición ≤ 5 mm se interpretó como ausencia de actividad antimicrobiana.

Prueba de concentración inhibitoria mínima. Los valores de CMI se determinaron mediante el método de microdilución en caldo en placas de microtitulación de 96 pocillos (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) según lo recomendado por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI 2015), las diluciones 100 a 0.01 µg/mL se incubaron con suspensiones microbianas ajustadas a 5 × 10⁵ UFC/mL en TSB. Se incluyeron controles de crecimiento y esterilidad para cada aislado, y el vehículo se incluyó como control negativo. Las placas de microtitulación se incubaron a 37 °C y las lecturas se realizaron después de 24 h de incubación mediante lectura visual y determinación de la densidad óptica (DO 595 nm) en un lector de microplacas iMark (BioRad, Madrid, España). El valor CMI se definió como la concentración de compuesto más baja que impidió el crecimiento celular después de una incubación.

Ensayo de inhibición de la formación de biopelículas. Se analizó el extracto vegetal diluido en serie en un rango de 100 a 0.01 µg/mL, según el valor de CMI obtenido previamente, para determinar la capacidad de los compuestos para obstruir la formación de biopelículas y también su potencial para disgregar biopelículas previamente formadas, como lo describen ^{Ulrey et al. (2014)}. La inhibición de la formación de biopelículas inducida por compuestos aislados se midió mediante el método de tinción de violeta cristal descrito por ^{Djordjevic et al. (2002)}. Posteriormente se incubaron suspensiones bacterianas (10⁶ UFC en TSB) con concentraciones crecientes del extracto (24 h, 30 ºC). Los pocillos con suspensiones bacterianas y medio TSB se ejecutaron en paralelo como controles positivos para la formación de biopelículas. Todos los pozos se lavaron con agua del grifo y las biopelículas se fijaron con metanol. La placa se tiñó con cristal violeta al 0.3 % y se leyó en un iMarkMicroplate Reader (Bio-Rad, Madrid, España) DO 595 nm.

Ensayo de la disgregación de películas formadas previamente. Después de la formación de la biopelícula (24 h, 30 °C) en una placa de microtitulación de 96 pocillos, el contenido se aspiró y los pocillos se lavaron suavemente dos veces con solución salina fisiológica estéril, se añadieron 100 mL del compuesto diluido apropiado, los pozos sin el extracto sirvieron como controles positivos. Después de una incubación de 24 h a 30 ºC, se realizó la tinción de violeta cristal descrita anteriormente. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Para analizar los resultados de la significancia estadística de las medias de la absorbancia se utilizó una prueba ANOVA y prueba post hoc de Tukey con un nivel de confianza del 95 % con Statgraphics Plus versión 8.1 (Statistical Graphics Corporation, Rockville, MD, EE. UU.).

Resultados

Las pruebas fitoquímicas del extracto de Sambucus canadensis reveló la presencia de alcaloides, flavonoides, saponinas y taninos. Las pruebas del espectro de infrarrojo (TFIR) del extracto vegetal mostró distintas frecuencias de estiramiento y flexión; las frecuencias de estiramiento del enlace O-H en 3350 cm^-1 es asociado a grupos fenólicos, al estar involucradas en enlaces por puente de hidrógeno, se produce un ensanchamiento de la banda. Las vibraciones de estiramiento del enlace C-H correspondientes a los grupos metilo y metileno aparecen en un rango 3000-2850 cm^-1 y las bandas en la región de la huella dactilar se deben a las vibraciones de flexión en 1386 cm^-1 para el metilo y 716 cm^-1 para el etilo, las vibraciones de estiramiento del enlace carbonilo, C=O aparecen en un rango 1750-1680 cm^-1 correspondiente a la presencia de flavonoides. Asimismo, en un rango 1600-1450 cm^-1 aparece un doble enlace conjugado C=C de los anillos aromáticos característico de la estructura base de los flavonoides (Figura 1). Respecto a la actividad antimicrobiana el extracto mostro actividad antimicrobiana por el método de difusión en disco con todas las cepas evaluadas, el mayor diámetro de inhibición fue de 13.5 mm frente S. aureus CECT 976, 12.5 mm en B.cereus CECT 976 y 12 mm con E. coli. Asimismo, la efectividad del extracto en las cepas bacterianas probadas se determinó midiendo la CMI₉₀. Las cepas más susceptibles fueron S. aureus CECT 976, S. enterica CECT 915, así como E. coli 47553 con valores de CMI de, 75 y 50.0 µg/mL mientras que Enterobacter sp. 37p y E. faecimum 11c fueron las bacterias más resistentes con valores mayores a 100 µg/mL (Tabla 1).

Figura 1 FTIR espectro de Sambucus canadensis en el rango de 4000 to 600 cm^-1.  

Figure 1. FTIR spectrum of Sambucus canadensis in the range of 4000 to 600 cm^-1. 

Los resultados sobre la inhibición de la formación de biopelículas mostraron que el extracto a las concentraciones de 1.0 y 0.10 µg/mL inhibió la biopelícula de S. enterica CECT 915, S. enterica CECT 4395 y S. enterica 405 con porcentajes de inhibición de 41, 50 y 47 % respectivamente (p < 0.05). Para las bacterias S. aureus CECT 976 y S. aureus CECT 4465 se logró una inhibición en la formación del biofilm del 43 y 41 % respectivamente en las concentraciones más bajas de 0.01 µg/mL, ambas cepas mostraron diferencias estadísticamente significativas respecto al control (p < 0.05). La cepa E. coli CECT 4753 en la menor concentración 0.01 se redujo hasta en un 41% la formación de biofilm siendo estadísticamente diferente respecto al control (p = 0.001) Para el caso de E. coli 47557 no se lograron resultados de inhibición significativos (p > 0.05). Para el caso de las bacterias resistentes aisladas de alimentos ecológicos la cepa E. faecimum 11c tuvo menor formación de biofilm (60 %) en la concentración más baja 0.01 µg/mL los resultados fueron estadísticamente significativos (p = 0.05). La cepa Pantoea 29j tuvo el mayor porcentaje de inhibición de formación de biofilm 35 % a una concentración de 10 µg/mL (p = 0.001). La bacteria B. cereus 277 redujo hasta en 33 y 35 % la formación de biofilm a la concentración de 1.0 y 0.01 µg/mL (p < 0.05). L. cassei 35h redujo hasta en un 27 % la formación de biofilm en las concentraciones más altas con resultados estadísticamente significativos (p < 0.05). Sin embargo, la cepa de Klebsiella terrigena 32j en la mayor concentración de 100 µg/mL tuvo un porcentaje de inhibición en la formación de biofilm de hasta 47 % (p = 0.05), y menor inhibición en las concentraciones bajas. Respecto a los resultados en la disgregación del biofilm, se puede observar que en algunas bacterias mostraron diferencias significativas en la disrupción de la biopelícula previamente formada (Figura 2). La bacteria S. enterica CECT 915 obtuvo porcentajes de disgregación de 34 % (p < 0.05) en concentraciones de 0.01 y 0.10 µg/mL. Para la cepa E. coli CECT 47557 se alcanzó hasta un 36 % de disgregación en la concentración más baja de 0.01 µg/mL siendo estadísticamente significativo respecto al control (p < 0.0001). Para el caso de las bacterias S. aureus CECT 976 y S. aureus CECT 4465 se logró una disgregación de 30 y 24 % a las concentraciones más bajas de 0.1 y 0.10 µg/mL siendo estadísticamente significativo (p < 0.05). Para el caso de las bacterias resistentes E. faecimum 11c en las concentraciones intermedias (10 a 0.1 µg/mL) se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la disgregación (p = 0.001). Por otro lado, la cepa de Pantoea 29j disgregó hasta en un 35 % en la concentración más baja de 0.01 µg/mL. (p < 0.05). Similares resultados se pueden observar para Enterobacter sp. 37p logrando una disgregación de hasta 35 % en todas las concentraciones evaluadas, incluso las diferencias significativas son más representativas en las concentraciones de 1 a 0.01 (p < 0.01). La cepa B. cereus 277 también mostró resultados positivos logrando romper la biopelícula hasta en 40% en concentraciones bajas (p = 0.05). Por otro lado, con la cepa de Klebsiella terrígena 32j y L. cassei 35h presentaron la menor disgregación en la concentración de 1.0 µg/mL (p = 0.001).

Figura 2 Resultados de la formación de biopelículas de 12 cepas aisladas de alimentos ecológicos. Se muestran las diferencias significativas respecto al control *p < 0.05 ** p < 0.001.  

Figure 2. Results of biofilms formation of 12 strains isolated from organic foods. Significant differences with respect to control p < 0.05 are shown. 

Figura 3 Resultados de la disgregación de biopelículas previamente formadas de 12 cepas aisladas de alimentos ecológicos. Se muestran las diferencias significativas respecto al control *p < 0.05 ** p < 0.001.  

Figure 3. Results of previously formed biofilms disintegration from 12 strains isolated from organic food. Significant differences with respect to control p < 0.05 are shown. 

Discusión

La alta resistencia desarrollada por las biopelículas bacterianas a los antibióticos y biocidas varía de un organismo a otro, por lo tanto, su erradicación no es fácil (^{Caraher et al., 2007}). Reducir la capacidad de que las bacterias formen biopelículas es fundamental para poder aplicar un tratamiento más eficaz (^{Dean et al., 2011}; ^{Ulrey et al., 2014}). Algunos estudios desarrollados con productos naturales han demostrado que podrían ser eficaces contra las biopelículas bacterianas (^{Alejo-Armijo et al., 2018}; Upadhyay et al., 2013; ^{Vasudevan, 2014}). A este respecto ^{Budri et al. (2015)} reportó una fuerte actividad anti-biopelícula de los aceites esenciales de Syzygium aromaticum y Cinnamomum zeylanicum. ^{Cha et al. (2005)} también mostró que los aceites esenciales de Artemisia lavandulaefolia, tienen efectos inhibidores sobre 15 cepas de bacterias anaerobias entre las que se encuentran S. aureus, Enterobacter sp. entre otras. ^{Yatsuda et al. (2005)}) encontró que los extractos de Mikania laevigata y M. glomerata inhibían significativamente la adherencia celular de S. mutans, S. sobrinus y S. cricetus. Asimismo, diversos estudios han reportado actividad antimicrobiana de Sambucus canadensis frente a distintas cepas entre las principales se encuentra E. coli y S. aureus (^{Hearst et al., 2010}; ^{Holetz et al., 2002}) lo cual coincide con lo encontrado en este estudio.

Respecto a los resultados en la formación de biopelículas y la disgregación de películas previamente formadas, se encontró inhibición significativa pues hubo reducción de 30% e incluso en la capacidad de formación de biopelículas dependiendo de la concentración probada. Para el caso de la formación de biofilm de la cepa S. enterica CECT 4465, Klebsiella terrígena 32j y L. casei 35h se presentó una dosis dependiente, induciendo una disminución de 43 a 55 % de 47 a 83 % y de 23 a 70.4 % respectivamente aumentando cuando la concentración incrementó de 0.01 a 100 µg/mL. La dosis dependiente encontrado en la formación de biofilm ha sido reportada por microorganismos que afectan los alimentos (^{Alejo-Armijo et al., 2018}; ^{Rane et al., 2014}). Por otro lado, también se encontraron resultados en los cuales a menor concentración mayor actividad antibiopelícula, en otros estudios también se han reportado efectos paradójicos; menor formación de biofilm en concentraciones más bajas ^{Rane et al. (2014)} al estudiar el efecto de loas proantocianidinas (PAC) de arándano sobre la formación de biopelículas de C. albicans encontró que las dosis altas de PAC de arándano no tuvieron un efecto significativo (P > 0,05) sobre la actividad de C. albicans pero si las dosis más bajas, también se había observado un efecto paradójico dependiente de la cepa y del fármaco (^{Melo et al., 2007}). Posteriormente, en el experimento de disgregación cuando se permitió que las bacterias se adhieran y formen biopelículas, los mejores resultados se encontraron con las bacterias S. aureus CECT 976 y S. aureus CECT 4465 que indujeron una reducción del 24.8 % y 36 % (p < 0.05) a la menor concentración 0.01 µg/mL. También se detectó una reducción significativa (p < 0.05) del 35.2 % en el biofilm preformado con E. coli 4757 a la misma concentración. Los resultados encontrados en el estudio pueden asociarse a los compuestos bioactivos de las plantas; por ejemplo, los polifenoles tienden a auto asociarse cuando aumenta la concentración (^{Pui et al., 2011}; Tarakada et al., 2004). También las estructuras externas de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas pueden ser responsables del efecto dosis-dependiente. Los metabolitos secundarios de las plantas tienen diversas propiedades biológicas tales como actividad antioxidante, antimicrobiano, modulación de enzimas, entre otras (Kurmukov et al., 2013; ^{Skogman et al., 2012}). De acuerdo con ^{Rojas et al. (2016)} algunas plantas poseen alcaloides como los indólicos y los oxidoles a los cuales se les puede asociar la actividad de formación y disgregación debido a que aumentan la actividad fagocítica de neutrófilos, macrófagos, granulocitos como defensa al huésped. ^{Lu et al. (2020)} indica que compuestos como lactonas y flavonoides presentes en algunas plantas, tienen efectos directos sobre genes y proteínas encargadas de la comunicación celular de las bacterias. En este sentido, el extracto de Sambucus canadensis presenta altas cantidades de alcaloides, así como flavonoides, saponinas y terpenos, por tanto, los resultados de este trabajo pueden deberse a estos compuestos los cuales se han reportado que inhiben la formación de biopelículas y dispersan las biopelículas bacterianas. De acuerdo con ^{Dwivedi et al. (2016)} y ^{Teanpaisan et al. (2017)} la presencia de alcaloides y flavonoides en extractos vegetales han mostrado una actividad de inhibición de biopelículas. Asimismo, se ha reportado que la sinergia de los compuestos que presentan los extractos crudos podría presentar mejores efectos antimicrobianos y antibiopelícula que los componentes individuales (^{Mehmood y Murtaza, 2018}). Los resultados de este estudio coinciden con lo reportado por Adnad et al. (2020) mostrando que las plantas pueden emplearse en la industria alimentaria como antibacterianos por el efecto que muestran frente a bacterias patógenas.

Conclusión

En este estudio se mostró que el extracto vegetal Sambucus canadensis presenta importante actividad antimicrobiana y anti biopelícula frente a bacterias patógenas. Estos resultados se asocian a los componentes de la planta, debido al aumento de la resistencia microbiana a las biopelículas bacterianas, los extractos vegetales ofrecen grandes oportunidades para desarrollar nuevos productos eficaces e inocuos como una alternativa potencial para combatir bacterias transmitidas en los alimentos.